Metode za određivanje mikotoksina. Laboratorijske metode za dijagnozu mikotoksikoza. Mikotoksini i metode za njihovo određivanje

Nakon rođenja štenaca, počinje odgovoran period za kuju i njene vlasnike, kada treba voditi računa ne samo o ishrani i zdravlju kuje, već i o novorođenčadi. Nakon rođenja štenaca, prvih dan-dva kuja može imati loš apetit, probavne smetnje, posebno ako je jela puno poroda.

Zapamtite da tokom ovog perioda ne biste trebali pribjegavati antibioticima - to će negativno utjecati na zdravlje beba. Pokušajte da se snađete sa sigurnijim lekovima (kao što su biljke, probiotici, ispiranje želuca, Aktivni ugljen, i bolji lignitin). Vrlo dobri rezultati u ovom slučaju se postižu upotrebom apsolutno bezopasnih homeopatskih lijekova firme "Heel", i nije potrebno tražiti veterinarske, "ljudske" ne rade ništa lošije. Probajte jednu ili dvije potkožne injekcije Echinacea compositum, Nux vomica, Berebe-ris-hommacord. Dobri rezultati se postižu upotrebom lijeka u tabletama iste kompanije Diar-heel. Lijek se daje 3 puta dnevno po 1 tabletu. Rezultati su bolji ako se prethodno rastvori u 1,5 kašike proključale vode i dobro promeša.

U prva tri dana nakon porođaja treba paziti na hranjenje kako se ne bi pogoršao mogući poremećaj. Strani autori u ovom periodu predlažu da se kuji daju kuvani mali pilići, samleveni zajedno sa kostima i pomešani sa kuvanim pirinčem.

Već nakon prvih dana nakon porođaja, kuji se osjetno poboljšava apetit, i to je sasvim prirodno - potrebe njenog tijela se značajno povećavaju. Prvo se počinje aktivno proizvoditi kolostrum, a zatim mlijeko. Količina i kvalitet mlijeka u velikoj mjeri zavise ne samo od individualnih karakteristika kuje, već i od njenog hranjenja.

U prvoj sedmici količina hrane prelazi normalna ishrana 1,5 puta. Ali u tom periodu kuji ne treba davati previše mesa, kako ne bi izazvala eklampsiju. Kao proteinsku komponentu u ovom trenutku možete dati ribu ili svježi sir. Hranite kuju treba često (svakih 4-5 sati), u malim porcijama. Nakon što se normalna funkcija želuca vrati, potrebno je nastaviti davanje mineralnih dodataka i sredstava za jačanje dlake.

• meso, riba i iznutrice - 45%,
• žitarice - 30%,
• mlijeko i mliječni proizvodi - 10%,
• povrće - 15%.

Da bi kuja u laktaciji imala više mlijeka, u njenu ishranu treba uključiti namirnice koje pospješuju laktaciju: sirovu šargarepu, meso, ribu, bujon, zobene pahuljice, itd. Što je češće moguće, ponuditi kuji da pije: mlijeko (ako je ne izaziva smetnje), čaj sa mlekom, slaba kafa sa mlekom. Kao sredstvo za povećanje količine mlijeka možete isprobati sljedeće:

• izvarak od origana;
• izvarak od matičnjaka: jednu kašičicu trave preliti sa dve šolje ključale vode, ostaviti da prokuha, dodati šećer;
• dve kašičice čaja staviti u termosicu, preliti sa dve šolje ključalog mleka, ostaviti da odstoji 3-4 sata, zatim dodati šećer i ohladiti;
• odvar od anisa.

Apilac, koji mnogi vlasnici daju kujama za povećanje laktacije, u mojoj praksi nije dao željene rezultate, iako sam ga pokušavao davati različitim kujama.

Ako pas odlučno odbija piti, možete ga, naravno, pokušati natjerati da pije, ali je bolje da ga prvo pokušate “prevariti” tako što ćete u još uvijek prilično toplo piće staviti mali komadić putera. Vrlo je moguće da će je zavesti miris putera.

Kako bi se spriječila iscrpljenost kuje, njena ishrana u ovom periodu treba da bude potpuna i da hrana sadrži dovoljnu količinu kalorija, proteina, vitamina i minerala.

Međutim, tokom cijelog perioda laktacije količina hrane nije konstantna. Kao što je već spomenuto, u prvoj sedmici ishranu treba povećati za 1,5 puta. Kako se količina mlijeka kod kuje povećava, tako i obrok treba povećati: u drugoj sedmici obrok treba udvostručiti, a od treće sedmice do kraja laktacije utrostručiti: Poređenje se vrši sa ishranom pas u svom normalnom stanju. Količina hrane potrebna kuji zavisi od veličine njenog legla. Četiri šteneta u leglu zahtijevaju 2 puta povećanje ishrane, a osam štenaca najmanje tri puta.

Kuja obično hrani štence 4-6 sedmica. Količina mlijeka koju proizvodi kuja nije konstantna tokom laktacije. Do 20-25 dana količina mlijeka se povećava, a zatim smanjuje. Zapadni stručnjaci nude vrlo jednostavan način izračunavanja kalorijskog sadržaja hrane u ovom periodu. Ova metoda se sastoji u vaganju cijelog legla u dobi od 3-4 dana, dodavanju 250 cal dodatne energije u ishranu kuje za svaki kilogram štenaca i, u skladu s tim, povećanju količine i kalorijskog sadržaja hrane.

Trajanje laktacije ovisi o individualnim karakteristikama i hranjenju psa. U svakom slučaju, naravno, treba uzeti u obzir individualne karakteristike psa. Ima kuja koje štenci bukvalno “isišu”, dugo proizvode mlijeko, u velikim količinama, a štence hrane i do dva mjeseca. Naravno, njihova ishrana treba da bude veća i potpunija od one kod kuja, koje imaju malo mleka čak i na samom „vrhu proizvodnje mleka“, koji se poklapa sa 14-17. danom laktacije, a čija vlasnica jednostavno sanja da će hraniti deca do tri nedelje. Na proizvodnju mlijeka kod kuja u velikoj mjeri utiče potpuna proteinska prehrana bogata esencijalnim aminokiselinama. Nedostatak aminokiselina utječe prvenstveno na kvalitet mlijeka, kao i na njegovu količinu, a to uzrokuje smanjenje stope rasta štenaca i usporava njihov razvoj.

Vitamini takođe igraju važnu ulogu u ishrani kuja u laktaciji. Potrebni su ne samo za same kučke, već i za razvoj štenaca. Potrebno je osigurati da kuja dobije potrebnu količinu vitamina tokom cijelog perioda laktacije. Na primjer, sadržaj vitamina A u mlijeku, koji je toliko neophodan za rast štenaca, zavisi samo od njegovog prisustva u majčinoj hrani*. Stoga bi vlasnik trebao pratiti stalnu prisutnost ovog vitamina u prehrani dojilje. To se odnosi i na vitamin D i vitamine B, koji se u velikim količinama izlučuju putem mlijeka za pse.

Kuji je potrebna ista količina dodatne energije za proizvodnju mlijeka koju sadrži izlučeno mlijeko. Zbog toga energetsku vrijednost Ishrana će prvenstveno zavisiti od količine mleka kod kuje. Sadržaj kalorija u hrani također ovisi o periodu laktacije. Poznato je da u prvoj i drugoj sedmici laktacije kuja daje manje mlijeka nego u trećoj i četvrtoj. Stoga, ishranu treba sastaviti tako da se u prvoj polovini laktacije energetski intenzitet hrane poveća za 2 puta, u drugoj - za 3 puta u odnosu na potrebe kuje u normalnom stanju. U praksi to izgleda ovako: za stvaranje mlijeka u prvoj polovini laktacije, kuji u laktaciji tjelesne težine od 10 kg potrebna je dodatna prehrana s kalorijskim udjelom od 750 kcal pored glavne, a u naredne dvije sedmice - 1500 kcal dnevno.

Ženske mliječne žlijezde odmah nakon porođaja luče kolostrum. Potrebno je osigurati da svako novorođeno štene dobije kolostrum koji sadrži specifična antitijela.

Od velikog značaja za stvaranje mlijeka su minerali, čiji nedostatak uzrokuje razne vrste osteodistrofičnih bolesti ne samo kod kuja u laktaciji, već i kod potomaka. Istovremeno, kičma ženki u laktaciji iscrpljuje se mineralima i postaje porozna, krhka, pojavljuje se osteoporoza i rahitis kod novorođenih štenaca. Važno je spriječiti nakupljanje mineralnih rezervi tokom trudnoće, a kod mladih kuja - u periodu rasta i pripreme za prvu laktaciju. Kuje koje doje trebaju i više kuhinjske soli u odnosu na ne-dojenje.

Kvalitativni sastav i dnevni energetski intenzitet ishrane kuja u laktaciji težine 5 kg u prvoj-drugoj i trećoj-četvrtoj nedelji laktacije

Kvalitativni sastav i dnevni energetski intenzitet ishrane kuja u laktaciji težine 15 kg u prvoj-drugoj i trećoj-četvrtoj nedelji laktacije

Kvalitativni sastav i dnevni energetski intenzitet ishrane kuja u laktaciji težine 25 kg u prvoj-drugoj i trećoj-četvrtoj nedelji laktacije

Metode za određivanje mikotoksina

Savremene metode za otkrivanje i određivanje sadržaja mikotoksina u hrani i hrani za životinje uključuju metode skrininga, kvantitativne, analitičke i biološke metode. Metodologija mikotoksina se vrlo brzo razvija. Broj razvijenih metoda i raznih modifikacija već je dostigao nekoliko stotina i nastavlja rasti.

