วิธีการตรวจหาสารพิษจากเชื้อรา วิธีการทางห้องปฏิบัติการสำหรับการวินิจฉัย mycotoxicoses สารพิษจากเชื้อราและวิธีการตรวจสอบ

หลังจากการกำเนิดของลูกสุนัข ช่วงเวลาที่รับผิดชอบเริ่มขึ้นสำหรับสุนัขตัวเมียและเจ้าของของมัน เมื่อเราควรดูแลไม่เพียงแค่การให้อาหารและสุขภาพของสุนัขตัวเมียเท่านั้น แต่ยังรวมถึงทารกแรกเกิดด้วย หลังคลอดลูกสุนัข หนึ่งหรือสองวันแรกสุนัขตัวเมียอาจมีความอยากอาหารไม่ดี อาหารไม่ย่อย โดยเฉพาะอย่างยิ่งถ้าเธอกินมากหลังคลอด

โปรดจำไว้ว่าในช่วงเวลานี้คุณไม่ควรใช้ยาปฏิชีวนะซึ่งจะส่งผลเสียต่อสุขภาพของทารก พยายามหลีกเลี่ยงการใช้ยาที่ปลอดภัยกว่า (เช่น สมุนไพร โปรไบโอติก การล้างกระเพาะ ถ่านกัมมันต์ และลิกนิตินโดยเฉพาะอย่างยิ่ง) ผลลัพธ์ที่ดีมากในกรณีนี้ได้มาจากการใช้การเตรียมชีวจิตที่ไม่เป็นอันตรายอย่างยิ่งจาก Heel และไม่จำเป็นต้องมองหาสัตวแพทย์ "มนุษย์" ทำงานได้ไม่เลวร้ายไปกว่านั้น ลองฉีด Echinacea compositum, Nux vomica, Berebe-ris-hommacord ฉีดเข้าใต้ผิวหนังหนึ่งหรือสองครั้ง ผลลัพธ์ที่ดีได้จากการใช้ยาในแท็บเล็ตของ บริษัท Diar-heel เดียวกัน ยาจะได้รับ 3 ครั้งต่อวัน 1 เม็ด ผลลัพธ์จะดีกว่าถ้าละลายล่วงหน้าในน้ำต้ม 1.5 ช้อนโต๊ะและผสมให้ละเอียด

ในช่วงสามวันแรกหลังคลอดต้องให้อาหารอย่างระมัดระวังเพื่อไม่ให้เกิดความผิดปกติขึ้น นักเขียนชาวต่างประเทศในช่วงเวลานี้แนะนำให้สุนัขตัวเมียต้มไก่ตัวเล็ก ๆ บดกับกระดูกแล้วคลุกข้าวต้ม

หลังจากวันแรกหลังคลอด สุนัขตัวเมียจะเพิ่มความอยากอาหารของเธออย่างเห็นได้ชัดและนี่เป็นเรื่องปกติ - ความต้องการของร่างกายของเธอเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด น้ำนมเหลืองเริ่มมีการผลิตอย่างแข็งขันก่อนแล้วจึงค่อยผลิตนม ปริมาณและคุณภาพของนมส่วนใหญ่ไม่เพียงขึ้นอยู่กับลักษณะเฉพาะของสุนัขตัวเมียเท่านั้น แต่ยังขึ้นกับการให้อาหารของเธอด้วย

ในสัปดาห์แรก ปริมาณอาหารมากกว่าอาหารปกติ 1.5 เท่า แต่ในช่วงเวลานี้ไม่ควรให้เนื้อมากเกินไปกับสุนัขตัวเมียเพื่อไม่ให้เกิดภาวะครรภ์เป็นพิษ เป็นส่วนประกอบโปรตีนในเวลานี้ คุณสามารถให้ปลาหรือคอทเทจชีส ให้อาหารสุนัขตัวเมียเป็นประจำ (ทุก 4-5 ชั่วโมง) เป็นส่วนเล็ก ๆ หลังจากที่การทำงานของกระเพาะกลับมาเป็นปกติแล้ว จำเป็นต้องให้อาหารเสริมแร่ธาตุและเสริมความแข็งแรงของขนต่อ

• เนื้อสัตว์ปลาและเครื่องใน - 45%
• ซีเรียล - 30%
• นมและผลิตภัณฑ์จากนม - 10%
• ผัก - 15%

เพื่อให้สุนัขตัวเมียที่ให้นมบุตรมีนมมากขึ้น เธอควรรวมอาหารที่ส่งเสริมการหลั่งน้ำนมในอาหารของเธอ: แครอทดิบ เนื้อ ปลา น้ำซุป ข้าวโอ๊ต ฯลฯ ให้สุนัขตัวเมียดื่ม: นม (ถ้ามี) ให้มากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ ไม่ทำให้เกิดความผิดปกติ), ชากับนม, กาแฟอ่อนกับนม เพื่อเพิ่มปริมาณนม คุณสามารถลองทำสิ่งต่อไปนี้:

• ยาต้มออริกาโน;
• ยาต้มของบาล์มมะนาว: เทหญ้าหนึ่งช้อนชากับน้ำเดือดสองถ้วยปล่อยให้มันชงใส่น้ำตาล
• วางชาสองช้อนชาในกระติกน้ำร้อนเทนมเดือดสองถ้วยปล่อยให้มันต้มประมาณ 3-4 ชั่วโมงจากนั้นเติมน้ำตาลและเย็น
• ยาต้มโป๊ยกั๊ก

Apilac ซึ่งเจ้าของหลายคนมอบให้กับผู้หญิงตัวเมียเพื่อเพิ่มการหลั่งน้ำนมไม่ได้ให้ผลลัพธ์ที่ต้องการในการฝึกฝนของฉันแม้ว่าฉันจะพยายามมอบให้กับผู้หญิงตัวอื่น

หากสุนัขไม่ยอมดื่มอย่างราบเรียบ คุณสามารถพยายามบังคับให้เขาดื่มได้ แต่ควรพยายาม "หลอก" เขาโดยการใส่เนยชิ้นเล็กๆ ลงในเครื่องดื่มที่ค่อนข้างอุ่น เป็นไปได้มากว่ากลิ่นของเนยจะยั่วยวนเธอ

เพื่อป้องกันความอ่อนล้าของสุนัขตัวเมีย การให้อาหารในช่วงเวลานี้ควรครบถ้วนและอาหารควรมีแคลอรี โปรตีน วิตามินและแร่ธาตุในปริมาณที่เพียงพอ

อย่างไรก็ตาม ตลอดระยะเวลาการให้นม ปริมาณอาหารไม่คงที่ ดังที่ได้กล่าวไปแล้วในสัปดาห์แรกอาหารควรเพิ่มขึ้น 1.5 เท่า เมื่อปริมาณนมในสุนัขเพิ่มขึ้น การปันส่วนก็ควรเพิ่มขึ้นเช่นกัน: ในสัปดาห์ที่สอง การปันส่วนควรเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า และตั้งแต่สัปดาห์ที่สามจนถึงสิ้นสุดการให้นมบุตร ควรเพิ่มเป็นสามเท่า: เปรียบเทียบกับอาหารของ สุนัขอยู่ในสภาพปกติ ปริมาณอาหารที่สุนัขตัวเมียต้องการนั้นขึ้นอยู่กับขนาดของครอก ลูกสุนัขสี่ตัวในครอกต้องการอาหารเพิ่มขึ้น 2 เท่า และลูกสุนัขแปดตัวต้องการการเพิ่มขึ้นอย่างน้อยสามเท่า

โดยปกติสุนัขตัวเมียจะเลี้ยงลูกสุนัขเป็นเวลา 4-6 สัปดาห์ ปริมาณน้ำนมที่ผลิตโดยสุนัขตัวเมียนั้นไม่คงที่ตลอดการให้นมบุตร ถึงวันที่ 20-25 ปริมาณนมเพิ่มขึ้นแล้วลดลง ผู้เชี่ยวชาญชาวตะวันตกเสนอวิธีง่ายๆ ในการคำนวณปริมาณแคลอรี่ของอาหารในช่วงเวลานี้ วิธีนี้ประกอบด้วยการชั่งน้ำหนักครอกทั้งหมดเมื่ออายุ 3-4 วัน โดยเพิ่มพลังงาน 250 แคลอรีในอาหารของสุนัขตัวเมียสำหรับลูกสุนัขแต่ละกิโลกรัม และตามนี้ จะเพิ่มปริมาณและปริมาณแคลอรี่ของอาหาร

ระยะเวลาการให้นมขึ้นอยู่กับลักษณะเฉพาะและการให้อาหารของสุนัข แน่นอนว่าในแต่ละกรณีควรคำนึงถึงลักษณะเฉพาะของสุนัขด้วย มีสุนัขตัวเมียที่ลูกสุนัข "ดูด" อย่างแท้จริง พวกมันผลิตนมเป็นเวลานาน ในปริมาณมาก และพวกมันให้อาหารลูกสุนัขได้นานถึงสองเดือน ตามธรรมชาติแล้ว อาหารของพวกมันควรจะใหญ่กว่าและสมบูรณ์กว่าของตัวเมียที่มีนมน้อยแม้ใน "การผลิตน้ำนมสูงสุด" ซึ่งตรงกับวันที่ 14-17 ของการให้นม และเจ้าของเพียงแค่ฝันว่าเธอจะให้อาหาร เด็กอายุไม่เกินสามสัปดาห์ โดยทั่วไปแล้ว การผลิตน้ำนมของสุนัขตัวเมียนั้นได้รับอิทธิพลจากอาหารโปรตีนที่สมบูรณ์ซึ่งอุดมไปด้วยกรดอะมิโนที่จำเป็น การขาดกรดอะมิโนส่งผลต่อคุณภาพของนมเป็นหลัก เช่นเดียวกับปริมาณ ซึ่งทำให้อัตราการเติบโตของลูกสุนัขลดลงและทำให้การพัฒนาของลูกสุนัขช้าลง

วิตามินยังมีบทบาทสำคัญในโภชนาการของตัวเมียที่ให้นมบุตร พวกเขามีความจำเป็นไม่เพียง แต่สำหรับตัวเมียเท่านั้น แต่ยังสำหรับการพัฒนาลูกสุนัขด้วย จำเป็นต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าสุนัขตัวเมียได้รับวิตามินตามปริมาณที่ต้องการตลอดระยะเวลาการให้นม ตัวอย่างเช่น ปริมาณวิตามินเอในนมซึ่งจำเป็นต่อการเจริญเติบโตของลูกสุนัขนั้นขึ้นอยู่กับการมีอยู่ของวิตามินเอในอาหารของแม่เท่านั้น * ดังนั้นเจ้าของควรตรวจสอบการมีอยู่ของวิตามินนี้อย่างต่อเนื่องในอาหารของสุนัขตัวเมีย นอกจากนี้ยังใช้กับวิตามินดีและวิตามินบีซึ่งถูกขับออกมาในปริมาณมากผ่านทางนมสุนัข

ตัวเมียต้องการพลังงานเพิ่มเติมในการผลิตนมในปริมาณที่เท่ากันเช่นเดียวกับที่มีอยู่ในนมที่ขับออกมา ดังนั้นค่าพลังงานของอาหารจะขึ้นอยู่กับปริมาณน้ำนมของสุนัขตัวเมียเป็นหลัก ปริมาณแคลอรี่ของอาหารยังขึ้นอยู่กับระยะเวลาการให้นม เป็นที่ทราบกันดีว่าในสัปดาห์แรกและสัปดาห์ที่สองของการให้นม สุนัขตัวเมียจะผลิตน้ำนมน้อยกว่าในสัปดาห์ที่สามและสี่ ดังนั้นอาหารควรประกอบขึ้นในลักษณะที่ในช่วงครึ่งแรกของระยะเวลาการให้นมความเข้มของพลังงานของอาหารเพิ่มขึ้น 2 เท่าในครั้งที่สอง - 3 เท่าเมื่อเทียบกับความต้องการของสุนัขตัวเมียในสภาวะปกติ ในทางปฏิบัติดูเหมือนว่า: สำหรับการก่อตัวของนมในช่วงครึ่งแรกของการให้นมสุนัขตัวเมียที่ให้นมบุตรที่มีน้ำหนักตัว 10 กก. ต้องการอาหารเพิ่มเติมที่มีปริมาณแคลอรี่ 750 กิโลแคลอรีนอกเหนือจากอาหารหลักและใน สองสัปดาห์ถัดไป - 1500 kcal ต่อวัน

ทันทีหลังคลอด ต่อมน้ำนมของผู้หญิงจะหลั่งน้ำนมเหลืองออกมา จำเป็นต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าลูกสุนัขแรกเกิดแต่ละตัวต้องได้รับน้ำนมเหลืองที่มีแอนติบอดีจำเพาะ

แร่ธาตุมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการก่อตัวของนมซึ่งการขาดซึ่งทำให้เกิดโรค osteodystrophic ชนิดต่าง ๆ ไม่เพียง แต่ในสุนัขที่ให้นมบุตรเท่านั้น แต่ยังรวมถึงลูกหลานด้วย ในเวลาเดียวกัน กระดูกสันหลังของตัวเมียที่ให้นมบุตรจะขาดแร่ธาตุและมีรูพรุน เปราะบาง โรคกระดูกพรุนปรากฏขึ้น และโรคกระดูกอ่อนในลูกสุนัขแรกเกิด สิ่งสำคัญคือต้องป้องกันการสะสมของแร่สำรองในระหว่างตั้งครรภ์และในสุนัขตัวเมีย - ในช่วงระยะเวลาของการเจริญเติบโตและการเตรียมตัวสำหรับการให้นมครั้งแรก ตัวเมียที่ให้นมบุตรต้องการเกลือมากกว่าตัวเมียที่ไม่ให้นม