Metode skrininga, koje karakteriše jednostavnost i brzina analize, omogućavaju vam da brzo i pouzdano „prosejate“ nekontaminirane uzorke. Ovo uključuje najčešće korištene metode kao što je test na mini koloni za aflatoksine, ohratoksin A i zearalenon; TLC metode za istovremeno određivanje do 30 različitih mikotoksina; fluorescentna metoda za otkrivanje kontaminacije aflatoksinima itd.

Kvantitativne analitičke metode za određivanje mikotoksina mogu se podijeliti na hemijske, radioimunohemijske i enzimske imunoeseje. Hemijske metode su trenutno najčešće i uključuju uzastopne faze izolacije i odgovarajuće kvantifikacije mikotoksina. Faza izolacije sastoji se od dvije faze: ekstrakcija - odvajanje mikotoksina od supstrata i prečišćavanje - odvajanje mikotoksina od spojeva sličnih fizičkih i hemijskih karakteristika. Konačno odvajanje mikotoksina se vrši jednodimenzionalnom ili dvodimenzionalnom tankoslojnom hromatografijom (TLC) na pločama silika gela u različitim sistemima rastvarača, gasnom i gasno-tečnom hromatografijom, tečnom hromatografijom visokih performansi i masenom spektrometrijom. Kvantitativno određivanje mikotoksina se obično vrši direktnim poređenjem intenziteta fluorescencije na TLC u ultraljubičastom svjetlu sa standardima poznate koncentracije, kako vizualno tako i denzitometrijski. Da bi se poboljšala pouzdanost metoda, koriste se različiti potvrdni testovi, zasnovani na proizvodnji derivata mikotoksina sa drugim hromatografskim, kolorometrijskim ili fluorimetrijskim karakteristikama.

Posljednje godine karakterizira povećana pažnja na razvoj visoko osjetljivih i visoko specifičnih radioimunohemijskih i enzimskih imunotestnih metoda za detekciju, identifikaciju i kvantifikaciju mikotoksina. Ove metode se zasnivaju na dobijanju antiseruma za konjugante mikotoksina sa albuminom goveđeg seruma. Njihova prednost je izuzetna osjetljivost, koja omogućava detekciju pikograma mikotoksina i razvoj u pravcu automatizacije procesa određivanja. Biološke metode, koje obično nisu baš specifične i osjetljive, koriste se uglavnom za detekciju mikotoksina za koje nisu dostupne hemijske metode analize ili kao potvrdni testovi. Razni mikroorganizmi, pileći embriji, mnoge laboratorijske životinje, kulture ćelija i tkiva služe kao objekti za ispitivanje.

Za određivanje sadržaja mikotoksina u sastavu prehrambenih proizvoda priprema se uzorka metodom ekstrakcije čvrste faze na koncentracionim patronama „Diapak“ (str. 3.2.3). Odvajanje, identifikacija i kvantitativno određivanje mikotoksina u pripremljenim uzorcima vrši se tečnom hromatografijom visokih performansi na mikrokolumnom hromatografu serije Milihrom-5 u modularnom dizajnu (Sl. 12).

Rice. 12. Mikrokolona hromatograf

U radu se razmatra verzija HPLC reverzne faze za određivanje patulina. Detekcija se vrši na talasnoj dužini od 276 nm. Za preciznu identifikaciju patulina koristi se i viševalna detekcija, što omogućava korištenje spektralnih odnosa kao dodatnog identifikacionog parametra. Odvajanje se vrši u načinu gradijenta elucije, što poboljšava rezoluciju i osjetljivost analize.

Rice. 13. Tečni hromatograf:

1 - pumpa; 2 – jedinica za ubrizgavanje uzorka; 3 – hromatografska kolona; 4 - detektor;
5 - dren za eluat ili kolektor za frakcije; 6 - matičar (registrator,
integrator ili personalni računar)

6
4

Analiza uzorka pomoću tečnog hromatografa (slika 13) izvodi se na sledeći način. Određena zapremina rastvora analiziranog uzorka se unosi u gornji deo hromatografske kolone (3) pomoću jedinice za ubrizgavanje uzorka (2). Pomoću pumpe (1) analizirana smjesa se pumpa sa eluentom kroz hromatografsku kolonu (3), u kojoj se analizirana smjesa razdvaja u zasebne frakcije (komponente). Detektor (4) analizira eluat koji teče iz kolone, koji sadrži odvojene komponente, čije očitavanje snima registrator (6).

1. 
   Metodološke osnove HPLC

Da bi se razumjela suština HPLC metode koja se koristi za određivanje patulina, potrebno je proučiti neke metodoloških aspekata u osnovi toga.

Eluotropna serija. Moć eluiranja eluenta je sposobnost eluenta (rastvarača ili mješavine rastvarača) da istisne adsorbat sa površine adsorbenta. U ovom slučaju, što se molekuli eluenta jače adsorbiraju na aktivnim mjestima sorbenta, to je veća njegova moć eluiranja. Rastvarači raspoređeni u nizu povećavajući snagu eluiranja formiraju eluotropni niz.

Kao eluenti za hromatografiju reverzne faze koriste se mješavine otapala koje sadrže vodu i organske spojeve koji modificiraju eluirajuću snagu - n-alkoholi, acetonitril, tetrahidrofuran i drugi koji stvaraju prave otopine s vodom. U hromatografiji normalne faze kao eluens koriste se polarni modifikatori - linearni i ciklični ugljovodonici (heksan, cikloheksan, heptan, itd.).

Detektori za tečne hromatografe. Trenutno je razvijeno više od 20 HPLC detektora. Pet je najčešće korištenih, od kojih su tri optička, a dva elektrohemijska. Ovih pet detektora vam omogućavaju analizu svih klasa organskih i neorganskih supstanci.

Optički detektori uključuju spektrofotometrijski detektor (ultraljubičasti (UV), koji radi u opsegu talasnih dužina
200–360 nm i vidljivi sa opsegom talasnih dužina od 360–780 nm), fluorometrijski detektori i detektori indeksa prelamanja; do elektrohemijskih - voltametrijskih i konduktometrijskih detektora. Od posebnog značaja je maseni spektrometrijski detektor, koji ima jedinstven informativni sadržaj, jer omogućava identifikaciju hromatografski odvojenih komponenti korišćenjem baza podataka masenih spektra supstanci.

Spektrofotometrijski detektor je najčešći HPLC detektor. Princip njegovog rada zasniva se na dobro poznatom Bouguer-Lambert-Beer-ovom zakonu apsorpcije svjetlosti. Spektrofotometrijski detektor bilježi spektre selektivne apsorpcije apsorpcije zračenja tvari. Spektri apsorpcije zavise od strukture ispitivane supstance. Ovo vam omogućava da identifikujete supstancu po njenom spektru, imajući biblioteku spektra ili standarda. Prema Bouguer-Lambert-Beerovom zakonu, intenzitet spektralnih traka ovisi o koncentraciji tvari koja je osnova kvantitativna analiza, tj. određivanje koncentracije supstance.

Neka monohromatska svetlost iz izvora sa intenzitetom I 0 pada na jarak sa dužinom l (optička staza). Kiveta se puni rastvorom supstance sa koncentracijom OD. Supstanca je sposobna apsorbirati monokromatsko zračenje. Mjera sposobnosti apsorpcije datog monokromatskog zračenja je vrijednost ε je molarni koeficijent apsorpcije, ili koeficijent ekstinkcije. Oslabljeni svjetlosni snop izlazi iz kivete s intenzitetom I. Prema zakonu apsorpcije svjetlosti na talasnoj dužini λ= konst

I= I 0 ∙10 -ε Cl , (7)

gdje I je intenzitet svjetlosnog toka nakon prolaska kroz kivetu;
I 0 je intenzitet upadnog svjetlosnog toka; ε je koeficijent ekstinkcije; OD je molarna koncentracija supstance u kiveti; l je dužina kivete.

Stav I to I 0, izraženo u procentima, naziva se prijenos T, i vrijednost A=lg(I 0 / I) – optička gustina.

A=lg(I 0 /I)= ε S∙l. (8)

Optička gustina supstance je direktno proporcionalna koncentraciji analita. U spektrofotometrijskim detektorima, analitička veličina je optička gustoća ALI. Formula (8) služi kao osnova za kvantitativnu analizu pri korištenju spektrofotometrijskog detektora, budući da je optička gustina ALI supstanca je direktno proporcionalna visini ili površini hromatografskog pika.

Ovisnost optičke gustoće ALI od talasne dužine svetlosti koja pada na kivetu sa supstancom u opsegu talasnih dužina od 190 do 360 nm naziva se ultraljubičasti apsorpcioni spektar (slika 14).

200 230 260 290 320 350 λ , nm

ALI, f.r.p.
Rice. četrnaest. UV spektar apsorpcija vodenog rastvora
supstance X

3.2.3. Priprema uzorka

Svaka tvar ima valnu dužinu maksimalne apsorpcije
(λ , nm). Kada se koristi ova talasna dužina, detektor ima najniži prag za detekciju supstance.

Koristeći spektrofotometrijski detektor (SPD), detektuje se veliki broj supstanci različitih klasa koje apsorbuju ultraljubičasto svetlo.

Upotreba spektrofotometrijskog detektora u hromatografiji uvelike olakšava identifikaciju. Detektor više talasnih dužina u kombinaciji sa softverom omogućava vam da dobijete hromatogram na nekoliko talasnih dužina istovremeno i izračunate dodatni parametar za identifikaciju komponenti - spektralnostav (Q) je odnos visina hromatografskog pika na različitim talasnim dužinama

gdje ALI 1 i ALI 2 - koeficijenti optičke gustine na talasnim dužinama 1 i 2. Vrijednost Q za svaku supstancu je konstantna karakteristika i ne zavisi od njene koncentracije. Točnost spektralnih omjera ovisi o vrijednostima optičke gustoće tvari i dizajnu detektora.

Priprema uzoraka metodom ekstrakcije čvrste faze na patronama za koncentriranje štedi vrijeme i troškovi rada. Ekstrakcija u čvrstoj fazi omogućava vam da koncentrirate uzorak i očistite ga od pratećih nečistoća. Složena shema ekstrakcije čvrste faze omogućava uzastopnu upotrebu dva uloška:

– univerzalni uložak za koncentriranje „DIAPAK P-Z” – kartridž za višekratnu upotrebu (do 50 uzoraka) sa setom gornjih i donjih filtera (10 komada);

– univerzalni uložak za fino čišćenje “DIAPAK S” – kartridž za jednokratnu upotrebu.

Za priprema patrona za koncentriranje morate izvršiti sljedeće operacije.

Za priprema patrone za koncentriranje "DIAPAK P-Z":

- pumpa 10 ml mješavine vode-acetonitril (58:42) kroz uložak;

– neposredno prije pripreme uzorka, pumpajte 10 ml destilovane vode kroz uložak.

Za priprema patrone za koncentrovanje "DIAPAK S":

- pumpajte 5 ml benzena kroz uložak i začepite uložak na oba kraja.

Priprema prehrambenog proizvoda za koncentraciju

Uzorak težine 10,0 g stavite u staklenu čašu, pomiješajte s malom količinom destilovane vode i kvantitativno prenesite u odmjernu tikvicu od 50 ml. Dodati 6,0 ml otopine Carrez I i otopine Carrez II u tikvicu. Destilovanom vodom dovedite sadržaj tikvice do oznake, dobro promiješajte i filtrirajte u mjerni cilindar kroz papirni naborani filter. Izmjerite volumen bistrog filtrata P.

Prilikom pripreme pročišćenih sokova i napitaka, uzorak se filtrira kroz gusti papirni filter dok se ne dobije 20 ml bistrog filtrata P.

Koncentracija uzorka na ulošku "DIAPAK P-Z"

Nanesite cijelu zapreminu filtrata P na prethodno pripremljenu kartušu brzinom od 1-2 kapi u sekundi.

Isperite uložak sa 5 ml bidestilovane vode, odbacujući sva pranja.

Eluirati patulin iz uloška od 10 ml etil acetata u tikvicu ili volumetrijsku epruvetu sa čepom koja sadrži 5 ml
1,5% vodeni rastvor natrijum karbonata, zatvorite, snažno promešajte i ostavite da se ljušti.

Sastavite kolonu za sušenje punjenjem kućišta filtera sa približno 2 g bezvodnog natrijum sulfata, kompaktirajte sredstvo za sušenje udaranjem po zidu kolone i fiksirajte ga pamučnim štapićem.

Dekantiramo gornji sloj etil acetata pipetom, filtriramo kroz kolonu za sušenje, sakupljajući filtrat u tikvicu u obliku srca od 50 ml; dodatno ekstrakt vodeni rastvor natrijum karbonata, prvo sa 10 ml, a zatim sa 5 ml etil acetata i, nakon odvajanja, sukcesivno filtrirati dekantirane zapremine etil acetata kroz kolonu za sušenje u istu tikvicu.

Etil acetat ispariti u vakuumu na temperaturi ne većoj od 40°C do zapremine od oko 0,5 ml (ne isparivati ​​do suva!), dodati 2,5 ml benzena (paziti na zapreminski odnos 1:5).

Čišćenje uzorka na ulošku "DIAPAK S"

Skinite poklopce sa pripremljenog uloška i propuštajte otopinu uzorka benzen-etil acetata brzinom od 1-2 kapi u sekundi. Operite bocu sa još 0,5-1,0 ml benzen-etil acetata (85:15) i nanesite na uložak, odbacujući ispiranje.

Eluirati patulin iz uloška od 6 ml sa benzen:etil acetatom (7:3), sakupljajući eluat u tikvicu za uklanjanje jezgra.

Ispariti eluat do suva u kupatilu sa suvim vazduhom na temperaturi koja ne prelazi 40°C.

Odmah! Nakon isparavanja, ponovo rastvorite uzorak u 0,2–0,25 ml eluenta A (odeljak 3.2.4.2), ohlađenog na 5–8°C.

3.2.4. Radni nalog

Cilj– određivanje sadržaja mikotoksina patulina u sastavu prehrambenih proizvoda tečnom hromatografijom visokih performansi na mikrokolonskom hromatografu serije Milihrom-5.

3.2.4.1. Tehnika mjerenja

Mjerenja uključuju sljedeće glavne korake:

- kalibracija hromatografa prema rastvorima sa poznatom masenom koncentracijom patulina;

- priprema uzorka hrane metodom ekstrakcije u čvrstoj fazi prema st. 3.2.3;

– analiza ekstrakta HPLC sa registracijom signala UV detektorom;

– identifikacija patulina po retencijskim parametrima i spektralnim odnosima;

– proračun masene koncentracije patulina u uzorku na osnovu registrovanog analitičkog signala (visine vrha) i kalibracionog grafikona;

- izračunavanje masenog udjela patulina u sastavu prehrambenog proizvoda.

Instrumenti, reagensi i materijali, potrebno za obavljanje posla:

– hromatograf serije Milichrome-5 ili bilo koji drugi HPLC hromatograf sa WinXrom ili Multichrome softverom;

– HPLC hromatografska kolona: Diasfer–110–S10SN (5 µm, 2×80 mm, TU 4215–001–05451931–94);

– dozator varijabilne zapremine za 1-100 µl;

– dozator varijabilne zapremine za 100–1000 µl;

- konusna tikvica sa dobro mljevenim tankim presjekom kapaciteta do 10 ml;

– membranski filteri;

- set standardnih otopina patulina sa koncentracijom od 1, 2, 5 i 10 mg/l;

- fosforna kiselina 85%;

– acetonitril za tečnu hromatografiju (specifikacija posebne čistoće TU 6–09–3513–86, UV apsorpcija do 200 nm);

– heksan, hemijski čist (rektifikovan);

– trifluorosirćetna kiselina;

– Carrez rastvor I – rastvoriti 15,0 g kalijum heksacijanoferata II u 100 ml vode.

- Carrez II rastvor - rastvoriti 30,0 g cink acetata u 100 ml vode;

- eluenti A, B i C.

Priprema eluenata

Eluent A. 20 ml acetonitrila i 0,5 ml 10% rastvora trifluorosirćetne kiseline dodaju se u volumetrijsku tikvicu sa dobro brušenim staklenim presekom kapaciteta 100 ml. Otopina se dobro promeša i dovede do oznake destilovanom vodom, prethodno filtriranom kroz filter od najlonske membrane (0,2 µm). Zatim se eluent degazira evakuacijom u trajanju od 1 minute uz razrjeđivanje od 1 kg∙s/cm 2 .

Eluenti B i C pripremljen na isti način kao eluent A, uzima se samo 10, odnosno 0 ml acetonitrila na 100 ml rastvora.

3.2.4.2. Podešavanje načina hromatografskog razdvajanja
i registraciju rezultata

Za izvođenje mjerenja potrebno je podesiti režime rada hromatografa.

Načini doziranja:

– regeneracija – 300 µl;

– zapremina uzorka – 5 µl;

– potrošnja eluenta – 150 µl/min;

– načini eluiranja gradijenta: 800 µl – eluent A,
500 µl - eluent B, 300 µl - eluent C;

- temperatura termostata - 35 0 S.

Načini detekcije:

– broj talasnih dužina – 3;

– talasne dužine – 250, 276, 290 nm;

– vrijeme mjerenja – 0,04 s.

Kondicioniranje hromatografskog sistema se vrši 30 minuta pre merenja izvođenjem „prazne“ analize, u kojoj se standardna smeša koja sadrži patulin zamenjuje sa 5–10 μl eluenta, a zatim se odvaja standardna mešavina mikotoksina.

Vježba 1. Proučiti način pripreme uzoraka prehrambenih proizvoda za određivanje sadržaja patulina. Pripremiti uzorke u skladu sa stavom 3.2.3.

Zadatak 2. Kalibrirajte hromatograf. Kromatograf se kalibrira uzastopnim uvođenjem standardnih otopina patulina sa koncentracijama od 1, 2, 5 i 10 mg/l.

Pod vodstvom nastavnika, predlaže se unošenje parametara hromatografskog odvajanja (tačka 3.2.4.3) sa PC tastature u program (WinXrom) i pokretanje 2-4 hromatografske analize u automatskom režimu. Rezultati su predstavljeni u obliku tabele. 6.

T a b l e 6

Na osnovu dobijenih hromatografskih profila izgraditi kalibracioni grafikon (koncentracija je iscrtana duž ordinatne ose - mg/l, duž ose apscise je optička gustina mikotoksina ALI– s.o.p.).

Zadatak 3. Identifikujte patulin u test uzorku prehrambenog proizvoda i odredite njegovu koncentraciju.

Pod vodstvom nastavnika pokrenite mjerenje uzorka pripremljenog prehrambenog proizvoda u automatskom režimu
(sa parametrima hromatografskog odvajanja odabranim u zadatku 2). Po završetku mjerenja, identifikujte mikotoksin patulina prema standardnoj datoteci (“StandardDD-MM-YY.001”) dobijenoj u zadatku 2. Koristeći kalibracioni grafikon izgrađen u zadatku 2, odredite koncentraciju patulina u uzorku hrane.

Zapišite rezultate u tabelu. 7.

Tabela 7

Masena koncentracija patulina u uzorku hrane izračunava se po formuli

gdje OD– masena koncentracija patulina u uzorku, mg/l (izračunata prema kalibracionoj zavisnosti, na osnovu visine analitičkog pika); V str je zapremina uzorka, ml; R - stepen ekstrakcije mikotoksina u fazi pripreme uzorka (jednak 60%); M pr je masa uzorka prehrambenog proizvoda koji se koristi za prečišćavanje i naknadno hromatografsko određivanje, g.