องค์ประกอบเชิงคุณภาพและความเข้มข้นของพลังงานรายวันของอาหารของตัวเมียที่ให้นมบุตรที่มีน้ำหนัก 5 กก. ในสัปดาห์แรกและสัปดาห์ที่สามและสี่ของการให้นม

องค์ประกอบเชิงคุณภาพและความเข้มข้นของพลังงานรายวันของอาหารของตัวเมียที่ให้นมบุตรที่มีน้ำหนัก 15 กก. ในสัปดาห์แรกและสัปดาห์ที่สามและสี่ของการให้นม

องค์ประกอบเชิงคุณภาพและความเข้มข้นของพลังงานรายวันของอาหารของตัวเมียที่ให้นมบุตรที่มีน้ำหนัก 25 กก. ในสัปดาห์แรกและสัปดาห์ที่สี่ที่สาม

วิธีการตรวจหาสารพิษจากเชื้อรา

วิธีการสมัยใหม่ในการตรวจหาและกำหนดปริมาณสารพิษจากเชื้อราในอาหารและอาหารสัตว์ ได้แก่ วิธีการคัดแยก วิธีการเชิงปริมาณ การวิเคราะห์ และวิธีทางชีวภาพ วิธีการ Mycotoxin กำลังพัฒนาอย่างรวดเร็วมาก จำนวนวิธีที่พัฒนาแล้วและการปรับเปลี่ยนต่างๆ มีจำนวนถึงหลายร้อยวิธีแล้วและยังคงเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่อง

วิธีการคัดกรอง โดดเด่นด้วยความเรียบง่ายและความเร็วในการวิเคราะห์ ช่วยให้คุณสามารถ "คัดแยก" ตัวอย่างที่ไม่ปนเปื้อนได้อย่างรวดเร็วและเชื่อถือได้ ซึ่งรวมถึงวิธีการที่ใช้กันทั่วไป เช่น การทดสอบคอลัมน์ขนาดเล็กสำหรับอะฟลาทอกซิน โอคราทอกซิน เอ และซีราเลโนน วิธี TLC สำหรับการตรวจหาสารพิษจากเชื้อราที่แตกต่างกันมากถึง 30 ชนิดพร้อมกัน วิธีการเรืองแสงสำหรับตรวจจับการปนเปื้อนของอะฟลาทอกซิน ฯลฯ

วิธีวิเคราะห์เชิงปริมาณสำหรับการตรวจหาสารพิษจากเชื้อราสามารถแบ่งย่อยได้เป็นสารเคมี ภูมิคุ้มกันเคมีรังสี และเอนไซม์อิมมูโนแอสเซย์ วิธีการทางเคมีเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปมากที่สุดในปัจจุบัน และรวมถึงขั้นตอนต่อเนื่องของการแยกและการหาปริมาณสารพิษจากเชื้อราที่เหมาะสม ขั้นตอนการแยกประกอบด้วยสองขั้นตอน: การสกัด - การแยกสารพิษจากเชื้อราออกจากสารตั้งต้น และการทำให้บริสุทธิ์ - การแยกสารพิษจากเชื้อราออกจากสารประกอบที่มีลักษณะทางกายภาพและทางเคมีที่คล้ายคลึงกัน การแยกสารจากเชื้อราในขั้นสุดท้ายดำเนินการโดยใช้โครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง (TLC) แบบหนึ่งหรือสองมิติบนเพลตซิลิกาเจลในระบบตัวทำละลายต่างๆ โครมาโตกราฟีแบบแก๊สและแก๊ส-ของเหลว โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง และแมสสเปกโตรเมตรี การหาปริมาณสารพิษจากเชื้อรามักจะดำเนินการโดยการเปรียบเทียบโดยตรงของความเข้มของการเรืองแสงบน TLC ในแสงอัลตราไวโอเลตกับมาตรฐานของความเข้มข้นที่ทราบ ทั้งทางสายตาและทางมิติ เพื่อปรับปรุงความน่าเชื่อถือของวิธีการ การทดสอบยืนยันต่างๆ ได้ถูกนำมาใช้ โดยพิจารณาจากการผลิตอนุพันธ์ของสารพิษจากเชื้อรา (mycotoxin) ที่มีลักษณะโครมาโตกราฟี คัลเลอร์รอเมตริก หรือฟลูออไรเมตริกอื่นๆ

ในช่วงไม่กี่ปีมานี้ มีความสนใจเพิ่มขึ้นในการพัฒนาวิธีการตรวจด้วยภูมิคุ้มกันและเคมีกัมมันตภาพรังสีที่มีความไวสูงและมีความจำเพาะสูงสำหรับการตรวจหา การระบุ และการหาปริมาณของสารพิษจากเชื้อรา วิธีการเหล่านี้มีพื้นฐานมาจากการได้รับสารต้านเชื้อราจากเชื้อรา mycotoxin ร่วมกับเซรั่มอัลบูมินจากวัว ข้อได้เปรียบของพวกเขาคือความไวเป็นพิเศษ ซึ่งทำให้สามารถตรวจจับ picograms ของ mycotoxins และดำเนินการพัฒนาไปในทิศทางของกระบวนการกำหนดโดยอัตโนมัติ วิธีการทางชีวภาพซึ่งมักจะไม่เฉพาะเจาะจงและละเอียดอ่อน ส่วนใหญ่จะใช้ในการตรวจหาสารพิษจากเชื้อราซึ่งวิธีการวิเคราะห์ทางเคมีไม่สามารถทำได้ หรือเป็นการทดสอบเพื่อยืนยัน จุลินทรีย์หลายชนิด เอ็มบริโอของสัตว์ทดลอง การเพาะเลี้ยงเซลล์และเนื้อเยื่อทำหน้าที่เป็นวัตถุทดสอบ

เพื่อตรวจสอบเนื้อหาของสารพิษจากเชื้อราในองค์ประกอบของผลิตภัณฑ์อาหาร การเตรียมตัวอย่างจะดำเนินการโดยวิธีการสกัดแบบโซลิดเฟสบนคาร์ทริดจ์เข้มข้น "Diapak" (หน้า 3.2.3) การแยก การระบุ และการกำหนดปริมาณของสารพิษจากเชื้อราในตัวอย่างที่เตรียมไว้นั้นดำเนินการโดยโครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูงบนไมโครโครมาโตกราฟีแบบไมโครคอลัมน์ของซีรีส์ Milichrome-5 ในการออกแบบโมดูลาร์ (รูปที่ 12)

ข้าว. 12. โครมาโตกราฟีแบบไมโครคอลัมน์

บทความนี้จะพิจารณา HPLC เวอร์ชันกลับเฟสสำหรับการตรวจหาพาทูลิน การตรวจจับจะดำเนินการที่ความยาวคลื่น 276 นาโนเมตร สำหรับการระบุพาทูลินที่แม่นยำนั้น ยังใช้การตรวจจับความยาวคลื่นหลายคลื่น ซึ่งทำให้สามารถใช้อัตราส่วนสเปกตรัมเป็นพารามิเตอร์การระบุเพิ่มเติมได้ การแยกจะดำเนินการในโหมดการชะแบบเกรเดียนท์ ซึ่งช่วยปรับปรุงความละเอียดและความไวของการวิเคราะห์

ข้าว. 13. โครมาโตกราฟีของเหลว:

1 - ปั๊ม; 2 – หน่วยฉีดตัวอย่าง; 3 – คอลัมน์โครมาโตกราฟี; 4 - เครื่องตรวจจับ;
5 - ระบายน้ำเพื่อชะล้างหรือสะสมเศษส่วน; 6 - นายทะเบียน (ผู้บันทึก,
ผู้ประกอบหรือคอมพิวเตอร์ส่วนบุคคล)

6
4

การวิเคราะห์ตัวอย่างโดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลว (รูปที่ 13) ดำเนินการดังนี้ ปริมาตรของสารละลายตัวอย่างที่วิเคราะห์แล้วจะถูกนำเข้าสู่ส่วนบนของคอลัมน์โครมาโตกราฟี (3) โดยใช้หน่วยฉีดตัวอย่าง (2) การใช้ปั๊ม (1) ส่วนผสมที่วิเคราะห์จะถูกปั๊มด้วยสารชะผ่านคอลัมน์โครมาโตกราฟี (3) ซึ่งส่วนผสมที่วิเคราะห์แล้วจะถูกแยกออกเป็นเศษส่วนแยกกัน (ส่วนประกอบ) ตัวชะที่ไหลจากคอลัมน์ซึ่งมีส่วนประกอบที่แยกจากกันนั้นได้รับการวิเคราะห์โดยเครื่องตรวจจับ (4) ซึ่งการอ่านจะถูกบันทึกโดยเครื่องบันทึก (6)

1. 
   รากฐานระเบียบวิธีของ HPLC

เพื่อให้เข้าใจสาระสำคัญของวิธี HPLC ที่ใช้ในการกำหนดพาทูลิน จำเป็นต้องศึกษาลักษณะระเบียบวิธีบางอย่างที่รองรับ

ซีรีส์อีลูโอทรอปิก พลังการชะของสารชะคือความสามารถของตัวชะ (ตัวทำละลายหรือของผสมของตัวทำละลาย) เพื่อแทนที่ตัวดูดซับจากพื้นผิวของตัวดูดซับ ในกรณีนี้ ยิ่งโมเลกุลของตัวชะแข็งแรงถูกดูดซับบนตำแหน่งแอคทีฟของตัวดูดซับ ยิ่งมีพลังในการชะสูงเท่านั้น ตัวทำละลายจัดเรียงเป็นแถวเพื่อเพิ่มความแข็งแรงในการชะในรูปแบบอนุกรมอิลูโอทรอปิก

ในฐานะที่เป็นสารชะสำหรับโครมาโตกราฟีแบบรีเวิร์สเฟส ของผสมตัวทำละลายที่มีน้ำและสารประกอบอินทรีย์ที่ปรับเปลี่ยนความแข็งแรงของการชะจะถูกใช้ เช่น n-alcohols, acetonitrile, tetrahydrofuran และอื่นๆ ที่สร้างสารละลายที่แท้จริงกับน้ำ ในโครมาโตกราฟีแบบเฟสปกติ โพลาโมดิฟายเออร์ถูกใช้เป็นสารชะ - ไฮโดรคาร์บอนเชิงเส้นและไซคลิก (เฮกเซน ไซโคลเฮกเซน เฮปเทน ฯลฯ)

เครื่องตรวจจับโครมาโตกราฟีของเหลว ปัจจุบันมีการพัฒนาเครื่องตรวจจับ HPLC มากกว่า 20 เครื่อง ห้าชนิดใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดสามแบบเป็นแบบออปติคัลและอีกสองแบบเป็นแบบไฟฟ้าเคมี เครื่องตรวจจับทั้งห้านี้ช่วยให้คุณสามารถวิเคราะห์สารอินทรีย์และอนินทรีย์ได้ทุกประเภท

เครื่องตรวจจับแสงประกอบด้วยเครื่องตรวจจับสเปกโตรโฟโตเมตริก (อัลตราไวโอเลต (UV) ซึ่งทำงานในช่วงความยาวคลื่น
200–360 นาโนเมตรและมองเห็นได้ด้วยช่วงความยาวคลื่น 360–780 นาโนเมตร) เครื่องตรวจจับฟลูออไรเมตริกและดัชนีการหักเหของแสง ไปจนถึงเครื่องตรวจจับไฟฟ้าเคมี - โวลแทมเมตริกและแบบนำไฟฟ้า สิ่งที่สำคัญเป็นพิเศษคือเครื่องตรวจจับมวลสารซึ่งมีเนื้อหาข้อมูลเฉพาะ เนื่องจากช่วยให้สามารถระบุส่วนประกอบที่แยกทางโครมาโตกราฟีได้โดยใช้ฐานข้อมูลของมวลสารของสาร

เครื่องตรวจจับสเปกโตรโฟโตเมตริกเป็นเครื่องตรวจจับ HPLC ที่พบบ่อยที่สุด หลักการทำงานเป็นไปตามกฎการดูดกลืนแสงของ Bouguer-Lambert-Beer ที่รู้จักกันดี เครื่องตรวจจับสเปกโตรโฟโตเมตริกจะบันทึกสเปกตรัมของการดูดกลืนแสงที่เลือกโดยสาร สเปกตรัมการดูดกลืนแสงขึ้นอยู่กับโครงสร้างของสารที่ทำการศึกษา วิธีนี้ช่วยให้คุณระบุสสารตามสเปกตรัมได้ โดยมีคลังสเปกตรัมหรือมาตรฐาน ตามกฎของ Bouguer-Lambert-Beer ความเข้มของแถบสเปกตรัมขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสาร ซึ่งเป็นพื้นฐานสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณ กล่าวคือ การกำหนดความเข้มข้นของสาร

ให้แสงสีเดียวจากแหล่งกำเนิดที่มีความเข้ม ฉัน 0 ตกลงไปในคูน้ำยาว l (เส้นทางแสง). cuvette เต็มไปด้วยสารละลายของสารที่มีความเข้มข้น จาก. สารสามารถดูดซับรังสีเอกรงค์ได้ การวัดความสามารถในการดูดซับรังสีเอกรงค์ที่กำหนดคือค่า ε คือสัมประสิทธิ์การดูดกลืนกรามหรือสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ ลำแสงที่อ่อนลงจะโผล่ออกมาจากคิวเวตต์ด้วยความเข้ม ฉัน. ตามกฎการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น λ= const

ฉัน= ฉัน 0 ∙10 -ε Cl , (7)

ที่ไหน ฉันคือ ความเข้มของฟลักซ์แสงหลังจากผ่านคิวเวตต์
ฉัน 0 คือความเข้มของฟลักซ์แสงตกกระทบ ε คือค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ จากคือความเข้มข้นของโมลาร์ของสารในคิวเวตต์ lคือความยาวของคิวเวต