Rezultat mjerenja masenog udjela mikotoksina u objektu koji se utvrđuje prikazan je u sljedećem obliku: X±  mg/kg; at R\u003d 0,95 i zabilježeno u protokolu (Dodatak 1), gdje X i , je masena koncentracija patulina u uzorku, mg/kg; R- vjerovatnoća;  je granica apsolutne greške, izračunata po formuli

Nakon dobijanja rezultata, potrebno je procijeniti vrijednosti standarda za operativnu kontrolu konvergencije, koji su dati u relevantnim GOST-ovima za metode kontrole (analize).

Donesite zaključak o usklađenosti (ili neusklađenosti) sadržaja patulina u proučavanom prehrambenom proizvodu sa dozvoljenim nivoima utvrđenim SanPiN 2.3.2.1078–01.

Pitanja za samokontrolu

1. Koji principi su u osnovi klasifikacije hromatografskih metoda analize?

2. Šta je suština hromatografskog odvajanja? Kako se provodi kvalitativna identifikacija i kvantitativna analiza?

3. Koji prehrambeni proizvodi sadrže mikotoksine? Koji se mikotoksini određuju u sastavu prehrambenih proizvoda u skladu sa zahtjevima SanPiN-a?

4. Koja se hromatografska metoda koristi za određivanje sadržaja mikotoksina u prehrambenim proizvodima?

5. Na čemu se zasniva spektrofotometrijska detekcija? Šta su spektralni odnosi i za šta se koriste?

6. Kako se priprema uzorak hrane za određivanje sadržaja patulina pomoću HPLC?

7. Koje operacije su uključene u HPLC metodu za određivanje patulina?

8. Šta je eluent i gradijent eluiranja? Koji se eluenti koriste za određivanje patulina pomoću HPLC?

9. Kako se patulin identifikuje i kvantificira?

10. Kako se osigurava tačnost HPLC određivanja patulina?

Metode za određivanje mikotoksina

Savremene metode za otkrivanje i određivanje sadržaja mikotoksina u hrani i hrani za životinje uključuju metode skrininga, kvantitativne analitičke i biološke metode.

Metode skrininga su brzi i praktični za serijsku analizu, omogućavaju vam da brzo i pouzdano odvojite kontaminirane i nekontaminirane uzorke. Metode skrininga uključuju tankoslojnu hromatografiju (TLC metode), fluorescentnu metodu za određivanje zrna kontaminiranog aflatoksinima.

Kvantitativne analitičke metode za određivanje mikotoksina predstavljene su hemijskim, radioimunološkim i enzimskim imunološkim metodama. Danas su najčešće hemijske metode koje obuhvataju dve faze: fazu izolacije i fazu kvantitativnog određivanja mikotoksina. Faza izolacije uključuje ekstrakciju (odvajanje mikotoksina od supstrata) i prečišćavanje (odvajanje mikotoksina od spojeva sličnih fizičkih i hemijskih karakteristika). Konačno odvajanje i kvantifikacija mikotoksina se provodi različitim kromatografskim metodama. Univerzalna metoda za određivanje svih vrsta mikotoksina je tankoslojna hromatografija (TLC).

Prilikom uzorkovanja iz serije proizvoda, glavni cilj je dobiti prosječan uzorak ili prosječan uzorak koji je reprezentativan za cijelu seriju u smislu koncentracije mikotoksina (uzeti uzorci trebaju karakterizirati kvalitetu cijele serije). Ispunjavanje ovog zadatka zavisi od prirode i distribucije mikotoksina, karakteristika proizvoda (sirov, prerađen, tekuć, tečan, pastozan, itd.), načina pripreme uzorka. Na primjer, kontaminacija kikirikija aflatoksinima ima izražen heterogeni karakter: u pojedinim zrnima kikirikija njihov sadržaj može varirati od hiljaditih dijelova miligrama do desetina ili više miligrama po 1 kg, odnosno razlikovati se za 5-6 redova veličine. Iz tog razloga, doprinos greške uzorkovanja ukupnoj grešci analize u određivanju aflatoksina u kikirikiju je glavni iu nekim slučajevima može biti i više od 90%.

Sa stanovišta ujednačenosti kontaminacije mikotoksinima, svi proizvodi se mogu podeliti u dve grupe: 1) proizvodi sa visokim stepenom heterogenosti (kikiriki oljušteni i neoljušteni, uljarica, cela ili krupna žitarica, orašasti plodovi); 2) proizvodi sa ujednačenim obrascima kontaminacije (tečnosti: mleko, biljna ulja, sokovi, pire; brašno, mleveno brašno).

Za reprezentativan prosečan uzorak proizvodi l-th grupe, veličina početnog uzorka treba da bude što veća (najmanje 2 kg), dok prosječan laboratorijski uzorak treba izolovati od prizemnog (homogeniziranog) prosječnog uzorka.

Za homogene proizvode 2. grupe (džem, marmelada, voćni sokovi u malim limenim posudama, kondenzovano mleko, suvi mlečni proizvodi i dr.) uzorke treba uzeti u broju pakovanja koji odgovara veličini prosečnog uzorka (100 -200 g), pod uslovom da proizvod dolazi iz iste serije.

Hemijske metode za detekciju i identifikaciju pojedinačnih aflatoksina zasnivaju se na njihovoj specifičnoj fluorescenciji u UV svjetlu (oko 365 nm), na razlikama u pokretljivosti u tankoslojnoj hromatografiji, na specifičnosti njihove apsorpcije i spektra fluorescencije.

Za razliku od aflatoksina, trihoteceni nemaju apsorpciju ili fluorescenciju u vidljivom dijelu spektra, što otežava njihovu detekciju tankoslojnom hromatografijom. Istovremeno, trihoteceni se mogu detektovati TLC metodom zasnovanom na tretmanu TLC ploča specijalnim reagensima koji formiraju obojene ili fluorescentne derivate sa trihotecenima. Na primjer, T-2 toksin prilikom obrade ploča; koncentrovana sumporna kiselina formira mrlje plave fluorescencije;) u UV svjetlu.

Arbitražne metode za kvantifikaciju mikotoksina su sljedeće:

‣‣‣ gasno-tečna hromatografija (za T-2 toksin);

‣‣‣ tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) pomoću UV fotometrijskog detektora (za deoksinivalenol i patulin);

‣‣‣ HPLC pomoću fluorescentnog detektora (za aflatoksine; i zearalenon).

Na sl. 2 prikazuje uređaj modernog tečnog hromatografa u najjednostavnijem dizajnu.

Mobilna faza se pumpa iz rezervoara 1 kroz ulazni filter 9 visokog pritiska 2 u sistem za unos uzorka 3 - ručni injektor ili autosampler, uzorak se takođe ubrizgava tamo. Zatim, kroz filter 8, uzorak sa strujom mobilne faze kroz pretkolonu ulazi u kolonu za separaciju 4. Zatim tok mobilne faze napušta kolonu i sadrži komponente mješavine koje treba odvojiti (eluirati) ulazi u detektor 5 i uklanja se u prelivni rezervoar 7. Kada eluat protiče kroz mernu petlju detektora, hromatogram se registruje i podaci se prenose u rekorder 6 ili u kompjuter.

Uređaj za tečnu hromatografiju (izokratski sistem):

1 - kapacitet; 2 - sistem visokog pritiska; 3 - ručni injektor ili autosampler; 4 - odvojni stub; 5 - detektor; b - matičar ili kompjuter; 7 - rezervoar za odvod; 8 - filter; 9 - ulazni filter

Sistem prikazan na sl. 2 je izokratski: sastav mobilne faze se ne mijenja tokom hromatografije. Ako je tokom hromatografske analize izuzetno važno promijeniti koncentraciju jedne ili više komponenti mobilne faze, onda se koriste tzv. gradijentni sistemi koji se obično sastoje od dvije ili više pumpi. U slučaju gradijentnog eluiranja, svaki rastvarač se iz posebne posude dovodi u posebnu komoru za mešanje sa magnetnom mešalicom, gde se, prema određenom programu, meša sa zadatim volumnim odnosom.

Za analizu mikotoksina češće se koriste gradijentni sistemi, gde se kao mobilna faza koriste rastvori acetonitrila u vodi sa koncentracijom koja se linearno menja sa vremenom.

Kromatografska kolona je metalna cijev prečnika 150 do 250 mm sa unutrašnjim prečnikom 4,6 mm, punjena posebnim sorbentom na bazi silika gela sa kalemljenim ugljovodoničnim radikalima. Zaštitna kolona služi za zaštitu hromatografske kolone od kontaminacije.

UV fotometrijski detektor je najčešći tip HPLC detektora. Princip rada detektora je sličan onom kod konvencionalnog spektrofotometra: registruje optičku gustinu rastvora. Razlika je u tome što je UV detektor detektor protoka, umesto kivete sa rastvorom koristi fotometrijsku ćeliju. Struja eluenta teče kroz radnu ćeliju, a čista mobilna faza teče kroz referentnu ćeliju. Izvor svjetlosti je živina lampa, koja proizvodi intenzivno UV zračenje. Svetlost željene talasne dužine se bira pomoću odgovarajućih optičkih filtera, prolazi kroz ćelije, delimično se apsorbuje od strane molekula mobilne faze i komponenti koje treba odvojiti i hvata se fotodetektorom. Apsorpcija svjetlosti (optička gustina) eluata kontinuirano se bilježi pomoću snimača grafikona ili kompjutera, snimajući hromatogram. Odvojene komponente mješavine (na primjer, mikotoksini) prikazane su na hromatogramu kao pikovi. Položaj vrha na kromatogramu se koristi za identifikaciju supstance, a površina pika se koristi za kvantifikaciju.

Složeniji uređaj je fluorescentni (fluorimetrijski) detektor.
Hostovan na ref.rf
Takav detektor koristi sposobnost organskih jedinjenja, posebno aflatoksina i zearalenona, da fluoresciraju kada su izloženi UV ili vidljivoj svjetlosti. Fluorescentni detektor ima protočnu ćeliju sa dva međusobno okomita optička kanala. Jedan od njih služi za dovod uzbudljivog zračenja, drugi omogućava mjerenje intenziteta fluorescencije. U slučaju analize aflatoksina B 1 i M 1 talasna dužina ekscitacije je 360 ​​nm, a emitovana talasna dužina 420 nm.

Treba napomenuti da se UV detektor može koristiti i za analizu aflatoksina, ali je njegova osjetljivost za red veličine niža od one kod fluorimetrijskog detektora, stoga je detekcija fluorescencije poželjna kada se analiziraju niske koncentracije aflatoksina (na MPC-u). nivo i ispod).

Metode određivanja mikotoksina - pojam i vrste. Klasifikacija i karakteristike kategorije "Metode za određivanje mikotoksina" 2017, 2018.

GOST 32835-2014

MEĐUDRŽAVNI STANDARD

PROIZVODI OD SOKOVA

Određivanje mikotoksina tandemskom tečnom hromatografijom visokih performansi-masenom spektrometrijom (HPLC-MS/MS)

Proizvodi od sokova. Određivanje mikotoksina tandemskom tečnom masenom spektrometrijom visokih performansi (HPLC-MS/MS)

MKS 67.080.01

Datum uvođenja 2016-01-01

Predgovor

Ciljevi, osnovni principi i osnovni postupak za obavljanje poslova na međudržavnoj standardizaciji utvrđeni su GOST 1.0-92 "Međudržavni sistem standardizacije. Osnovne odredbe" i GOST 1.2-2009 "Međudržavni sistem standardizacije. Međudržavni standardi, pravila i preporuke za međudržavnu standardizaciju. Pravila za izradu, usvajanje, primjenu, obnavljanje i ukidanje

O standardu

1 RAZVIJENA od strane Savezne državne obrazovne ustanove visokog obrazovanja stručno obrazovanje"Moskovski državni univerzitet za proizvodnju hrane" (FGBOU VPO "MGUPP")

2 UVODILA Federalna agencija za tehničku regulaciju i mjeriteljstvo

3 UVOJENO od strane Međudržavnog vijeća za standardizaciju, mjeriteljstvo i sertifikaciju (Zapisnik od 25. juna 2014. N 45-2014)

Glasao za prihvatanje:

Kratki naziv zemlje prema MK (ISO 3166) 004-97		Skraćeni naziv nacionalnog tijela za standarde
Jermenija		Ministarstvo ekonomije Republike Jermenije
Bjelorusija		Državni standard Republike Bjelorusije
Kirgistan		Kyrgyzstandart
Rusija		Rosstandart

4 Naredbom Federalne agencije za tehničku regulaciju i mjeriteljstvo od 19. avgusta 2014. N 896-st GOST 32835-2014 stupio je na snagu kao nacionalni standard Ruska Federacija od 01.01.2016

5 Ovaj standard razvijen uzimajući u obzir odredbe sljedećih međunarodnih dokumenata:

- CODEX STAN 247-2005* Codex General Standard za voćne sokove i nektare Komisije Codex Alimentarius (Single međunarodni standard Komisija Codex Alimentarius za voćne sokove i nektare);
________________
* Pristup međunarodnim i stranim dokumentima navedenim u daljem tekstu u tekstu može se ostvariti klikom na link do stranice http://shop.cntd.ru. - Napomena proizvođača baze podataka.


- Uredba Komisije Evropske unije od 23.02.2006. br. 406/2006/EZ o utvrđivanju metoda uzorkovanja i metoda analize za službenu kontrolu nivoa mikotoksina u namirnicama za službenu kontrolu nivoa mikotoksina u hrani");

- Kodeks prakse AIJN za ocjenjivanje kvaliteta i autentičnosti sokova od voća i povrća Evropske asocijacije za voćne sokove.

6 PREDSTAVLJENO PRVI PUT


Informacije o promjenama ovog standarda objavljuju se u godišnjem indeksu informacija" Nacionalni standardi", a tekst izmjena i dopuna - u mjesečnom informativnom indeksu "Nacionalni standardi". U slučaju revizije (zamjene) ili ukidanja ovog standarda, odgovarajuće obavještenje će biti objavljeno u mjesečnom informativnom indeksu "Nacionalni standardi". informacije, obaveštenja i tekstovi su takođe smešteni informacioni sistem opće upotrebe - na službenoj web stranici Federalne agencije za tehničku regulaciju i mjeriteljstvo na Internetu

1 područje upotrebe

1 područje upotrebe

Ovaj standard se odnosi na sokove i druge proizvode od sokova od voća i povrća, sa izuzetkom ćelija agruma, i uspostavlja metodu za određivanje mikotoksina - patulina i okratoksina A - korišćenjem tandem tečne hromatomazne spektrometrije visokih performansi u mernom opsegu od masena koncentracija patulina od 0,1 do 100,0 µg/dm i ohratoksina A od 0,1 do 20,0 µg/dm.

NAPOMENA Ovaj međunarodni standard se preporučuje za primjenu u svrhu odobravanja i prikupljanja dodatnih informacija u smislu njegove primjene.

2 Normativne reference

Ovaj standard koristi normativne reference na sljedeće međudržavne standarde:

GOST 12.1.004-91 Sistem standarda zaštite na radu. Sigurnost od požara. Opšti zahtjevi

GOST 12.1.007-76 Sistem standarda zaštite na radu. Klasifikacija i opšti sigurnosni zahtjevi

GOST 12.1.010-76 Sistem standarda zaštite na radu. Sigurnost od eksplozije. Opšti zahtjevi

GOST 12.1.019-79 Sistem standarda zaštite na radu. Električna sigurnost. Opšti zahtjevi i nomenklatura vrsta zaštite

GOST 61-75 Reagensi. Sirćetna kiselina. Specifikacije

GOST OIML R 76-1-2011 Državni sistem obezbeđivanje ujednačenosti merenja. Neautomatske vage. Dio 1. Metrološki i tehnički zahtjevi. Testovi

GOST 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) Mjerno laboratorijsko stakleno posuđe. Cilindri, čaše, tikvice, epruvete. Opće specifikacije

GOST ISO 3696-2013 Voda za laboratorijske analize. Tehnički uslovi i metode kontrole

GOST ISO 5725-1-2003 Tačnost (tačnost i preciznost) metoda i rezultata merenja. Dio 1. Osnovne odredbe i definicije

GOST ISO 5725-2-2003 Tačnost (tačnost i preciznost) metoda i rezultata merenja. Dio 2: Osnovna metoda za određivanje ponovljivosti i reproduktivnosti standardne metode mjerenja

GOST 5789-78 Reagensi. Toluen. Specifikacije

GOST 16317-87 Električni rashladni aparati za domaćinstvo. Opće specifikacije

GOST 20015-88 Hloroform. Specifikacije

GOST 25336-82 Stakleno posuđe i laboratorijska oprema. Vrste. Glavni parametri i dimenzije

GOST 26313-84 Prerađeni proizvodi od voća i povrća. Pravila prihvatanja, metode uzorkovanja

GOST 26671-85 Prerađeno voće i povrće, mesne konzerve i meso i povrće. Priprema uzorka za laboratorijsku analizu

GOST 29030-91 Prerađeni proizvodi od voća i povrća. Piknometrijska metoda za određivanje relativne gustine i sadržaja rastvorljivih čvrstih materija

GOST 29227-91 (ISO 835/1-81) Laboratorijsko stakleno posuđe. Pipete su diplomirale. Dio 1. Opšti zahtjevi

GOST ISO/IEC 17025-2009 Opšti zahtjevi za kompetentnost laboratorija za ispitivanje i kalibraciju

GOST 32689.1-2014 Prehrambeni proizvodi biljnog porijekla. Multimetode za plinsko hromatografsko određivanje ostataka pesticida. Dio 1. Opće odredbe

GOST 32689.2-2014 Prehrambeni proizvodi biljnog porijekla. Multimetode za plinsko hromatografsko određivanje ostataka pesticida. Dio 2: Metode ekstrakcije i prečišćavanja

GOST 32689.3-2014 Prehrambeni proizvodi biljnog porijekla. Multimetode za plinsko hromatografsko određivanje ostataka pesticida. Dio 3. Određivanje i validacija rezultata

Napomena – Prilikom korišćenja ovog standarda preporučljivo je provjeriti valjanost referentnih standarda u sistemu javnog informisanja – na službenoj web stranici Federalne agencije za tehničku regulaciju i mjeriteljstvo na internetu ili prema godišnjem indeksu informacija „Nacionalni standardi“ , koji je objavljen od 1. januara tekuće godine, te o izdanjima mjesečnog informativnog indeksa "Nacionalni standardi" za tekuću godinu. Ako je referentni standard zamijenjen (modificiran), onda kada koristite ovaj standard, trebali biste se voditi zamjenskim (modificiranim) standardom. Ako je referentni standard poništen bez zamjene, odredba u kojoj je data referenca na njega se primjenjuje u mjeri u kojoj to ne utiče na ovu referencu.

3 Skraćenice

HPLC-MS/MS - tandem tečna hromatografija visokih performansi-masena spektrometrija;

OTA, ohratoksin A;

PAT - patulin;

ESI- jonizacija raspršivanjem električno polje (Ionizacija elektrosprejom);

IARC- Međunarodna agencija za istraživanje raka;

LOD- granica detekcije;

LOQ- granica kvantitativnog određivanja;

SRM- identifikacija komponenti u načinu kontrole selektivnih reakcija ( Monitoring odabranih reakcija).