ทัศนคติ ฉันถึง ฉัน 0 แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์เรียกว่า Transmission ตู่และค่า A=lg(I 0 / ฉัน) – ความหนาแน่นของแสง

A=lg(I 0 /I)= ε С∙l. (8)

ความหนาแน่นเชิงแสงของสารเป็นสัดส่วนโดยตรงกับความเข้มข้นของสารที่วิเคราะห์ ในเครื่องตรวจจับสเปกโตรโฟโตเมตริก ปริมาณการวิเคราะห์คือความหนาแน่นของแสง แต่. สูตร (8) ทำหน้าที่เป็นพื้นฐานสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณเมื่อใช้เครื่องตรวจจับสเปกโตรโฟโตเมตริก เนื่องจากความหนาแน่นของแสง แต่สารเป็นสัดส่วนโดยตรงกับความสูงหรือพื้นที่ของพีคโครมาโตกราฟี

การพึ่งพาความหนาแน่นของแสง แต่จากความยาวคลื่นของแสงที่ตกกระทบบนคิวเวตต์กับสารในช่วงความยาวคลื่น 190 ถึง 360 นาโนเมตร เรียกว่าสเปกตรัมการดูดกลืนแสงอัลตราไวโอเลต (รูปที่ 14)

200 230 260 290 320 350 λ , นาโนเมตร

แต่, f.r.p.
ข้าว. 14. สเปกตรัมการดูดกลืนแสงอัลตราไวโอเลตของสารละลายในน้ำ
สาร X

3.2.3. การเตรียมตัวอย่าง

สารใดมีความยาวคลื่นการดูดซึมสูงสุด
(λ ,นาโนเมตร). เมื่อใช้ความยาวคลื่นนี้ ตัวตรวจจับจะมีขีดจำกัดต่ำสุดในการตรวจจับสาร

การใช้เครื่องตรวจจับสเปกโตรโฟโตเมตริก (SPD) จะตรวจพบสารจำนวนมากในประเภทต่าง ๆ ที่ดูดซับแสงอัลตราไวโอเลต

การใช้เครื่องตรวจจับสเปกโตรโฟโตเมตริกในโครมาโตกราฟีช่วยให้ระบุตัวตนได้ง่ายขึ้น เครื่องตรวจจับความยาวคลื่นหลายช่วงร่วมกับซอฟต์แวร์ช่วยให้คุณได้รับโครมาโตแกรมที่ความยาวคลื่นหลายช่วงพร้อมกันและคำนวณพารามิเตอร์เพิ่มเติมสำหรับการระบุส่วนประกอบ - สเปกตรัมทัศนคติ (คิว) คืออัตราส่วนความสูงของยอดโครมาโตกราฟีที่ความยาวคลื่นต่างกัน

ที่ไหน แต่ 1 และ แต่ 2 - ค่าสัมประสิทธิ์ความหนาแน่นของแสงที่ความยาวคลื่น 1 และ 2 ค่า คิวสำหรับสารแต่ละชนิดมีลักษณะคงที่และไม่ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสาร ความแม่นยำของอัตราส่วนสเปกตรัมขึ้นอยู่กับค่าความหนาแน่นของแสงของสารและการออกแบบเครื่องตรวจจับ

การเตรียมตัวอย่างโดยใช้วิธีการสกัดแบบโซลิดเฟสบนคาร์ทริดจ์แบบเข้มข้นช่วยประหยัดเวลาและค่าแรง การสกัดด้วยโซลิดเฟสช่วยให้คุณมีสมาธิกับตัวอย่างและทำให้บริสุทธิ์จากสิ่งเจือปนที่มาพร้อมกัน รูปแบบที่ซับซ้อนของการสกัดแบบโซลิดเฟสช่วยให้สามารถใช้คาร์ทริดจ์สองตลับได้ตามลำดับ:

– ตลับความเข้มข้นสากล “DIAPAK P-Z” – ตลับแบบใช้ซ้ำได้ (ตัวอย่างสูงสุด 50 ตัวอย่าง) พร้อมชุดตัวกรองบนและล่าง (10 ชิ้น)

– ตลับอเนกประสงค์สำหรับการทำความสะอาดอย่างละเอียด “DIAPAK S” – ตลับแบบใช้แล้วทิ้ง

สำหรับ การเตรียมตลับเข้มข้น คุณต้องดำเนินการดังต่อไปนี้

สำหรับ การเตรียมตลับเข้มข้น "DIAPAK P-Z":

- ปั๊มส่วนผสมของน้ำ - อะซิโตไนไตรล์ (58:42) 10 มล. ผ่านตลับ

– ทันทีก่อนเตรียมตัวอย่าง ให้ปั๊มน้ำกลั่น 10 มล. ผ่านตลับ

สำหรับ การเตรียมตลับความเข้มข้น “ไดอาแพ็ค เอส”:

- ปั๊มน้ำมันเบนซิน 5 มล. ผ่านตลับแล้วเสียบตลับที่ปลายทั้งสองข้าง

การเตรียมผลิตภัณฑ์อาหารให้มีความเข้มข้น

วางตัวอย่างที่มีน้ำหนัก 10.0 กรัมลงในบีกเกอร์แก้ว ผสมกับน้ำกลั่นจำนวนเล็กน้อย และถ่ายโอนในเชิงปริมาณไปยังขวดปริมาตรขนาด 50 มล. เติมสารละลาย Carrez I 6.0 มล. และสารละลาย Carrez II ลงในขวด นำเนื้อหาของขวดไปที่เครื่องหมายด้วยน้ำกลั่น ผสมให้ละเอียดแล้วกรองลงในกระบอกสูบที่ไล่ระดับผ่านตัวกรองแบบจีบกระดาษ วัดปริมาตรของแผ่นกรองใส P.

เมื่อเตรียมน้ำผลไม้และเครื่องดื่มที่ให้ความกระจ่าง ให้กรองตัวอย่างผ่านตัวกรองกระดาษที่มีความหนาแน่นจนกระทั่งได้ตัวกรอง P ใส 20 มล.

ความเข้มข้นของตัวอย่างบนตลับ "DIAPAK P-Z"

ใช้ปริมาตรทั้งหมดของตัวกรอง P กับคาร์ทริดจ์ที่เตรียมไว้ก่อนหน้านี้ในอัตรา 1-2 หยดต่อวินาที

ล้างตลับด้วยน้ำกลั่น 5 มล. ทิ้งการล้างทั้งหมด

นำพาทูลินออกจากตลับเอทิลอะซิเตท 10 มล. ลงในขวดหรือหลอดปริมาตรที่มีฝาปิดซึ่งมีปริมาตร 5 มล.
สารละลายโซเดียมคาร์บอเนตในน้ำ 1.5% จุกปิด ผสมให้เข้ากันแล้วปล่อยให้ผลัดเซลล์ผิวออก

ประกอบคอลัมน์ทำให้แห้งโดยเติมตัวเรือนตัวกรองด้วยโซเดียมซัลเฟตปราศจากน้ำประมาณ 2 กรัม อัดสารทำแห้งให้แน่นโดยแตะที่ผนังของเสาแล้วยึดด้วยสำลีก้าน

เทชั้นเอทิลอะซิเตตด้านบนด้วยปิเปต กรองผ่านคอลัมน์ทำให้แห้ง รวบรวมตัวกรองในขวดรูปหัวใจขนาด 50 มล. แยกสารละลายโซเดียมคาร์บอเนตที่เป็นน้ำออกก่อนด้วย 10 มล. แล้วตามด้วยเอทิลอะซิเตต 5 มล. และหลังจากแยกแล้ว กรองปริมาตรที่รินออกของเอทิลอะซิเตตอย่างต่อเนื่องผ่านคอลัมน์การทำให้แห้งลงในขวดเดียวกัน

ระเหยเอทิลอะซิเตทในสุญญากาศที่อุณหภูมิไม่เกิน 40°C เป็นปริมาตรประมาณ 0.5 มล. (ห้ามระเหยจนแห้ง!) เติมเบนซีน 2.5 มล. (สังเกตอัตราส่วน 1:5)

การทำความสะอาดตัวอย่างบนตลับหมึก "DIAPAK S"

ถอดฝาครอบออกจากคาร์ทริดจ์ที่เตรียมไว้และส่งสารละลายตัวอย่างเบนซีน-เอทิลอะซิเตตในอัตรา 1-2 หยดต่อวินาที ล้างขวดด้วยเบนซีน-เอทิล อะซิเตท (85:15) อีก 0.5-1.0 มล. และทาลงบนตลับหมึก ทิ้งการซัก

ขจัดพาทูลินออกจากคาร์ทริดจ์ขนาด 6 มล. ด้วยเบนซีน:เอทิล อะซิเตต (7:3) รวบรวมสารที่ชะลงในขวดสำหรับปอกแกน

ระเหยสารชะให้แห้งในอ่างที่มีอากาศแห้งที่อุณหภูมิไม่เกิน 40°C

โดยทันที! หลังจากการระเหย ให้ละลายตัวอย่างอีกครั้งในสารชะ A 0.2–0.25 มล. (ส่วนที่ 3.2.4.2) ทิ้งไว้ให้เย็นถึง 5–8°C

3.2.4. สั่งงาน

วัตถุประสงค์– การกำหนดปริมาณของ mycotoxin patulin ในองค์ประกอบของผลิตภัณฑ์อาหารโดยโครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูงบน microcolumn chromatograph ของ Milichrome-5 series

3.2.4.1. เทคนิคการวัด

การวัดรวมถึงขั้นตอนหลักดังต่อไปนี้:

- การสอบเทียบโครมาโตกราฟีตามสารละลายที่มีความเข้มข้นของมวลสารพาทูลินที่ทราบ

- การเตรียมตัวอย่างอาหารโดยวิธีการสกัดด้วยสถานะของแข็งตามย่อหน้า 3.2.3;

– การวิเคราะห์สารสกัดโดย HPLC พร้อมการลงทะเบียนสัญญาณโดยเครื่องตรวจจับ UV

– การระบุพาทูลินด้วยพารามิเตอร์การกักเก็บและอัตราส่วนสเปกตรัม

– การคำนวณความเข้มข้นของมวลของพาทูลินในตัวอย่างตามสัญญาณวิเคราะห์ที่ลงทะเบียนไว้ (ความสูงสูงสุด) และกราฟการสอบเทียบ

- การคำนวณเศษส่วนมวลของพาทูลินในองค์ประกอบของผลิตภัณฑ์อาหาร

เครื่องมือ รีเอเจนต์และวัสดุจำเป็นต้องทำงาน:

– โครมาโตกราฟีของซีรีส์ Milichrome-5 หรือโครมาโตกราฟี HPLC อื่นๆ ที่มีซอฟต์แวร์ WinXrom หรือ Multichrome

– คอลัมน์โครมาโตกราฟี HPLC: Diasfer–110–С10СN (5 µm, 2×80 mm, TU 4215–001–05451931–94);

– เครื่องจ่ายปริมาตรแบบปรับได้สำหรับ 1-100 µl;

– เครื่องจ่ายปริมาตรแบบปรับได้สำหรับ 100–1000 µl;

- กระติกน้ำทรงกรวยที่มีส่วนบาง ๆ บดแน่นที่มีความจุสูงถึง 10 มล.

– ตัวกรองเมมเบรน

- ชุดสารละลายมาตรฐานของ patulin ที่มีความเข้มข้น 1, 2, 5 และ 10 มก./ล.

- กรดฟอสฟอริก 85%;

– อะซิโตไนไทรล์สำหรับโครมาโตกราฟีของเหลว (ข้อกำหนดความบริสุทธิ์พิเศษ TU 6–09–3513–86, การดูดซับรังสียูวีสูงถึง 200 นาโนเมตร);

– เฮกเซน, บริสุทธิ์ทางเคมี (แก้ไข);

– กรดไตรฟลูออโรอะซิติก

– สารละลาย Carrez I – ละลายโพแทสเซียม hexacyanoferate II 15.0 กรัมในน้ำ 100 มล.

- สารละลาย Carrez II - ละลายซิงค์อะซิเตท 30.0 กรัมในน้ำ 100 มล.

- สารชะ A, B และ C

การเตรียมสารชะ

อีลูเอนท์ เอ เติม acetonitrile 20 มล. และ 0.5 มล. ของสารละลาย 10% ของกรดไตรฟลูออโรอะซิติก 10% ลงในขวดปริมาตรที่มีส่วนแก้วบดแน่นที่มีความจุ 100 มล. ผสมสารละลายให้ละเอียดและนำไปที่เครื่องหมายด้วยน้ำกลั่น ซึ่งก่อนหน้านี้กรองผ่านตัวกรองเมมเบรนไนลอน (0.2 µm) จากนั้น สารชะจะถูกขจัดแก๊สออกโดยการอพยพเป็นเวลา 1 นาที ที่ความเข้มข้น 1 กก.∙วินาที/ซม. 2

สารชะ B และ C เตรียมในลักษณะเดียวกับสารชะ A ใช้ acetonitrile เพียง 10 และ 0 มล. ต่อสารละลาย 100 มล. ตามลำดับ

3.2.4.2. การตั้งค่าโหมดการแยกโครมาโตกราฟี
และการลงทะเบียนผล

ในการดำเนินการวัด จำเป็นต้องตั้งค่าโหมดการทำงานของโครมาโตกราฟี

โหมดเครื่องจ่าย:

– การฟื้นฟู – 300 ไมโครลิตร;

– ปริมาตรของตัวอย่าง – 5 µl;

– ปริมาณการใช้สารชะ – 150 ไมโครลิตร/นาที;

– โหมดการชะแบบเกรเดียนท์: 800 µl – ตัวชะ A,
500 µl - ตัวชะ B, 300 µl - ตัวชะ C;

- อุณหภูมิเทอร์โมสตัท - 35 0 С.