4 Suština metode

Suština metode sastoji se u preliminarnoj ekstrakciji PAT i OTA mikotoksina acetonitrilom u prisustvu bezvodnog magnezijum sulfata, koncentriranju, ponovnom rastvaranju u acetonitrilu i kvantitativnom određivanju masene koncentracije mikotoksina pomoću HPLC-MS/MS sa ionizacijom sprejom. u električnom polju i identifikaciji komponenti u načinu kontrole selektivnih reakcija.

5 Mjerni instrumenti, pomoćna oprema, referentni materijali, reagensi i stakleno posuđe

Analitički HPLC-MS/MS* sistem sa tri-kvadrupolnim detektorom mase za merenja u opsegu mase od 10 do 3000 jedinica atomske mase (a.m.u.), sa preciznošću merenja mase od najmanje 0,1 a.m.u., jonizaciono raspršivanje u električnom polju, mogućnost rada u režimu kontrole odabranih reakcija i skeniranja dječjih i roditeljskih jona, minimalni omjer signal-šum 1000:1. Analitički sistem treba uključiti HPLC modul koji se sastoji od binarne pumpe sa mikserom, hromatografskog termostata na koloni koji omogućava temperaturu zagrijavanja do 50 °C i kromatografske kolone sa sorbentom obrnute faze veličine zrna od 5 μm C, 150 mm dužine i unutrašnjeg prečnika 3 mm. Sistem koji se koristi mora osigurati detekciju mikotoksina u rasponu od 0,1 do 100,0 µg/dm.
________________
* Dodatne informacije Pogledajte Dodatak A za preporučene HPLC-MS/MS sisteme.


Spektrofotometar sa mjernim opsegom koji omogućava testiranje na talasnoj dužini od 250 do 400 nm, dozvoljeno apsolutnom greškom u mjerenju optičke gustoće ne većom od 0,1%.

Vaga u skladu sa GOST OIML R 76-1, koja obezbeđuje tačnost vaganja sa granicom dozvoljene apsolutne greške pojedinačnog vaganja ne većom od ±0,01 mg.

Ultrazvučna kupka.

Centrifuga sa brzinom rotora 4000-5000 o/min za epruvete kapaciteta 50 ml.

Centrifuga sa brzinom rotora 10000-12000 o/min za epruvete tipa Eppendorf kapaciteta 1,5-2,0 ml.

Ormar za sušenje omogućava održavanje temperature do 200°S.

Frižider za domaćinstvo prema GOST 16317.

Šejker za mešanje.

Uređaji za doziranje tekućih uzoraka sa konstantnim ili promjenjivim kapacitetom od 20-1000 mm sa relativnom greškom u doziranju stvarne zapremine ne većom od 2,5%.

Mikrofilter - mlaznica na špricu (regenerisana celuloza, prečnik 13 mm, veličina pora 0,2-0,4 mikrona).

Kvarc kivete radne dužine 1 cm.

PAT i OTA mikotoksini za upotrebu kao referentni uzorci sa sadržajem glavne supstance od najmanje 98%.

Ledena sirćetna kiselina prema GOST 61, analitička kvaliteta.

Acetonitril za Gradient HPLC.

Metanol za Gradient HPLC.

Magnezijum sulfat bezvodni, hemijski čist

Kalcijum hlorid bezvodni, zrnast, hemijski čist

Hloroform prema GOST 20015, hemijski čist

Toluen prema GOST 5789, hemijski čist

Etil alkohol, apsolutni.

Voda za laboratorijske analize, čistoća 1 prema GOST ISO 3696.

Graduirane pipete 2. klase tačnosti kapaciteta 1, 2, 5, 10 cm 2 2. klase tačnosti prema GOST 29227.

Volumetrijske tikvice 2. klase tačnosti kapaciteta 5, 10, 25, 50, 100 i 1000 cm 2 ili 2a prema GOST 1770.

Tikvice oštrog dna kapaciteta 10,25 cm3.

Centrifužna epruveta tipa Eppendorf kapaciteta 1,5-2,0 ml.

Mikroepruveta kapaciteta 100-400 mm.

Mjerni cilindri 2. klase tačnosti kapaciteta 25, 50, 250 cm3 bilo kojeg dizajna u skladu sa GOST 1770.

Centrifužna cijev sa poklopcem na navoj, 50 cm

Porculanska šolja prečnika 125-150 mm.

Laboratorijski eksikator kapaciteta 3 dm.

Laboratorijski lijevci u skladu sa GOST 25336.

Tikvice s ravnim dnom kapaciteta 50, 100, 250 cm3 prema GOST 25336.

Hemijska stakla kapaciteta 10, 20, 50, 100 i 200 cm3 u skladu sa GOST 25336.

Dozvoljena je upotreba drugih mjernih instrumenata, pomoćne opreme, pribora koji po metrološkim i tehničkim karakteristikama nisu inferiorniji od gore navedenih i koji pružaju potrebnu tačnost mjerenja, kao i standardne uzorke, reagense i materijale u kvaliteti ne lošijoj od gore navedenog. .

6 Uzorkovanje

Uzorkovanje - prema GOST 26313. Priprema i skladištenje uzoraka - prema GOST 26671, GOST 32689.1, GOST 32689.2 i GOST 32689.3.

7 Priprema za testiranje

7.1 Opšti zahtjevi

Prije ispitivanja vrši se preliminarna priprema laboratorijskog staklenog posuđa, kao i kontrola kvaliteta reagensa i pomoćnih materijala u skladu sa zahtjevima GOST 32689.1, GOST 32689.2 i GOST 32689.3.

7.2 Priprema pomoćnih rastvora

7.2.1 Priprema mobilne faze A

U volumetrijsku tikvicu kapaciteta 1000 ml sa dobro zatvorenim brušenim staklenim ili fluoroplastičnim čepom pipetirajte 1 ml glacijalne octene kiseline, 100 ml metanola i dovedite do oznake sa bidestiliranom vodom. Smjesa se dobro izmiješa.

Rok trajanja mobilne faze A na sobnoj temperaturi - ne više od mjesec dana.

7.2.2 Priprema mobilne faze B

U odmjernu tikvicu kapaciteta 1000 ml sa dobro zatvorenim brušenim staklenim ili fluoroplastičnim čepom, pipetom se stavi 1 ml glacijalne octene kiseline i dovede do oznake metanolom. Smjesa se dobro izmiješa.

Rok trajanja mobilne faze B na sobnoj temperaturi - ne više od mjesec dana.

Napomena - Nije dozvoljeno dodirivanje mobilne faze sa gumom i polimernih materijala[osim politetrafluoroetilena (PTFE)].

7.2.3 Priprema rastvarača 1

U odgovarajućoj posudi pomiješajte 99 volumenskih dijelova toluena i jedan volumenski dio glacijalne octene kiseline. Smjesa se dobro izmiješa.

Rok trajanja rastvarača 1 na sobnoj temperaturi nije duži od 6 mjeseci.

7.3 Priprema magnezijum sulfata

Bezvodni magnezijum sulfat koji se koristi u ekstrakciji kao sorbent mora se osušiti čak i unutar roka trajanja kako bi se uklonila apsorbirana vlaga iz zraka. Sorbent se kalcinira na temperaturi od 180°C - 200°C 6-10 sati i čuva u eksikatoru iznad bezvodnog kalcijum hlorida. Kriterijum za prikladnost reagensa je odsustvo dodatnog vodenog sloja kada se rastvor zagreje, faza ekstrakcije se izvodi na temperaturu od 30°C - 40°C i nakon 2-3 minuta reakciona masa se meša. .

7.4 Priprema osnovnih rastvora mikotoksina

7.4.1 Priprema PAT rastvora

7.4.1.1 Priprema matične otopine PAT, masena koncentracija 200 µg/cm

Uzmite 2,0 mg čistog kristalnog PAT-a, izvaganog sa tačnošću od 0,01 mg, rastvorite u volumetrijskoj tikvici od 10 ml u maloj količini hloroforma, a zatim dovedite zapreminu rastvora do oznake hloroformom.

Rok trajanja početnog PAT rastvora na temperaturi od 0°C u staklenoj volumetrijskoj tikvici sa brušenim čepom dobro umotanim u aluminijumsku foliju nije duži od 1 mesec.

7.4.1.2 Priprema PAT rastvora, masene koncentracije 20 µg/cm

Prebacite 1 ml dobijenog osnovnog rastvora PAT (videti 7.4.1.1) u volumetrijsku tikvicu od 10 ml i razblažite do oznake hloroformom. Za određivanje točne masene koncentracije PAT-a u otopini uzima se 5,0 ml dobivene standardne otopine PAT-a i prenosi u posudu kapaciteta oko 15 cm3, a zatim se kloroform uklanja pročišćavanjem dušikom dok se ne dobije suha tvar. Odmah po dobijanju suve materije, u posudu se dodaje 5,0 ml apsolutnog etanola. Potpuno otopiti PAT. Dobijeni PAT rastvor se unosi u kvarcnu kivetu sa optičkom putanjom od 1 cm, zatim se spektar rastvora snima na spektrofotometru u opsegu talasnih dužina od 250 do 350 nm, koristeći apsolutni etanol u referentnoj kiveti kao kontrolu. .

Masena koncentracija PAT u rastvoru, µg/cm, izračunava se po formuli

gdje je maksimalna vrijednost optičke gustine spektra (talasna dužina oko 275 nm), jedinica. OP;

- molekulska težina PAT-a, jednaka 153,1 g/mol;

- faktor konverzije;


- molarni koeficijent optičke apsorpcije (ekstinkcije), jednak 14600, m/mol.

7.4.1.3 Priprema otopine PAT od 100 µg/cm

5 ml početnog rastvora PAT-a u hloroformu masene koncentracije od 200 µg/ml (videti 7.4.1.1) se prebacuje u volumetrijsku tikvicu kapaciteta 10 ml, koncentriše do suvog ostatka na sobnoj temperaturi pod mlazom azota i odmah ponovo rastvoren u acetonitrilu, dovodeći ga do zapremine u tikvici do oznake.

7.4.1.4 Rok trajanja PAT rastvora prema 7.4.1.2 i 7.4.1.3 na 0°C u staklenoj volumetrijskoj tikvici sa brušenim čepom čvrsto umotanim u aluminijumsku foliju nije duži od 24 sata.

Prije upotrebe, temperatura otopina se dovede na sobnu temperaturu (nije dozvoljeno skidati aluminijsku foliju iz volumetrijske tikve dok sadržaj ne dostigne sobnu temperaturu). Zbog uništenja PAT-a nije dozvoljeno skladištenje referentnih uzoraka u obliku tankog filma suve materije dobijene nakon uklanjanja rastvarača -.

7.4.2 Priprema osnovnog rastvora OTA

7.4.2.1 Priprema osnovnog rastvora OTA od 20 µg/ml

Rastvorite 2,0 mg čistog kristalnog OTA, izmerenog na 0,01 mg, u čaši od 25 ml sa rastvaračem 1 (videti 7.2.3) i kvantitativno prenesite u odmernu tikvicu od 100 ml i razblažite rastvaračem 1 do oznake.

Za određivanje točne masene koncentracije OTA u otopini, dobijena početna otopina OTA se unosi u kvarcnu kivetu s optičkom dužinom od 1 cm, a zatim se spektar otopine snima na spektrofotometru u rasponu valnih dužina od 300 do 370 nm, koristeći rastvarač 1 kao referentnu kivetu.

Masena koncentracija OTA u početnom rastvoru, μg/cm, izračunava se po formuli

gdje je maksimalna vrijednost optičke gustine spektra (talasna dužina je oko 333 nm), jedinica. OP;

- molekulska težina OTA, jednaka 402,7 g/mol;

- faktor konverzije;

- faktor korekcije utvrđen u skladu sa Prilogom A;

- molarni koeficijent optičke apsorpcije (ekstinkcije), jednak 544, m/mol.

Rok trajanja originalnog OTA rastvora na temperaturi od minus 18°C ​​u staklenoj volumetrijskoj tikvici sa brušenim čepom čvrsto umotanim u aluminijumsku foliju nije duži od četiri godine.

7.4.2.2 Priprema 5 µg/ml OTA rastvora

Povući 2,5 ml osnovnog rastvora OTA (7.4.2.1), prebaciti u volumetrijsku tikvicu od 10 ml i razblažiti rastvaračem 1 (7.2.3) do oznake.

Rok trajanja otopine OTA na temperaturi od 4°C u staklenoj volumetrijskoj tikvici sa brušenim čepom dobro umotanim u aluminijsku foliju nije duži od 24 sata.

Prije upotrebe, temperatura otopine se dovede na sobnu temperaturu (nije dozvoljeno skidati aluminijsku foliju iz volumetrijske tikve dok sadržaj ne dostigne sobnu temperaturu) -.

7.5 Priprema PAT i OTA otopina za kalibraciju

PAT i OTA kalibracioni rastvori se pripremaju mešanjem određenih zapremina njihovih matičnih rastvora (videti 7.4.1.1 i 7.4.2.1) sa bistrenim sokom od jabuke koji ne sadrži analite koje treba odrediti.

7.5.1 Priprema PAT kalibracionih rastvora

7.5.1.1 Priprema međurastvora PAT masene koncentracije od 1000 ng/cm (rastvor n-1)

1 ml rastvora PAT (videti 7.4.1.3) ili 1 ml standardnog uzorka PAT kompozicije sa masenom koncentracijom PAT od 100 µg/cm prebacuje se u volumetrijsku tikvicu kapaciteta 100 ml i zapremine rastvor se dovede do oznake acetonitrilom.

7.5.1.2 Priprema međurastvora PAT masene koncentracije od 10 ng/cm (rastvor n-2)

Prebacite 1 ml rastvora -1 (videti 7.5.1.1) u volumetrijsku tikvicu od 100 ml i razblažite acetonitrilom do oznake.

7.5.1.3 Priprema PAT kalibracionih rastvora

Odabrane u skladu sa tabelom 1 određene količine međurastvora n-1 i n-2 (vidjeti 7.5.1.1 i 7.5.1.2) i dozirati u volumetrijske tikvice od 10 ml.


Tabela 1 - Zapremine rastvora n-1 i n-2 za pripremu PAT kalibracionih rastvora

Naziv indikatora	Rješenja za kalibraciju
Volumen rastvora n-2 cm
Volumen rastvora n-1 cm
Količina ubrizganog PAT-a, ng
Masena koncentracija PAT u rastvoru, ng/cm

7.5.2 Priprema OTA kalibracionih rastvora

7.5.2.1 Priprema 200 ng/ml OTA intermedijernog rastvora (rastvor A-1)

Koncentrirajte 1 ml otopine OTA od 5 µg/ml (vidjeti 7.4.2.2) do suva u struji azota na sobnoj temperaturi i odmah prebacite sa acetonitrilom u volumetrijsku tikvicu od 25 ml.

7.5.2.2 Priprema 10 ng/ml OTA intermedijernog rastvora (rastvor ALI-2)

0,5 ml OTA intermedijernog rastvora ALI-1 (vidjeti 7.5.2.1) se prebaci u odmjernu tikvicu od 10 ml i razrijedi do oznake acetonitrilom.

7.5.2.3 Priprema otopina za OTA kalibraciju

Odabrane u skladu sa tabelom 2 određene količine međurastvora ALI-1 i ALI-2 (vidjeti 7.5.2.1 i 7.5.2.2) i dozirati u odmjerne tikvice od 10 ml.


Tabela 2 - Zapremine rastvora ALI-1 i ALI-2 za pripremu OTA kalibracionih rastvora

Naziv indikatora	Rješenja za kalibraciju
Volumen rastvora ALI-2 cm
Volumen rastvora ALI-1 cm
Količina primijenjenog OTA, ng
Masena koncentracija OTA u rastvoru, ng/cm

Dovedite zapreminu rastvora u tikvicama do oznake sa pročišćenim sokom od jabuke (ili drugim filtriranim) sokom.

Za testiranje u HPLC-MS/MS, sistem se ubrizgava sa 10 mm PAT i OTA kalibracionih rastvora pripremljenih prema 7.5.1.3 i 7.5.2.3 i kalibrisane prema 7.7, uzimajući u obzir uslove iz 8.3.1.

Rok trajanja kalibracionog rastvora na temperaturi od 0°C - 4°C u staklenoj volumetrijskoj tikvici sa brušenim čepom nije duži od 24 sata.

7.6 Priprema LC/MS/MS sistema

Priprema HPLC-MS/MS sistema za merenja vrši se u skladu sa uputstvom (uputstvom) za rad i informacijama datim u Dodatku B.

Prilikom postavljanja režima rada masenog spektrometra, preporučljivo je koristiti MS/MS parametre za određivanje mikotoksina date u Dodatku B.

U tom slučaju moraju biti ispunjeni sljedeći uslovi:

- temperatura ambijentalnog vazduha od 20°S do 25°S;

- atmosferski pritisak od 84 do 106 kPa;

- napon u mreži (220±10) V;

- frekvencija struje u mreži od 49 do 51 Hz;

- relativna vlažnost vazduha od 40% do 80%.

7.7 Kalibracija HPLC-MS/MS sistema

Kalibracija sistema sa rastvorima mikotoksina u sokovima prema 7.5. vrši se u skladu sa uputstvom za upotrebu (uputstvo) za HPLC-MS/MS sistem i uzimajući u obzir uslove prema 8.3.1 jednom mesečno. Područja pikova PAT i OTA određuju se na hromatogramima, a kalibracijska ovisnost se utvrđuje od površine pika u rasponu koncentracija prema 7.5. Izračunajte koeficijent korelacije i odstupanje izračunatih vrijednosti masene koncentracije mikotoksina na svakoj tački kalibracije od stvarne vrijednosti u skladu sa postupkom za pripremu kalibracijskih otopina (vidi 7.5). Kalibracija se smatra prihvatljivom ako je koeficijent korelacije najmanje 0,999 (za PAT) i 0,965 (za OTA), a relativno odstupanje izračunate vrijednosti masene koncentracije od stvarne vrijednosti nije veće od ±10%.

Umjesto relativnog odstupanja, prihvatljivost kalibracijske karakteristike može se ocijeniti relativnom standardnom devijacijom, koja ne bi trebala prelaziti 5%.

8 Testiranje

8.1 Ekstrakcija

10 ml () prethodno dobro izmiješanih proizvoda od soka stavlja se u epruvetu za centrifugiranje sa poklopcem na navoj kapaciteta 50 ml. U epruvetu se dodaje 20 ml acetonitrila i 15 g bezvodnog magnezijum sulfata. Smjesa se intenzivno miješa tri do pet minuta ručno ili šejkerom. Nakon mešanja dobijeni ekstrakt se centrifugira 10 minuta na 4000-5000 o/min na sobnoj temperaturi ili 5 minuta u prisustvu centrifuge uz hlađenje na temperaturi od 5°C. Izmjerite ukupni volumen ekstrakta nakon centrifugiranja (). 18-19 cm3 () ekstrakta, uzetog pipetom ili uređajem za doziranje, prebacuje se u tikvicu sa oštrim dnom od 25 cm3. 1 cm () acetonitril.

Ako na zidovima posude postoji nerastvorljivi karamel film, on se uništava u ultrazvučnoj kupki tri do pet minuta. Rastvor se prenosi u epruvetu tipa Eppendorf kapaciteta 1,5-2,0 cm3 i centrifugira na 10.000-12.000 o/min 3-5 minuta. Gornji sloj se uzima i filtrira kroz mikrofilter sa veličinom pora 0,2-0,4 µm direktno u mikroepruvetu kapaciteta 100-400 mm. Za HPLC-MS/MS test, 10 mm pripremljenog uzorka se ubrizgava u sistem.