โหมดการตรวจจับ:

– จำนวนความยาวคลื่น – 3;

– ความยาวคลื่น – 250, 276, 290 นาโนเมตร;

– เวลาในการวัด – 0.04 วินาที

การปรับสภาพของระบบโครมาโตกราฟีจะดำเนินการ 30 นาทีก่อนการวัดโดยทำการวิเคราะห์แบบ "ว่างเปล่า" ซึ่งส่วนผสมมาตรฐานที่มีพาทูลินจะถูกแทนที่ด้วยตัวชะ 5-10 ไมโครลิตร จากนั้นจึงแยกส่วนผสมมาตรฐานของสารพิษจากเชื้อราออกจากกัน

แบบฝึกหัดที่ 1 เพื่อศึกษาวิธีการเตรียมตัวอย่างผลิตภัณฑ์อาหารเพื่อหาปริมาณพาทูลิน เตรียมตัวอย่างตามวรรค 3.2.3

ภารกิจที่ 2 ปรับเทียบโครมาโตกราฟี โครมาโตกราฟีได้รับการสอบเทียบโดยการแนะนำสารละลายมาตรฐานของพาทูลินที่มีความเข้มข้น 1, 2, 5 และ 10 มก./ลิตรตามลำดับ

ภายใต้การแนะนำของครู ขอเสนอให้ป้อนพารามิเตอร์ของการแยกโครมาโตกราฟี (ข้อ 3.2.4.3) จากแป้นพิมพ์ PC ลงในโปรแกรม (WinXrom) และเริ่มการวิเคราะห์โครมาโตกราฟี 2-4 รายการในโหมดอัตโนมัติ ผลลัพธ์จะถูกนำเสนอในรูปแบบของตาราง 6.

T a b l e 6

บนพื้นฐานของโปรไฟล์โครมาโตกราฟีที่ได้รับ ให้สร้างกราฟการสอบเทียบ (ความเข้มข้นจะถูกพล็อตตามแกนพิกัด - มก. / ล. ตามแกน abscissa คือความหนาแน่นทางแสงของสารพิษจากเชื้อรา แต่– ส.ป.ช.)

ภารกิจที่ 3 ระบุ patulin ในตัวอย่างทดสอบของผลิตภัณฑ์อาหารและกำหนดความเข้มข้น

ภายใต้การแนะนำของครู ให้เริ่มการวัดตัวอย่างผลิตภัณฑ์อาหารที่เตรียมไว้ในโหมดอัตโนมัติ
(โดยเลือกพารามิเตอร์การแยกโครมาโตกราฟีในงานที่ 2) เมื่อการวัดเสร็จสิ้น ให้ระบุ mycotoxin patulin ตามไฟล์มาตรฐาน (“StandardDD-MM-YY.001”) ที่ได้รับในงานที่ 2 โดยใช้กราฟการสอบเทียบที่สร้างขึ้นในงาน 2 กำหนดความเข้มข้นของ patulin ในตัวอย่างอาหาร

บันทึกผลลัพธ์ในตาราง 7.

ตารางที่ 7

ความเข้มข้นมวลของพาทูลินในตัวอย่างอาหารคำนวณโดยสูตร

ที่ไหน จาก– ความเข้มข้นมวลของพาทูลินในตัวอย่าง มก./ล. (คำนวณจากการขึ้นต่อกันของการสอบเทียบ ตามความสูงของพีคเชิงวิเคราะห์) วี พี คือปริมาตรตัวอย่าง ml; R - ระดับการสกัดสารพิษจากเชื้อราในขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง (เท่ากับ 60%) เอ็ม pr คือมวลของตัวอย่างผลิตภัณฑ์อาหารที่ใช้สำหรับการทำให้บริสุทธิ์และการกำหนดด้วยโครมาโตกราฟีในภายหลัง g

ผลลัพธ์ของการวัดเศษส่วนมวลของสารพิษจากเชื้อราในวัตถุที่หาได้แสดงในรูปแบบต่อไปนี้: X±  มก./กก.; ที่ R\u003d 0.95 และบันทึกไว้ในโปรโตคอล (ภาคผนวก 1) โดยที่ X ผม , คือความเข้มข้นของมวลของพาทูลินในตัวอย่าง มก./กก. R- ความน่าจะเป็น; เ คือขีดจำกัดความคลาดเคลื่อนสัมบูรณ์ คำนวณโดยสูตร

หลังจากได้รับผลลัพธ์แล้วจำเป็นต้องประเมินค่าของมาตรฐานสำหรับการควบคุมการปฏิบัติงานของการบรรจบกันซึ่งกำหนดไว้ใน GOST ที่เกี่ยวข้องสำหรับวิธีควบคุม (วิเคราะห์)

ทำการสรุปเกี่ยวกับการปฏิบัติตาม (หรือการไม่ปฏิบัติตาม) ของเนื้อหาของพาทูลินในผลิตภัณฑ์อาหารที่ศึกษาโดยมีระดับที่อนุญาตซึ่งกำหนดโดย SanPiN 2.3.2.1078–01

คำถามเพื่อการควบคุมตนเอง

1. หลักการใดบ้างที่สนับสนุนการจำแนกประเภทของวิธีการวิเคราะห์ด้วยโครมาโตกราฟี

2. สาระสำคัญของการแยกด้วยโครมาโตกราฟีคืออะไร? การระบุเชิงคุณภาพและการวิเคราะห์เชิงปริมาณดำเนินการอย่างไร?

3. ผลิตภัณฑ์อาหารชนิดใดที่มีสารพิษจากเชื้อรา? สารพิษจากเชื้อราชนิดใดที่กำหนดในองค์ประกอบของผลิตภัณฑ์อาหารตามข้อกำหนดของ SanPiN

4. วิธีใดที่ใช้โครมาโตกราฟีเพื่อตรวจสอบเนื้อหาของสารพิษจากเชื้อราในผลิตภัณฑ์อาหาร

5. การตรวจจับด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริกมีพื้นฐานมาจากอะไร? อัตราส่วนสเปกตรัมคืออะไรและใช้ทำอะไร?

6. การเตรียมตัวอย่างอาหารดำเนินการอย่างไรเพื่อกำหนดเนื้อหาของพาทูลินโดย HPLC?

7. การดำเนินการใดบ้างที่รวมอยู่ในวิธี HPLC ในการตรวจหา patulin?

8. ตัวชะและการชะแบบเกรเดียนต์คืออะไร? HPLC ใช้สารชะอะไรบ้างในการหาพาทูลิน

9. patulin ระบุและวัดได้อย่างไร?

10. ความแม่นยำในการตรวจวัด HPLC ของพาทูลินเป็นอย่างไร?

วิธีการตรวจหาสารพิษจากเชื้อรา

วิธีการสมัยใหม่ในการตรวจหาและกำหนดปริมาณสารพิษจากเชื้อราในอาหารและอาหารสัตว์ ได้แก่ วิธีคัดกรอง วิธีวิเคราะห์เชิงปริมาณและวิธีทางชีวภาพ

วิธีการคัดกรองรวดเร็วและสะดวกสำหรับการวิเคราะห์แบบอนุกรม ช่วยให้คุณสามารถแยกตัวอย่างที่ปนเปื้อนและที่ไม่ปนเปื้อนได้อย่างรวดเร็วและเชื่อถือได้ วิธีการคัดกรองรวมถึงโครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง (วิธี TLC) วิธีเรืองแสงสำหรับการตรวจหาเมล็ดพืชที่ปนเปื้อนด้วยอะฟลาทอกซิน

วิธีการวิเคราะห์เชิงปริมาณสำหรับการตรวจหาสารพิษจากเชื้อราจะแสดงด้วยวิธีการทางเคมี ภูมิคุ้มกันทางรังสี และเอนไซม์อิมมูโนแอสเซย์ ทุกวันนี้ วิธีที่ใช้กันมากที่สุดคือวิธีการทางเคมี ซึ่งรวมถึงสองขั้นตอน: ระยะการแยกและระยะของการกำหนดปริมาณสารพิษจากเชื้อรา ขั้นตอนการแยกรวมถึงการสกัด (การแยกสารพิษจากเชื้อราออกจากสารตั้งต้น) และการทำให้บริสุทธิ์ (การแยกสารพิษจากเชื้อราออกจากสารประกอบที่มีลักษณะทางกายภาพและทางเคมีที่คล้ายคลึงกัน) การแยกและการหาปริมาณสารพิษจากเชื้อราขั้นสุดท้ายดำเนินการโดยใช้วิธีโครมาโตกราฟีแบบต่างๆ วิธีการที่เป็นสากลสำหรับการตรวจหาสารพิษจากเชื้อราทุกชนิดคือ thin layer chromatography (TLC)

เมื่อสุ่มตัวอย่างจากชุดผลิตภัณฑ์ วัตถุประสงค์หลักคือเพื่อให้ได้ตัวอย่างโดยเฉลี่ยหรือตัวอย่างเฉลี่ยที่เป็นตัวแทนของชุดผลิตภัณฑ์ทั้งหมดในแง่ของความเข้มข้นของสารพิษจากเชื้อรา (ตัวอย่างที่นำมาควรบ่งบอกถึงคุณภาพของชุดผลิตภัณฑ์ทั้งหมด) การปฏิบัติตามภารกิจนี้ขึ้นอยู่กับลักษณะและการกระจายของสารพิษจากเชื้อรา ลักษณะของผลิตภัณฑ์ (ดิบ แปรรูป ไหลอย่างอิสระ ของเหลว แป้งเปียก ฯลฯ) วิธีการเตรียมตัวอย่าง ตัวอย่างเช่น การปนเปื้อนของถั่วลิสงด้วยอะฟลาทอกซินมีลักษณะต่างกันอย่างชัดเจน: ในเมล็ดถั่วลิสงแต่ละเมล็ด เนื้อหาของเมล็ดถั่วลิสงอาจแตกต่างกันตั้งแต่หนึ่งในพันของมิลลิกรัมไปจนถึงสิบหรือมากกว่ามิลลิกรัมต่อ 1 กิโลกรัม กล่าวคือ แตกต่างกัน 5-6 ลำดับของขนาด ด้วยเหตุผลนี้ ข้อผิดพลาดในการสุ่มตัวอย่างมีส่วนทำให้เกิดข้อผิดพลาดในการวิเคราะห์โดยรวมในการหาอะฟลาทอกซินในถั่วลิสงเป็นสาเหตุหลัก และในบางกรณีอาจมีมากกว่า 90%

จากมุมมองของความสม่ำเสมอของการปนเปื้อนของสารพิษจากเชื้อรา ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดสามารถแบ่งออกเป็นสองกลุ่ม: 1) ผลิตภัณฑ์ที่มีความแตกต่างกันในระดับสูง (ถั่วลิสงที่ปอกเปลือกและแกะเปลือก เมล็ดพืชน้ำมัน เมล็ดพืชทั้งเมล็ดหรือหยาบ ถั่ว); 2) ผลิตภัณฑ์ที่มีการปนเปื้อนอย่างสม่ำเสมอ (ของเหลว: นม, น้ำมันพืช, น้ำผลไม้, น้ำซุปข้น, แป้ง, อาหารบด)

เพื่อให้ได้ตัวอย่างผลิตภัณฑ์โดยเฉลี่ยของกลุ่มที่ l ขนาดของตัวอย่างเริ่มต้นควรมีขนาดใหญ่ที่สุด (อย่างน้อย 2 กก.) ในขณะที่ตัวอย่างในห้องปฏิบัติการโดยเฉลี่ยควรแยกออกจากตัวอย่างเฉลี่ยพื้นดิน (ที่เป็นเนื้อเดียวกัน) .