8.2 Priprema uzoraka iz koncentriranih proizvoda

Koncentrovani sokovi (pire) se rekonstituišu vodom do minimalnog nivoa rastvorljivih čvrstih materija propisanih normativni dokumenti za određenu vrstu sokova. Koncentrovani sokovi, za koje nisu predviđeni minimalni nivoi rastvorljivih čvrstih materija, obnavljaju se bidestilovanom vodom do sadržaja rastvorljivih čvrstih materija od 11,2%. Sadržaj rastvorljivih čvrstih materija kontroliše se prema GOST 29030.

Ekstrakcija rekonstituisanih uzoraka vrši se prema 8.1.

8.3 Mjerenje

8.3.1 Opšti uslovi

Uzorci i rastvori za kalibraciju pripremljeni prema 8.1 se ubrizgavaju odabranim redosledom. Najčešća metoda je kada ubrizgavanje kalibracijskih otopina počinje i završava seriju ubrizgavanja uzorka.

HPLC-MS/MS sistem mora biti podešen na SRM sa prelazima koji omogućavaju selektivnu detekciju analiziranih mikotoksina. Vremena zadržavanja i površine pikova se određuju korišćenjem softvera za analizu za snimanje i izračunavanje rezultata analize, priključenog na HPLC-MS/MS sistem. Primjeri HPLC/MS/MS sistema, uvjeti odvajanja i masena spektrometrijska detekcija dati su u Dodatku B.

Uzorci se ispituju pod uslovima ponovljivosti za dva paralelna određivanja u skladu sa GOST ISO 5725-1 (pododeljak 3.14) i GOST ISO 5725-2.

8.3.2 Identifikacija mikotoksina

Za identifikaciju mikotoksina, vremena zadržavanja dobivena iz otopina uzoraka uspoređuju se s vremenima zadržavanja odgovarajućih mikotoksina iz otopina za kalibraciju. Da bi se potvrdilo prisustvo mikotoksina, pravi se poređenje između omjera intenziteta signala iz prvog i drugog m/z-prijelaz sa odnosom intenziteta signala mikotoksina iz kalibracionih rastvora.

Odnos pikova za jedan mikotoksin ne bi trebalo da se razlikuje za više od 20% od očekivanog odnosa intenziteta signala.

9 Obrada i prezentacija rezultata ispitivanja

9.1 Kvantifikacija

Kvantifikacija mikotoksina u ubrizganoj zapremini pripremljenog ekstrakta (videti 8.1) vrši se poređenjem površine (ili visine) vrha mikotoksina sa odgovarajućom kalibracionom karakteristikom za ovaj mikotoksin.

Masena koncentracija mikotoksina u ispitivanim proizvodima, µg/dm, izračunava se po formuli

gdje je faktor konverzije iz kubnih centimetara u kubne decimetre;

- koncentracija mikotoksina u zapremini ekstrakta od 10 mm, ubrizganog u HPLC-MS/MS sistem, određena kalibracionom zavisnošću, ng;

je volumen acetonitrila u kojem je ekstrakt ponovno otopljen nakon koncentracije, cm;

- ukupni volumen ekstrakta iz kojeg se uzima zapremina za koncentraciju, cm;

- zapremina uzorka unesenog u hromatograf (=10 mm), mm;

- zapremina uzorka proizvoda od soka uzetih za ispitivanje, cm;

- volumen ekstrakta odabranog za koncentraciju, vidi

Prilikom izračunavanja količine mikotoksina u koncentrovanim sokovnim proizvodima uzima se u obzir stepen razblaženja vodom u skladu sa 8.2.

Rezultat mjerenja se uzima kao aritmetička sredina rezultata tri paralelna određivanja, ako je ispunjen uvjet prihvatljivosti

gdje su maksimalne i minimalne vrijednosti dobijena tri rezultata paralelnih određivanja, µg/dm;

, , - rezultati tri paralelna određivanja, µg/dm;

- vrijednost kritičnog raspona, %.

Neslaganje između tri paralelna određivanja (kao procenat srednje vrednosti) obavljena u istoj laboratoriji ne bi trebalo da pređe granicu ponovljivosti (konvergencije) jednaku 3,6· sa verovatnoćom = 0,95. Ako je ovaj uslov ispunjen, konačni rezultat mjerenja uzima se kao aritmetička sredina tri paralelna određivanja, zaokružena na treću decimalu.

Rezultati merenja se beleže u protokolu u skladu sa GOST ISO/IEC 17025.

9.2 Ako dobijeni rezultat pokaže da sadržaj mikotoksina prelazi gornju granicu opsega kalibracione zavisnosti, pripremiti novi uzorak povećanjem njegovog razblaženja vodom i ponovo izmjeriti.

10 Metrološke karakteristike

Metrološke karakteristike metode za PAT i OTA odgovaraju uslovima datim u tabeli 3.


Tabela 3 - Preciznosti HPLC-MS/MS metode

Mjerni opseg, µg/dm	Relativna standardna devijacija ponovljivosti, %	Relativna standardna devijacija reproduktivnosti, %
prilikom određivanja PAT (ne više)
prilikom određivanja OTA (ne više)

Granice detekcije PAT i OTA u uzorcima proizvoda od sokova su: LOD- 0,03 mcg/dm, LOQ- 0,1 mcg/dm.

11 Kontrola kvaliteta rezultata mjerenja

Kontrola kvaliteta rezultata mjerenja u laboratoriji uključuje praćenje stabilnosti rezultata mjerenja korištenjem provjere stabilnosti standardne devijacije srednje preciznosti. Ispitivanje stabilnosti se provodi korištenjem Shewhartovih kontrolnih karata. Učestalost praćenja stabilnosti rezultata izvršenih mjerenja regulisana je internim dokumentima sistema kvaliteta. U slučaju nezadovoljavajućih rezultata kontrole, na primjer, kada je granica djelovanja prekoračena ili je granica upozorenja redovno prekoračena, otkrivaju se razlozi ovih odstupanja, uključujući promjenu reagensa, provjeru rada operatera.
GOST 12.1.007.

PAŽNJA! Pri radu sa mikotoksinima treba imati u vidu da PAT i OTA imaju jaka toksična svojstva sa izraženim nefrotoksičnim, imunotoksičnim, teratogenim i genotoksičnim efektima. Prema klasifikaciji IARC OTA se odnosi na karcinogene potencijalno opasne za ljude (grupa 2B). Pri radu sa mikotoksinima moraju se poštovati veće mere predostrožnosti. Laboratorijsko osoblje treba da nosi zaštitnu odeću, uključujući štitnik za lice, rukavice i naočare. Sve operacije s mikotoksinima izvode se u dimovodu. Po završetku radova, iskorišteno laboratorijsko stakleno posuđe i otpad se podvrgavaju dekontaminaciji.

Aneks A (obavezno). Verifikacija spektrofotometra i određivanje faktora korekcije CF za izračunavanje masenih koncentracija mikotoksina u standardnim otopinama

Aneks A
(obavezno)

Verifikacija spektrofotometra i određivanje faktora korekcije za izračunavanje masenih koncentracija mikotoksina u standardnim rastvorima

A.1 Da biste odredili masene koncentracije mikotoksina u osnovnim rastvorima (videti 7.4.1.1 i 7.4.2.1), koristite spektrofotometar pogodan za merenje apsorbancije rastvora u kvarcnoj kiveti sa dužinom optičkog puta od 1 cm u opsegu talasnih dužina od 200 nm do 400 nm.

Kalibracija spektrofotometra se izvodi na sljedeći način.

Izmeriti optičku gustinu tri rastvora kalijum dihromata (KCrO) u sumpornoj kiselini (HSO) - 0,25; 0,125 i 0,0625 mmol/dm na maksimalnoj tački apsorpcije (valna dužina oko 350 nm), koristeći kao kontrolu otopinu sumporne kiseline (HSO) sa koncentracijom od 0,009 mmol/dm.

Zatim se izračunava vrijednost molarnog koeficijenta optičke gustoće, m/mol, za svaku koncentraciju kalijevog dihromata prema formuli

gdje je izmjerena vrijednost optičke gustoće otopine kalij-dihromata u sumpornoj kiselini za odgovarajuću koncentraciju, jedinica. OP;

- koncentracija rastvora kalij-dihromata u sumpornoj kiselini, mmol/dm.

Ako je razlika između tri izmjerene vrijednosti izvan zajamčenog raspona točnosti mjerenja optičke gustoće, tada treba provjeriti postupak kalibracije ili opremu. Izračunajte aritmetičku sredinu.

Odredite faktor korekcije (bezdimenzionalna vrijednost) za specifična oprema(spektrofotometar i kiveta) prema formuli

gdje je karakteristična vrijednost koeficijenta molarne optičke gustoće za rastvore kalij-dihromata (KCrO), m/mol;

- molarni koeficijent optičke gustine, izračunat prema formuli (A.1), m/mol.

Ako je rezultirajuća vrijednost faktora korekcije manja od 0,95 ili veća od 1,05, tada se mora provjeriti postupak kalibracije ili oprema kako bi se eliminisala odstupanja (isti set kiveta se koristi za kalibraciju i čistoću) -.

Dodatak B (informativni). Primjeri HPLC-MS/MS sistema za određivanje mikotoksina u sokovima i drugim proizvodima od sokova*

Aneks B
(referenca)

________________
* Ovi primjeri su preporučeni i dati su radi pogodnosti korisnika ovog međunarodnog standarda.

B.1 HPLC-MS/MS sistem br. 1

Hardverska platforma: Varian 320-MS LC/MS/MS.

Jonski