สำหรับผลิตภัณฑ์ที่เป็นเนื้อเดียวกันของกลุ่มที่ 2 (แยม แยมผิวส้ม น้ำผลไม้ในภาชนะดีบุกขนาดเล็ก นมข้นหวาน ผลิตภัณฑ์นมแห้ง ฯลฯ) ควรเก็บตัวอย่างในจำนวนหน่วยบรรจุภัณฑ์ที่สอดคล้องกับขนาดของตัวอย่างโดยเฉลี่ย (100 -200 กรัม) โดยมีเงื่อนไขว่าผลิตภัณฑ์มาจากชุดเดียวกัน

วิธีการทางเคมีสำหรับการตรวจจับและระบุอะฟลาทอกซินแต่ละตัวนั้นอิงจากการเรืองแสงจำเพาะของพวกมันในแสงยูวี (ประมาณ 365 นาโนเมตร) กับความแตกต่างในการเคลื่อนย้ายในโครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง เกี่ยวกับความจำเพาะของการดูดกลืนแสงและสเปกตรัมของฟลูออเรสเซนส์

Trichothecenes ไม่มีการดูดซึมหรือการเรืองแสงในส่วนที่มองเห็นได้ของสเปกตรัมต่างจากอะฟลาทอกซิน ซึ่งทำให้ยากต่อการตรวจจับพวกมันด้วยโครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง ในเวลาเดียวกัน TLC สามารถตรวจพบไตรโคธีซีนโดยใช้วิธีการที่อิงตามการบำบัดเพลต TLC ด้วยรีเอเจนต์พิเศษที่ก่อรูปอนุพันธ์ที่มีสีหรือฟลูออเรสเซนต์ที่มีไตรโคธีซีน ตัวอย่างเช่น สารพิษ T -2 เมื่อแปรรูปเพลท กรดซัลฟิวริกเข้มข้นทำให้เกิดจุดที่มีสารเรืองแสงสีน้ำเงิน) ในแสงยูวี

วิธีการอนุญาโตตุลาการสำหรับการวัดปริมาณสารพิษจากเชื้อรามีดังนี้:

‣‣‣ โครมาโตกราฟีแบบแก๊สและของเหลว (สำหรับ T-2 toxin);

‣‣‣ โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) โดยใช้เครื่องตรวจจับแสงยูวี (สำหรับดีออกซีนิวาเลนอลและพาทูลิน)

‣‣‣ HPLC โดยใช้เครื่องตรวจจับเรืองแสง (สำหรับอะฟลาทอกซิน และซีราเลโนน)

ในรูป 2 แสดงอุปกรณ์ของโครมาโตกราฟีของเหลวที่ทันสมัยในการออกแบบที่ง่ายที่สุด

เฟสเคลื่อนที่จากถัง 1 ถึงตัวกรองทางเข้า 9 ถูกจ่ายโดยปั๊มแรงดันสูง 2 ไปยังระบบอินพุตตัวอย่าง 3 - หัวฉีดแบบแมนนวลหรือเครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติ ซึ่งจะมีการแนะนำตัวอย่างด้วย จากนั้นผ่านตัวกรอง 8 ตัวอย่างที่มีกระแสของเฟสเคลื่อนที่เข้าสู่คอลัมน์แยก 4 ผ่านพรีคอลัมน์ จากนั้นการไหลของเฟสเคลื่อนที่ออกจากคอลัมน์และบรรจุส่วนประกอบของส่วนผสมที่จะแยกออก (ชะงัก) เข้าสู่เครื่องตรวจจับ 5 และถูกนำออกจากถังน้ำล้น 7 เมื่อตัวชะไหลผ่านการวัดลูปของเครื่องตรวจจับ โครมาโตแกรมจะถูกลงทะเบียนและข้อมูลจะถูกโอนไปยังเครื่องบันทึก 6 หรือไปยังคอมพิวเตอร์

อุปกรณ์โครมาโตกราฟีของเหลว (ระบบไอโซเครติก):

1 - ความจุ; 2 - ระบบแรงดันสูง 3 - หัวฉีดแบบแมนนวลหรือเครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติ; 4 - แยกคอลัมน์; 5 - เครื่องตรวจจับ; b - นายทะเบียนหรือคอมพิวเตอร์ 7 - ถังระบายน้ำ; 8 - ตัวกรอง; 9 - ตัวกรองอินพุต

ระบบที่แสดงในรูป 2 เป็นไอโซเครติก: องค์ประกอบของเฟสเคลื่อนที่ไม่เปลี่ยนแปลงระหว่างโครมาโตกราฟี หากในระหว่างการวิเคราะห์ด้วยโครมาโตกราฟี การเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของส่วนประกอบตั้งแต่หนึ่งส่วนประกอบขึ้นไปของเฟสเคลื่อนที่เป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่ง แสดงว่าระบบที่ใช้เกรเดียนต์นั้นถูกใช้ โดยปกติแล้วจะประกอบด้วยปั๊มสองตัวหรือมากกว่า ในกรณีของการไล่ระดับด้วยเกรเดียนท์ ตัวทำละลายแต่ละตัวจะถูกป้อนจากภาชนะที่แยกจากกันเข้าไปในห้องผสมพิเศษด้วยเครื่องกวนแบบแม่เหล็ก โดยจะผสมด้วยอัตราส่วนปริมาตรที่กำหนดตามโปรแกรมบางโปรแกรม

สำหรับการวิเคราะห์สารพิษจากเชื้อรา มักใช้ระบบเกรเดียนต์ ซึ่งสารละลายของอะซิโตไนไทรล์ในน้ำที่มีความเข้มข้นที่เปลี่ยนแปลงเชิงเส้นตามเวลาถูกใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่

คอลัมน์โครมาโตกราฟีเป็นท่อโลหะที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 150 ถึง 250 มม. โดยมีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 4.6 มม. ซึ่งเต็มไปด้วยตัวดูดซับพิเศษที่มีซิลิกาเจลที่มีอนุมูลไฮโดรคาร์บอนต่อกิ่ง เสาป้องกันทำหน้าที่ปกป้องคอลัมน์โครมาโตกราฟีจากการปนเปื้อน

เครื่องตรวจจับแสงยูวีเป็นเครื่องตรวจจับ HPLC ชนิดทั่วไป หลักการทำงานของเครื่องตรวจจับคล้ายกับเครื่องวัดสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ทั่วไป โดยจะบันทึกความหนาแน่นของแสงของสารละลาย ข้อแตกต่างคือเครื่องตรวจจับรังสียูวีเป็นเครื่องตรวจจับการไหล แทนที่จะใช้คิวเวตต์ที่มีสารละลาย จะใช้เซลล์โฟโตเมตริก กระแสการชะไหลผ่านเซลล์ทำงาน และเฟสโมบายล์บริสุทธิ์ไหลผ่านเซลล์อ้างอิง แหล่งกำเนิดแสงคือหลอดปรอทซึ่งผลิตรังสี UV อย่างเข้มข้น แสงที่มีความยาวคลื่นที่ต้องการจะถูกเลือกโดยใช้ฟิลเตอร์ออปติคัลที่เหมาะสม ผ่านเซลล์ ถูกดูดซับบางส่วนโดยโมเลกุลของเฟสเคลื่อนที่และส่วนประกอบที่จะแยกจากกัน และถูกจับโดยเครื่องตรวจจับแสง การดูดกลืนแสง (ความหนาแน่นของแสง) ของสารชะจะถูกบันทึกอย่างต่อเนื่องโดยเครื่องบันทึกแผนภูมิหรือคอมพิวเตอร์ บันทึกโครมาโตแกรม ส่วนประกอบที่แยกจากกันของของผสม (เช่น สารพิษจากเชื้อรา) จะแสดงในโครมาโตแกรมเป็นยอด ตำแหน่งของพีคบนโครมาโตแกรมใช้เพื่อระบุสาร และพื้นที่พีคใช้สำหรับหาปริมาณ

อุปกรณ์ที่ซับซ้อนมากขึ้นคือเครื่องตรวจจับฟลูออเรสเซนต์ (fluorimetric)
โฮสต์บน ref.rf
เครื่องตรวจจับดังกล่าวใช้ประโยชน์จากความสามารถของสารประกอบอินทรีย์ โดยเฉพาะอะฟลาทอกซินและซีราลีโนน ในการเรืองแสงเมื่อสัมผัสกับรังสียูวีหรือแสงที่มองเห็นได้ เครื่องตรวจจับฟลูออเรสเซนต์มีโฟลว์เซลล์ที่มีช่องแสงตั้งฉากกันสองช่อง หนึ่งในนั้นทำหน้าที่จัดหารังสีที่น่าตื่นเต้น ส่วนอีกส่วนช่วยวัดความเข้มของแสงเรืองแสง ในกรณีของการวิเคราะห์อะฟลาทอกซิน B 1 และ M 1 ความยาวคลื่นที่กระตุ้นคือ 360 นาโนเมตร และความยาวคลื่นที่ปล่อยออกมาคือ 420 นาโนเมตร

ควรสังเกตว่าเครื่องตรวจจับรังสียูวีสามารถใช้สำหรับการวิเคราะห์อะฟลาทอกซินได้ แต่ความไวของเครื่องตรวจจับมีลำดับความสำคัญต่ำกว่าเครื่องตรวจจับฟลูออไรด์ ดังนั้น การตรวจจับการเรืองแสงจึงเป็นที่นิยมในการวิเคราะห์อะฟลาทอกซินที่มีความเข้มข้นต่ำ (ที่ MPC ระดับและต่ำกว่า)

วิธีการกำหนดสารพิษจากเชื้อรา - แนวคิดและประเภท การจำแนกประเภทและคุณสมบัติของหมวดหมู่ "วิธีการตรวจหาสารพิษจากเชื้อรา" 2017, 2018

GOST 32835-2014

มาตรฐานอินเตอร์สเตท

ผลิตภัณฑ์น้ำผลไม้

การหาปริมาณสารพิษจากเชื้อราโดยใช้โครมาโตกราฟี-แมสสเปกโตรเมตรีที่มีประสิทธิภาพสูงควบคู่ (HPLC-MS/MS)

ผลิตภัณฑ์น้ำผลไม้ การหาปริมาณสารพิษจากเชื้อราโดยใช้แมสสเปกโตรเมตรีของเหลวประสิทธิภาพสูงควบคู่ (HPLC-MS/MS)

MKS 67.080.01

วันที่แนะนำ 2016-01-01

คำนำ

เป้าหมาย หลักการพื้นฐาน และขั้นตอนพื้นฐานสำหรับการทำงานเกี่ยวกับมาตรฐานระหว่างรัฐนั้นกำหนดโดย GOST 1.0-92 "ระบบมาตรฐานระหว่างรัฐ ข้อกำหนดพื้นฐาน" และ GOST 1.2-2009 "ระบบมาตรฐานระหว่างรัฐ มาตรฐานระหว่างรัฐ กฎและคำแนะนำสำหรับการกำหนดมาตรฐานระหว่างรัฐ กฎการพัฒนา การรับบุตรบุญธรรม การสมัคร การต่ออายุ และการยกเลิก

เกี่ยวกับมาตรฐาน

1 พัฒนาโดยสถาบันการศึกษาระดับอุดมศึกษาของรัฐบาลกลาง "Moscow State University of Food Production" (FGBOU VPO "MGUPP")

2 แนะนำโดยหน่วยงานของรัฐบาลกลางสำหรับกฎระเบียบทางเทคนิคและมาตรวิทยา

3 รับรองโดย Interstate Council for Standardization, Metrology and Certification (นาทีที่ 25 มิถุนายน 2014 N 45-2014)

โหวตให้ยอมรับ:

ชื่อย่อของประเทศตาม MK (ISO 3166) 004-97		ชื่อย่อของหน่วยงานมาตรฐานแห่งชาติ
อาร์เมเนีย		กระทรวงเศรษฐกิจแห่งสาธารณรัฐอาร์เมเนีย
เบลารุส		มาตรฐานแห่งสาธารณรัฐเบลารุส
คีร์กีซสถาน		มาตรฐานคีร์กีซ
รัสเซีย		รอสสแตนดาร์ต

4 ตามคำสั่งของหน่วยงานกลางสำหรับกฎระเบียบทางเทคนิคและมาตรวิทยา ลงวันที่ 19 สิงหาคม 2014 N 896-st GOST 32835-2014 มีผลบังคับใช้เป็นมาตรฐานแห่งชาติของสหพันธรัฐรัสเซียตั้งแต่วันที่ 1 มกราคม 2016

5 มาตรฐานนี้ได้รับการพัฒนาโดยคำนึงถึงข้อกำหนดของเอกสารระหว่างประเทศดังต่อไปนี้:

- CODEX STAN 247-2005* มาตรฐานทั่วไปของ Codex สำหรับน้ำผลไม้และน้ำหวานของคณะกรรมการ Codex Alimentarius;
________________
* สามารถเข้าถึงเอกสารระหว่างประเทศและต่างประเทศที่กล่าวถึงต่อไปนี้ในข้อความสามารถรับได้โดยคลิกที่ลิงค์ไปยังเว็บไซต์ http://shop.cntd.ru - หมายเหตุของผู้ผลิตฐานข้อมูล


- ระเบียบของคณะกรรมาธิการสหภาพยุโรป 23.02.206 r. ไม่. 406/2006/EC กำหนดวิธีการสุ่มตัวอย่างและวิธีการวิเคราะห์สำหรับการควบคุมระดับสารพิษจากเชื้อราในอาหารอย่างเป็นทางการสำหรับการควบคุมระดับสารพิษจากเชื้อราในอาหารอย่างเป็นทางการ");

- หลักปฏิบัติ AIJN สำหรับการประเมินคุณภาพและความถูกต้องของน้ำผลไม้และน้ำผักของสมาคมน้ำผลไม้แห่งยุโรป

6 เปิดตัวครั้งแรก


ข้อมูลเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงมาตรฐานนี้เผยแพร่ในดัชนีข้อมูลประจำปี "มาตรฐานแห่งชาติ" และข้อความของการเปลี่ยนแปลงและแก้ไข - ในดัชนีข้อมูลรายเดือน "มาตรฐานแห่งชาติ" ในกรณีที่มีการแก้ไข (เปลี่ยน) หรือยกเลิกมาตรฐานนี้ ประกาศที่เกี่ยวข้องจะได้รับการตีพิมพ์ในดัชนีข้อมูลรายเดือน "มาตรฐานแห่งชาติ" ข้อมูลที่เกี่ยวข้องการแจ้งเตือนและข้อความจะถูกโพสต์ในระบบข้อมูลสาธารณะ - บนเว็บไซต์อย่างเป็นทางการของ Federal Agency for Technical Regulation และ Metrology บนอินเทอร์เน็ต

1 พื้นที่ใช้งาน

1 พื้นที่ใช้งาน

มาตรฐานนี้ใช้กับน้ำผลไม้และผลิตภัณฑ์น้ำผลไม้อื่นๆ จากผักและผลไม้ ยกเว้นเซลล์ผลไม้รสเปรี้ยว และกำหนดวิธีการสำหรับการตรวจวัดสารพิษจากเชื้อรา - พาทูลินและโอคราทอกซิน เอ - โดยใช้โครมาโทมัสสเปกโตรเมทรีเหลวที่มีประสิทธิภาพสูงควบคู่กันในช่วงการวัดของ ความเข้มข้นของมวลของ patulin ตั้งแต่ 0.1 ถึง 100.0 µg/dm และ ochratoxin A ตั้งแต่ 0.1 ถึง 20.0 µg/dm

หมายเหตุ แนะนำให้ใช้มาตรฐานสากลนี้เพื่อวัตถุประสงค์ในการอนุมัติและสะสมข้อมูลเพิ่มเติมในแง่ของการใช้

2 การอ้างอิงเชิงบรรทัดฐาน

มาตรฐานนี้ใช้การอ้างอิงเชิงบรรทัดฐานกับมาตรฐานระหว่างรัฐต่อไปนี้:

GOST 12.1.004-91 ระบบมาตรฐานความปลอดภัยในการทำงาน ความปลอดภัยจากอัคคีภัย ข้อกำหนดทั่วไป

GOST 12.1.007-76 ระบบมาตรฐานความปลอดภัยในการทำงาน การจำแนกประเภทและข้อกำหนดด้านความปลอดภัยทั่วไป

GOST 12.1.010-76 ระบบมาตรฐานความปลอดภัยในการทำงาน ความปลอดภัยจากการระเบิด ข้อกำหนดทั่วไป

GOST 12.1.019-79 ระบบมาตรฐานความปลอดภัยในการทำงาน ความปลอดภัยด้านไฟฟ้า. ข้อกำหนดทั่วไปและการตั้งชื่อประเภทการป้องกัน

GOST 61-75 รีเอเจนต์ กรดน้ำส้ม. ข้อมูลจำเพาะ

GOST OIML R 76-1-2011 ระบบสถานะเพื่อให้มั่นใจถึงความสม่ำเสมอของการวัด เครื่องชั่งแบบไม่อัตโนมัติ ส่วนที่ 1 ข้อกำหนดมาตรวิทยาและเทคนิค แบบทดสอบ

GOST 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) การวัดเครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการ กระบอกสูบ บีกเกอร์ กระติกน้ำ หลอดทดลอง ข้อกำหนดทั่วไป

GOST ISO 3696-2013 น้ำสำหรับการวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการ ข้อกำหนดทางเทคนิคและวิธีการควบคุม

GOST ISO 5725-1-2003 ความแม่นยำ (ความถูกต้องและแม่นยำ) ของวิธีการวัดและผลลัพธ์ ส่วนที่ 1 บทบัญญัติและคำจำกัดความพื้นฐาน

GOST ISO 5725-2-2003 ความแม่นยำ (ความถูกต้องและแม่นยำ) ของวิธีการวัดและผลลัพธ์ ส่วนที่ 2: วิธีการพื้นฐานสำหรับกำหนดความสามารถในการทำซ้ำและการทำซ้ำของวิธีการวัดมาตรฐาน

GOST 5789-78 รีเอเจนต์ โทลูอีน. ข้อมูลจำเพาะ

GOST 16317-87 เครื่องทำความเย็นไฟฟ้าในครัวเรือน ข้อกำหนดทั่วไป

GOST 20015-88 คลอโรฟอร์ม ข้อมูลจำเพาะ

GOST 25336-82 เครื่องแก้วและอุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ ประเภท พารามิเตอร์หลักและขนาด

GOST 26313-84 ผลิตภัณฑ์แปรรูปจากผักและผลไม้ กฎการยอมรับ วิธีการสุ่มตัวอย่าง

GOST 26671-85 ผลไม้และผักแปรรูปเนื้อสัตว์กระป๋องและเนื้อสัตว์และผัก การเตรียมตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการ

GOST 29030-91 ผลิตภัณฑ์แปรรูปจากผักและผลไม้ วิธีพิคโนเมตริกเพื่อกำหนดความหนาแน่นสัมพัทธ์และปริมาณของของแข็งที่ละลายน้ำได้

GOST 29227-91 (ISO 835/1-81) เครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการ ปิเปตสำเร็จการศึกษา ส่วนที่ 1 ข้อกำหนดทั่วไป

GOST ISO/IEC 17025-2009 ข้อกำหนดทั่วไปสำหรับความสามารถของห้องปฏิบัติการทดสอบและสอบเทียบ

GOST 32689.1-2014 ผลิตภัณฑ์อาหารจากพืช มัลติเมธอดสำหรับการวิเคราะห์แก๊สโครมาโตกราฟีของสารตกค้างจากยาฆ่าแมลง ส่วนที่ 1 บททั่วไป

GOST 32689.2-2014 ผลิตภัณฑ์อาหารจากพืช มัลติเมธอดสำหรับการวิเคราะห์แก๊สโครมาโตกราฟีของสารตกค้างจากยาฆ่าแมลง ส่วนที่ 2: วิธีการสกัดและการทำให้บริสุทธิ์

GOST 32689.3-2014 ผลิตภัณฑ์อาหารจากพืช มัลติเมธอดสำหรับการวิเคราะห์แก๊สโครมาโตกราฟีของสารตกค้างจากยาฆ่าแมลง ส่วนที่ 3 การกำหนดและตรวจสอบผลลัพธ์

หมายเหตุ - เมื่อใช้มาตรฐานนี้ ขอแนะนำให้ตรวจสอบความถูกต้องของมาตรฐานอ้างอิงในระบบข้อมูลสาธารณะ - บนเว็บไซต์ทางการของ Federal Agency for Technical Regulation and Metrology บนอินเทอร์เน็ตหรือตามดัชนีข้อมูลประจำปี "มาตรฐานแห่งชาติ" ซึ่งเผยแพร่เมื่อวันที่ 1 มกราคมของปีปัจจุบัน และในประเด็นของดัชนีข้อมูลรายเดือน "มาตรฐานแห่งชาติ" สำหรับปีปัจจุบัน หากมีการเปลี่ยนมาตรฐานอ้างอิง (แก้ไข) เมื่อใช้มาตรฐานนี้ คุณควรได้รับคำแนะนำจากมาตรฐานการแทนที่ (แก้ไข) หากมาตรฐานที่อ้างอิงถูกยกเลิกโดยไม่มีการเปลี่ยน บทบัญญัติที่ให้การอ้างอิงจะใช้บังคับในขอบเขตที่การอ้างอิงนี้ไม่ได้รับผลกระทบ

3 ตัวย่อ

HPLC-MS/MS - โครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูงควบคู่กัน-แมสสเปกโตรเมตรี;

OTA, ออคราทอกซินเอ;

PAT - patulin;

ESI- สปัตเตอร์ไอออไนซ์ในสนามไฟฟ้า ( ไอออนไนซ์ด้วยไฟฟ้าสเปรย์);

IARC- หน่วยงานระหว่างประเทศเพื่อการวิจัยโรคมะเร็ง;

LOD- ขีด จำกัด การตรวจจับ;

LOQ- ขีด จำกัด ของการกำหนดเชิงปริมาณ

SRM- การระบุส่วนประกอบในโหมดการควบคุมปฏิกิริยาที่เลือก ( การตรวจสอบปฏิกิริยาที่เลือก).

4 แก่นแท้ของวิธีการ

สาระสำคัญของวิธีการประกอบด้วยการสกัดเบื้องต้นของ PAT และ OTA mycotoxins ด้วย acetonitrile ต่อหน้าแมกนีเซียมซัลเฟตที่ปราศจากน้ำ ความเข้มข้น การละลายซ้ำใน acetonitrile และการกำหนดเชิงปริมาณของความเข้มข้นมวลของ mycotoxins โดยใช้ HPLC-MS/MS ด้วยสเปรย์ไอออไนซ์ ในสนามไฟฟ้าและการระบุส่วนประกอบในโหมดการควบคุมปฏิกิริยาที่เลือก

5 เครื่องมือวัด อุปกรณ์เสริม วัสดุอ้างอิง รีเอเจนต์ และเครื่องแก้ว

ระบบ HPLC-MS/MS เชิงวิเคราะห์ที่มีเครื่องตรวจจับมวลแบบสามแฉกสำหรับการวัดในช่วงมวลตั้งแต่ 10 ถึง 3000 หน่วยมวลอะตอม (a.m.u.) โดยมีความแม่นยำในการวัดมวลอย่างน้อย 0.1 น. ไอออนไนซ์สปัตเตอร์ในสนามไฟฟ้า ความสามารถในการทำงานในโหมดการควบคุมปฏิกิริยาที่เลือกและการสแกนไอออนของเด็กและผู้ปกครอง อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนขั้นต่ำ 1,000: 1 ระบบวิเคราะห์ควรมีโมดูล HPLC ที่ประกอบด้วยปั๊มไบนารีพร้อมมิกเซอร์ เทอร์โมสตัทแบบคอลัมน์โครมาโตกราฟีที่ให้อุณหภูมิความร้อนสูงถึง 50°C และคอลัมน์โครมาโตกราฟีที่มีตัวดูดซับเฟสย้อนกลับที่มีขนาดเกรน 5 ไมโครเมตร , ยาว 150 มม. และเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 3 มม. ระบบที่ใช้ต้องตรวจสอบการตรวจหาสารพิษจากเชื้อราในช่วง 0.1 ถึง 100.0 ไมโครกรัม/dm
________________
* ดูภาคผนวก A สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับระบบ LC/MS/MS ที่แนะนำ


สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่มีช่วงการวัดที่อนุญาตให้ทำการทดสอบที่ความยาวคลื่นตั้งแต่ 250 ถึง 400 นาโนเมตร ซึ่งอนุญาตโดยข้อผิดพลาดสัมบูรณ์ในการวัดความหนาแน่นของแสงไม่เกิน 0.1%

เครื่องชั่งตาม GOST OIML R 76-1 ให้ความแม่นยำในการชั่งน้ำหนักโดยมีขีดจำกัดข้อผิดพลาดแน่นอนที่อนุญาตของการชั่งน้ำหนักครั้งเดียวไม่เกิน ±0.01 มก.

อาบน้ำอัลตราโซนิก

เครื่องหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็วโรเตอร์ 4000-5000 รอบต่อนาที สำหรับหลอดทดลองที่มีความจุ 50 มล.

เครื่องหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็วโรเตอร์ 10,000-12,000 รอบต่อนาที สำหรับหลอดทดลองประเภท Eppendorf ที่มีความจุ 1.5-2.0 มล.

ตู้อบแห้งให้การรักษาอุณหภูมิได้ถึง 200 องศาเซลเซียส

ตู้เย็นในครัวเรือนตาม GOST 16317

เชคเกอร์สำหรับผสม

อุปกรณ์สำหรับการตวงตัวอย่างของเหลวที่มีความจุคงที่หรือแปรผันได้ 20-1000 มม. โดยมีข้อผิดพลาดสัมพัทธ์ในการตวงปริมาตรจริงไม่เกิน 2.5%

ไมโครฟิลเตอร์ - หัวฉีดบนกระบอกฉีดยา (เซลลูโลสที่สร้างใหม่, เส้นผ่านศูนย์กลาง 13 มม., ขนาดรูพรุน 0.2-0.4 ไมครอน)

cuvettes ควอตซ์ที่มีความยาวการทำงาน 1 ซม.

PAT และ OTA mycotoxins สำหรับใช้เป็นตัวอย่างอ้างอิงที่มีเนื้อหาของสารหลักอย่างน้อย 98%

กรดอะซิติกน้ำแข็งตาม GOST 61 เกรดวิเคราะห์

อะซิโตไนไตรล์สำหรับ Gradient HPLC

เมทานอลสำหรับ Gradient HPLC

แมกนีเซียมซัลเฟตแอนไฮดรัส บริสุทธิ์ทางเคมี

แคลเซียมคลอไรด์แอนไฮดรัส เม็ด บริสุทธิ์ทางเคมี

คลอโรฟอร์มตาม GOST 20015 บริสุทธิ์ทางเคมี

โทลูอีนตาม GOST 5789 บริสุทธิ์ทางเคมี

เอทิลแอลกอฮอล์แน่นอน

น้ำสำหรับการวิเคราะห์ในห้องปฏิบัติการ ความบริสุทธิ์ 1 ตาม GOST ISO 3696

ปิเปตที่สำเร็จการศึกษาของคลาสความแม่นยำที่ 2 ที่มีความจุ 1, 2, 5, 10 ซม. 2 ของคลาสความแม่นยำที่ 2 ตาม GOST 29227

ขวดปริมาตรของความแม่นยำระดับ 2 ที่มีความจุ 5, 10, 25, 50, 100 และ 1,000 ซม. 2 หรือ 2a ตาม GOST 1770

ขวดก้นแหลม ความจุ 10.25 cm3.

หลอดหมุนเหวี่ยงชนิด Eppendorf ความจุ 1.5-2.0 มล.

หลอดไมโครเทสต์ที่มีความจุ 100-400 มม.

กระบอกสูบวัดระดับความแม่นยำระดับ 2 ที่มีความจุ 25, 50, 250 cm3 ของการออกแบบใด ๆ ตาม GOST 1770

หลอดหมุนเหวี่ยงพร้อมฝาเกลียว 50 ซม.

ถ้วยพอร์ซเลนขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 125-150 มม.

เครื่องดูดความชื้นในห้องปฏิบัติการที่มีความจุ 3 dm

ห้องปฏิบัติการช่องทางตาม GOST 25336

ขวดก้นแบนที่มีความจุ 50, 100, 250 cm3 ตาม GOST 25336

แว่นตาเคมีที่มีความจุ 10, 20, 50, 100 และ 200 cm3 ตาม GOST 25336

อนุญาตให้ใช้เครื่องมือวัด อุปกรณ์เสริม เครื่องใช้อื่น ๆ ที่ไม่ด้อยกว่าข้างต้นในแง่ของคุณสมบัติทางมาตรวิทยาและทางเทคนิคและให้ความแม่นยำในการวัดที่จำเป็นรวมถึงตัวอย่างมาตรฐาน รีเอเจนต์ และวัสดุที่มีคุณภาพไม่เลวร้ายไปกว่าข้างต้น .

6 การสุ่มตัวอย่าง

การสุ่มตัวอย่าง - ตาม GOST 26313 การเตรียมและการจัดเก็บตัวอย่าง - ตาม GOST 26671, GOST 32689.1, GOST 32689.2 และ GOST 32689.3

7 การเตรียมตัวสำหรับการทดสอบ

7.1 ข้อกำหนดทั่วไป

ก่อนการทดสอบจะดำเนินการเตรียมเครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการเบื้องต้นรวมถึงการควบคุมคุณภาพของน้ำยาและวัสดุเสริมตามข้อกำหนดของ GOST 32689.1, GOST 32689.2 และ GOST 32689.3

7.2 การเตรียมสารละลายเสริม

7.2.1 การเตรียมโมบายเฟส A

ในขวดปริมาตรที่มีความจุ 1,000 มล. พร้อมแก้วบดที่ปิดสนิทหรือจุกฟลูออโรเรซิ่น ปิเปตกรดอะซิติกน้ำแข็ง 1 มล. เมทานอล 100 มล. และนำไปทำเครื่องหมายด้วยน้ำที่ผ่านการกลั่น ผสมส่วนผสมให้ละเอียด

อายุการเก็บรักษาของเฟสเคลื่อนที่ A ที่อุณหภูมิห้อง - ไม่เกินหนึ่งเดือน

7.2.2 การเตรียมโมบายเฟส B

ในขวดปริมาตรที่มีความจุ 1,000 มล. พร้อมแก้วบดที่ปิดสนิทหรือจุกฟลูออโรเรซิ่น กรดอะซิติกน้ำแข็ง 1 มล. จะถูกวางด้วยปิเปตแล้วนำไปทำเครื่องหมายด้วยเมทานอล ผสมส่วนผสมให้ละเอียด

อายุการเก็บรักษาของเฟสเคลื่อนที่ B ที่อุณหภูมิห้อง - ไม่เกินหนึ่งเดือน

หมายเหตุ เฟสเคลื่อนที่ต้องไม่สัมผัสกับยางและวัสดุพอลิเมอร์ [ยกเว้นพอลิเตตระฟลูออโรเอทิลีน (PTFE)]

7.2.3 การเตรียมตัวทำละลาย 1

ในภาชนะที่เหมาะสม ผสม 99 ส่วนโดยปริมาตรของโทลูอีนและส่วนหนึ่งโดยปริมาตรของกรดอะซิติกน้ำแข็ง ผสมส่วนผสมให้ละเอียด

อายุการเก็บรักษาของตัวทำละลาย 1 ที่อุณหภูมิห้องไม่เกิน 6 เดือน

7.3 การเตรียมแมกนีเซียมซัลเฟต

แมกนีเซียมซัลเฟตปราศจากน้ำที่ใช้ในการสกัดเป็นตัวดูดซับจะต้องทำให้แห้งแม้ภายในวันหมดอายุเพื่อขจัดความชื้นที่ดูดซับออกจากอากาศ ตัวดูดซับถูกเผาที่อุณหภูมิ 180°C - 200°C เป็นเวลา 6-10 ชั่วโมง และเก็บไว้ในเดซิกเคเตอร์เหนือแคลเซียมคลอไรด์ที่ปราศจากน้ำ เกณฑ์สำหรับความเหมาะสมของรีเอเจนต์คือการไม่มีชั้นของเหลวเพิ่มเติมเมื่อสารละลายถูกทำให้ร้อน ขั้นตอนการสกัดจะดำเนินการที่อุณหภูมิ 30°C - 40°C และหลังจาก 2-3 นาที มวลของปฏิกิริยาจะถูกกวน .

7.4 การเตรียมสารละลายจากสารพิษจากเชื้อรา

7.4.1 การเตรียมโซลูชัน PAT

7.4.1.1 การเตรียมสารละลายสต็อค PAT ความเข้มข้นของมวล 200 µg/cm

ใช้ PAT ที่เป็นผลึกบริสุทธิ์ 2.0 มก. ชั่งน้ำหนักด้วยความแม่นยำ 0.01 มก. ละลายในขวดปริมาตร 10 มล. ในคลอโรฟอร์มจำนวนเล็กน้อย จากนั้นจึงนำปริมาตรของสารละลายไปที่เครื่องหมายด้วยคลอโรฟอร์ม

อายุการเก็บรักษาของสารละลาย PAT เริ่มแรกที่อุณหภูมิ 0°C ในขวดแก้วปริมาตรที่มีจุกปิดพื้นหุ้มด้วยฟอยล์อลูมิเนียมอย่างแน่นหนา ไม่เกิน 1 เดือน

7.4.1.2 การเตรียมสารละลาย PAT ความเข้มข้นของมวล 20 µg/cm

ถ่ายสารละลายสต็อค PAT ที่ได้ผลลัพธ์ 1 มล. (ดู 7.4.1.1) ลงในขวดปริมาตร 10 มล. และเจือจางจนเป็นเครื่องหมายด้วยคลอโรฟอร์ม เพื่อตรวจสอบความเข้มข้นของมวลที่แน่นอนของ PAT ในสารละลาย 5.0 มล. ของสารละลายมาตรฐาน PAT ที่เป็นผลลัพธ์จะถูกถ่ายและถ่ายโอนไปยังภาชนะที่มีความจุประมาณ 15 ซม.3 จากนั้นคลอโรฟอร์มจะถูกลบออกโดยการกำจัดไนโตรเจนจนได้สารแห้ง ทันทีที่ได้รับของแห้ง จะมีการเติมเอทานอลสัมบูรณ์ 5.0 มล. ลงในภาชนะทันที ละลาย PAT อย่างสมบูรณ์ สารละลาย PAT ที่เป็นผลลัพธ์ถูกนำเข้าสู่คิวเวตต์แบบควอตซ์ที่มีความยาวเส้นทางแสง 1 ซม. จากนั้นสเปกตรัมของสารละลายจะถูกบันทึกบนสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ในช่วงความยาวคลื่นตั้งแต่ 250 ถึง 350 นาโนเมตร โดยใช้เอทานอลสัมบูรณ์ในคิวเวตต์อ้างอิงเป็นตัวควบคุม .

ความเข้มข้นของมวลของ PAT ในสารละลาย µg/cm คำนวณโดยสูตร

โดยที่ค่าสูงสุดของความหนาแน่นเชิงแสงของสเปกตรัมคือ (ความยาวคลื่นประมาณ 275 นาโนเมตร) หน่วย อ๊อฟ;

- น้ำหนักโมเลกุลของ PAT เท่ากับ 153.1 กรัม/โมล

- ปัจจัยการแปลง


- ค่าสัมประสิทธิ์โมลาร์ของการดูดกลืนแสง (การสูญพันธุ์) เท่ากับ 14600, m/mol

7.4.1.3 การเตรียมสารละลาย PAT 100 ไมโครกรัม/ซม.

5 มล. ของสารละลายเริ่มต้นของ PAT ในคลอโรฟอร์มที่มีความเข้มข้นของมวล 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (ดู 7.4.1.1) ถูกถ่ายโอนไปยังขวดปริมาตรที่มีความจุ 10 มล. เข้มข้นจนกลายเป็นสารตกค้างแห้งที่อุณหภูมิห้องภายใต้กระแสน้ำ ไนโตรเจนและละลายอีกครั้งทันทีในอะซิโตไนไทรล์ นำไปที่ปริมาตรในขวดเพื่อติดฉลาก

7.4.1.4 อายุการเก็บรักษาของสารละลาย PAT ตามข้อ 7.4.1.2 และ 7.4.1.3 ที่อุณหภูมิ 0 องศาเซลเซียส ในขวดแก้วปริมาตรที่มีจุกปิดพื้นหุ้มด้วยฟอยล์อลูมิเนียมอย่างแน่นหนา ไม่เกิน 24 ชั่วโมง

ก่อนใช้งาน อุณหภูมิของสารละลายจะถูกนำไปที่อุณหภูมิห้อง (ไม่อนุญาตให้นำฟอยล์อลูมิเนียมออกจากขวดปริมาตรจนกว่าเนื้อหาจะถึงอุณหภูมิห้อง) เนื่องจากการทำลาย PAT จึงไม่ได้รับอนุญาตให้เก็บตัวอย่างอ้างอิงในรูปแบบของฟิล์มบาง ๆ ของวัตถุแห้งที่ได้รับหลังจากการกำจัดตัวทำละลาย -

7.4.2 การเตรียมโซลูชันสต็อค OTA

7.4.2.1 การเตรียมสารละลายสต็อค OTA 20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร

ละลาย OTA ที่เป็นผลึกบริสุทธิ์ 2.0 มก. ชั่งน้ำหนักให้ใกล้ที่สุด 0.01 มก. ในบีกเกอร์ขนาด 25 มล. พร้อมตัวทำละลาย 1 (ดู 7.2.3) และถ่ายโอนในเชิงปริมาณไปยังขวดปริมาตร 100 มล. และเจือจางด้วยตัวทำละลาย 1 จนถึงเครื่องหมาย

เพื่อตรวจสอบความเข้มข้นของมวลที่แน่นอนของ OTA ในสารละลาย สารละลาย OTA เริ่มต้นที่ได้รับจะถูกนำมาใช้ในคิวเวตต์แบบควอตซ์ที่มีความยาวเส้นทางแสง 1 ซม. จากนั้นสเปกตรัมของสารละลายจะถูกบันทึกลงในเครื่องวัดสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ในช่วงความยาวคลื่นตั้งแต่ 300 ถึง 370 นาโนเมตร โดยใช้ตัวทำละลาย 1 เป็นคิวเวตต์อ้างอิง

ความเข้มข้นมวลของ OTA ในสารละลายเริ่มต้น ไมโครกรัม/ซม. คำนวณโดยสูตร

โดยที่ค่าสูงสุดของความหนาแน่นเชิงแสงของสเปกตรัมคือ (ความยาวคลื่นประมาณ 333 นาโนเมตร) หน่วย อ๊อฟ;

- น้ำหนักโมเลกุลของ OTA เท่ากับ 402.7 กรัม/โมล

- ปัจจัยการแปลง

- ปัจจัยการแก้ไขกำหนดตามภาคผนวก A;

- ค่าสัมประสิทธิ์โมลาร์ของการดูดกลืนแสง (การสูญพันธุ์) เท่ากับ 544, m/mol

อายุการเก็บรักษาของสารละลาย OTA ดั้งเดิมที่อุณหภูมิลบ 18°C ​​ในขวดปริมาตรแก้วที่มีจุกปิดพื้นหุ้มด้วยฟอยล์อลูมิเนียมอย่างแน่นหนานั้นไม่เกินสี่ปี

7.4.2.2 การเตรียมสารละลาย OTA 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร

ดึงสารละลายสต็อค OTA 2.5 มล. (7.4.2.1) โอนไปยังขวดปริมาตร 10 มล. และเจือจางด้วยตัวทำละลาย 1 (7.2.3) ไปที่เครื่องหมาย

อายุการเก็บรักษาของสารละลาย OTA ที่อุณหภูมิ 4°C ในขวดแก้วปริมาตรที่มีจุกปิดพื้นหุ้มด้วยฟอยล์อลูมิเนียมอย่างแน่นหนานั้นไม่เกิน 24 ชั่วโมง

ก่อนใช้งานอุณหภูมิของสารละลายจะถูกนำไปที่อุณหภูมิห้อง (ไม่อนุญาตให้นำฟอยล์อลูมิเนียมออกจากขวดปริมาตรจนกว่าเนื้อหาจะถึงอุณหภูมิห้อง) -

7.5 การเตรียมโซลูชันการสอบเทียบ PAT และ OTA

โซลูชันการสอบเทียบ PAT และ OTA จัดทำขึ้นโดยการผสมสารละลายสต็อกในปริมาณหนึ่ง (ดู 7.4.1.1 และ 7.4.2.1) กับน้ำแอปเปิ้ลใสที่ไม่มีสารวิเคราะห์ที่จะกำหนด

7.5.1 การเตรียมสารละลายสอบเทียบ PAT

7.5.1.1 การเตรียมสารละลายขั้นกลางที่มีความเข้มข้นของมวล PAT 1000 ng/cm (สารละลาย น-1)

สารละลาย PAT 1 มล. (ดู 7.4.1.3) หรือตัวอย่างมาตรฐาน 1 มล. ขององค์ประกอบ PAT ที่มีความเข้มข้นของมวล PAT 100 ไมโครกรัม/ซม. ถูกถ่ายโอนไปยังขวดปริมาตรที่มีความจุ 100 มล. และปริมาตร สารละลายจะถูกปรับให้เข้ากับเครื่องหมายด้วยอะซิโตไนไทรล์

7.5.1.2 การเตรียมสารละลายขั้นกลางที่มีความเข้มข้นของมวล PAT 10 ng/cm (สารละลาย น-2)

ถ่ายสารละลาย -1 1 มล. (ดู 7.5.1.1) ลงในขวดปริมาตร 100 มล. แล้วเจือจางด้วยอะซิโตไนไทรล์

7.5.1.3 การเตรียมสารละลายสอบเทียบ PAT

เลือกตามตารางที่ 1 สารละลายระดับกลางบางปริมาณ น-1 และ น-2 (ดู 7.5.1.1 และ 7.5.1.2) และจ่ายลงในขวดปริมาตร 10 มล.


ตารางที่ 1 - ปริมาณของการแก้ปัญหา น-1 และ น-2 สำหรับการเตรียมสารละลายสอบเทียบ PAT

ชื่อของตัวบ่งชี้	โซลูชันการสอบเทียบ
ปริมาณสารละลาย น-2 ซม.
ปริมาณสารละลาย น-1 ซม.
ปริมาณ PAT ที่ฉีด ng
ความเข้มข้นมวลของ PAT ในสารละลาย ng/cm

7.5.2 การเตรียมโซลูชันการสอบเทียบ OTA

7.5.2.1 การเตรียมสารละลายระดับกลาง OTA 200 ng/ml (สารละลาย อา-1)

ให้สารละลาย OTA ขนาด 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเข้มข้น 1 มิลลิลิตร (ดู 7.4.2.2) เพื่อทำให้แห้งภายใต้การไหลของไนโตรเจนที่อุณหภูมิห้อง และถ่ายโอนทันทีด้วยอะซิโตไนไทรล์ไปยังขวดปริมาตร 25 มล.

7.5.2.2 การเตรียมสารละลายกลาง OTA 10 ng/ml (สารละลาย แต่-2)

สารละลายกลาง OTA 0.5 มล. แต่-1 (ดู 7.5.2.1) ถูกถ่ายโอนไปยังขวดปริมาตร 10 มล. และเจือจางจนถึงเครื่องหมายด้วยอะซิโตไนไทรล์

7.5.2.3 การเตรียมโซลูชันการสอบเทียบ OTA

เลือกตามตารางที่ 2 ปริมาตรของสารละลายระดับกลาง แต่-1 และ แต่-2 (ดู 7.5.2.1 และ 7.5.2.2) และจ่ายลงในขวดปริมาตร 10 มล.


ตารางที่ 2 - ปริมาณของการแก้ปัญหา แต่-1 และ แต่-2 สำหรับการเตรียมโซลูชันการสอบเทียบ OTA

ชื่อของตัวบ่งชี้	โซลูชันการสอบเทียบ
ปริมาณสารละลาย แต่-2 ซม.
ปริมาณสารละลาย แต่-1 ซม.
จำนวน OTA ที่จัดการ ng
ความเข้มข้นมวลของ OTA ในสารละลาย ng/cm

นำปริมาตรของสารละลายในขวดใส่เครื่องหมายด้วยน้ำแอปเปิ้ล (หรือน้ำที่กรองแล้ว)

สำหรับการทดสอบใน HPLC-MS/MS ระบบจะฉีดสารละลายการสอบเทียบ PAT และ OTA ขนาด 10 มม. ที่เตรียมตาม 7.5.1.3 และ 7.5.2.3 และสอบเทียบตาม 7.7 โดยคำนึงถึงเงื่อนไขของ 8.3.1

อายุการเก็บรักษาของสารละลายสอบเทียบที่อุณหภูมิ 0°C - 4°C ในขวดปริมาตรแก้วที่มีจุกปิดพื้นไม่เกิน 24 ชั่วโมง

7.6 การเตรียมระบบ LC/MS/MS

การเตรียมระบบ HPLC-MS/MS สำหรับการวัดจะดำเนินการตามคู่มือ (คำแนะนำ) สำหรับการใช้งานและข้อมูลที่ระบุในภาคผนวก B

เมื่อตั้งค่าโหมดการทำงานของแมสสเปกโตรมิเตอร์ ขอแนะนำให้ใช้พารามิเตอร์ MS/MS สำหรับการตรวจวัดสารพิษจากเชื้อราที่ให้ไว้ในภาคผนวก B

ในกรณีนี้ต้องเป็นไปตามเงื่อนไขต่อไปนี้:

- อุณหภูมิอากาศแวดล้อมจาก 20 ° C ถึง 25 ° C;

- ความดันบรรยากาศจาก 84 ถึง 106 kPa;

- แรงดันไฟหลัก (220±10) V;

- ความถี่ของกระแสไฟหลักจาก 49 ถึง 51 Hz;

- ความชื้นสัมพัทธ์ในอากาศ 40% ถึง 80%

7.7 การปรับเทียบระบบ HPLC-MS/MS

การสอบเทียบระบบด้วยสารละลายของสารพิษจากเชื้อราในน้ำผลไม้ตามข้อ 7.5 จะดำเนินการตามคู่มือการใช้งาน (คำแนะนำ) สำหรับระบบ HPLC-MS/MS และคำนึงถึงเงื่อนไขตาม 8.3.1 เดือนละครั้ง พื้นที่พีคของ PAT และ OTA ถูกกำหนดบนโครมาโตแกรม และการสร้างการพึ่งพาการสอบเทียบจะถูกสร้างขึ้นจากพื้นที่พีคในช่วงความเข้มข้นตาม 7.5 คำนวณค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์และการเบี่ยงเบนของค่าที่คำนวณได้ของความเข้มข้นมวลของสารพิษจากเชื้อราที่จุดสอบเทียบแต่ละจุดจากค่าจริงตามขั้นตอนการเตรียมสารละลายสำหรับการสอบเทียบ (ดู 7.5) การสอบเทียบถือว่ายอมรับได้หากค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์อย่างน้อย 0.999 (สำหรับ PAT) และ 0.965 (สำหรับ OTA) และค่าเบี่ยงเบนสัมพัทธ์ของค่าที่คำนวณได้ของความเข้มข้นของมวลจากค่าจริงไม่เกิน ±10%

แทนที่จะใช้ค่าเบี่ยงเบนสัมพัทธ์ ความสามารถในการยอมรับของคุณลักษณะการสอบเทียบสามารถประเมินได้ด้วยค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ ซึ่งไม่ควรเกิน 5%

8 การทดสอบ

8.1 การสกัด

ผลิตภัณฑ์น้ำผลไม้ผสมน้ำผลไม้ผสมอย่างทั่วถึงเบื้องต้น 10 มล. () วางในหลอดหมุนเหวี่ยงที่มีฝาเกลียวที่มีความจุ 50 มล. เติมอะซิโตไนไทรล์ 20 มล. และแมกนีเซียมซัลเฟตปราศจากน้ำ 15 กรัมลงในหลอดทดลอง ผสมส่วนผสมอย่างเข้มข้นเป็นเวลาสามถึงห้านาทีด้วยตนเองหรือด้วยเครื่องปั่น หลังจากการกวน สารสกัดที่ได้รับจะถูกปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4000-5000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิห้องหรือ 5 นาทีในเครื่องหมุนเหวี่ยงที่มีการระบายความร้อนที่อุณหภูมิ 5°C วัดปริมาตรรวมของสารสกัดหลังการหมุนเหวี่ยง () สารสกัด 18-19 ซม. 3 () ถ่ายด้วยปิเปตหรืออุปกรณ์จ่ายยา ถูกถ่ายลงในขวดก้นแหลมขนาด 25 ซม.3 1 ซม. () อะซิโตไนไทรล์

หากมีฟิล์มคาราเมลที่ไม่ละลายน้ำอยู่บนผนังของเรือ มันจะถูกทำลายในอ่างอัลตราโซนิกเป็นเวลาสามถึงห้านาที สารละลายถูกถ่ายโอนไปยังหลอดชนิด Eppendorf ที่มีความจุ 1.5-2.0 cm3 และปั่นแยกที่ 10,000-12,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 3-5 นาที ชั้นบนจะถูกถ่ายและกรองผ่านไมโครฟิลเตอร์ที่มีขนาดรูพรุน 0.2-0.4 µm โดยตรงไปยัง microtube ที่มีความจุ 100-400 มม. สำหรับการทดสอบ HPLC-MS/MS ตัวอย่างที่เตรียมไว้ 10 มม. จะถูกฉีดเข้าสู่ระบบ

8.2 การเตรียมตัวอย่างจากผลิตภัณฑ์เข้มข้น

น้ำผลไม้เข้มข้น (น้ำซุปข้น) ถูกสร้างใหม่ด้วยน้ำจนถึงระดับของแข็งที่ละลายน้ำได้ต่ำสุดที่กำหนดโดยเอกสารข้อบังคับสำหรับผลิตภัณฑ์น้ำผลไม้บางประเภท ผลิตภัณฑ์น้ำผลไม้เข้มข้นซึ่งไม่ได้จัดเตรียมระดับของแข็งที่ละลายน้ำได้ต่ำสุด จะถูกนำกลับคืนมาด้วยน้ำที่ผ่านการกลั่นเป็นปริมาณของแข็งที่ละลายน้ำได้ 11.2% ปริมาณของแข็งที่ละลายน้ำได้ถูกควบคุมตาม GOST 29030

การสกัดตัวอย่างที่สร้างใหม่จะดำเนินการตามข้อ 8.1

8.3 การวัดผล

8.3.1 เงื่อนไขทั่วไป

ตัวอย่างและสารละลายสอบเทียบที่เตรียมตาม 8.1 จะถูกฉีดตามลำดับที่เลือก วิธีที่พบบ่อยที่สุดคือเมื่อการฉีดสารละลายสำหรับการสอบเทียบเริ่มต้นและสิ้นสุดชุดการฉีดตัวอย่าง

ต้องตั้งค่าระบบ HPLC-MS/MS เป็น SRMด้วยทรานซิชันที่ช่วยในการตรวจหาสารพิษจากเชื้อราที่วิเคราะห์ เวลาเก็บรักษาและพื้นที่พีคถูกกำหนดโดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์สำหรับการบันทึกและคำนวณผลลัพธ์ของการวิเคราะห์ ซึ่งแนบมากับระบบ HPLC-MS/MS ตัวอย่างของระบบ HPLC/MS/MS สภาวะการแยกสาร และการตรวจจับมวลสารมีให้ในภาคผนวก B

ตัวอย่างได้รับการทดสอบภายใต้สภาวะการทำซ้ำสำหรับการกำหนดแบบคู่ขนานสองรายการตาม GOST ISO 5725-1 (ส่วนย่อย 3.14) และ GOST ISO 5725-2

8.3.2 การระบุสารพิษจากเชื้อรา

เพื่อระบุ mycotoxins เวลาเก็บรักษาที่ได้จากสารละลายตัวอย่างจะถูกเปรียบเทียบกับเวลาการกักเก็บ mycotoxins ที่เกี่ยวข้องจากสารละลายสำหรับการสอบเทียบ เพื่อยืนยันการมีอยู่ของสารพิษจากเชื้อรา จะทำการเปรียบเทียบระหว่างอัตราส่วนของความเข้มของสัญญาณจากครั้งแรกและครั้งที่สอง m/z- การเปลี่ยนผ่านด้วยอัตราส่วนความเข้มของสัญญาณสารพิษจากเชื้อราจากสารละลายสอบเทียบ

อัตราส่วนของพีคสำหรับสารพิษจากเชื้อราหนึ่งชนิดไม่ควรแตกต่างกันมากกว่า 20% จากอัตราส่วนที่คาดหวังของความเข้มของสัญญาณ

9 การประมวลผลและการนำเสนอผลการทดสอบ

9.1 การหาปริมาณ

การหาปริมาณสารพิษจากเชื้อราในปริมาตรที่ฉีดของสารสกัดที่เตรียมไว้ (ดู 8.1) ดำเนินการโดยการเปรียบเทียบพื้นที่ (หรือความสูง) ของยอด mycotoxin กับลักษณะการสอบเทียบที่สอดคล้องกันสำหรับสารพิษจากเชื้อรานี้

ความเข้มข้นมวลของสารพิษจากเชื้อราในผลิตภัณฑ์ทดสอบ µg/dm คำนวณโดยสูตร

ตัวประกอบการแปลงจากลูกบาศก์เซนติเมตรเป็นลูกบาศก์เดซิเมตรอยู่ที่ไหน

- ความเข้มข้นของสารพิษจากเชื้อราในปริมาตรของสารสกัด 10 มม. ฉีดเข้าไปในระบบ HPLC-MS/MS กำหนดโดยการพึ่งพาการสอบเทียบ ng;

คือปริมาตรของอะซิโตไนไทรล์ที่สารสกัดถูกละลายอีกครั้งหลังจากความเข้มข้น cm;

- ปริมาตรรวมของสารสกัดที่ใช้ปริมาตรเพื่อความเข้มข้น cm;

- ปริมาณตัวอย่างที่นำเข้าโครมาโตกราฟี (=10 มม.), มม.;

- ปริมาตรของตัวอย่างผลิตภัณฑ์น้ำผลไม้ที่ทำการทดสอบ cm;

- ปริมาณสารสกัดที่เลือกความเข้มข้น ดู

เมื่อคำนวณปริมาณสารพิษจากเชื้อราในผลิตภัณฑ์น้ำผลไม้เข้มข้น ให้คำนึงถึงระดับการเจือจางด้วยน้ำตามข้อ 8.2

ผลการวัดจะใช้เป็นค่าเฉลี่ยเลขคณิตของผลลัพธ์ของการหาค่าขนานสามค่า ถ้าตรงตามเงื่อนไขการยอมรับ

โดยที่ เป็นค่าสูงสุดและต่ำสุดจากผลลัพธ์สามผลลัพธ์ของการกำหนดแบบขนาน µg/dm

, , - ผลลัพธ์ของการกำหนดหาแบบขนานสามแบบ, µg/dm;

- ค่าของช่วงวิกฤต%

ความคลาดเคลื่อนระหว่างการคำนวณหาคู่ขนานทั้งสาม (เป็นเปอร์เซ็นต์ของค่าเฉลี่ย) ที่ทำในห้องปฏิบัติการเดียวกันไม่ควรเกินขีดจำกัดความสามารถในการทำซ้ำ (การลู่เข้า) เท่ากับ 3.6· โดยมีความน่าจะเป็น = 0.95 หากตรงตามเงื่อนไขนี้ ผลการวัดขั้นสุดท้ายจะถูกนำมาเป็นค่าเฉลี่ยเลขคณิตของการคำนวณหาคู่ขนานสามค่า ปัดเศษขึ้นเป็นทศนิยมตำแหน่งที่สาม

ผลการวัดจะถูกบันทึกในโปรโตคอลตาม GOST ISO / IEC 17025

9.2 หากผลที่ได้แสดงว่าปริมาณสารพิษจากเชื้อราเกินขีดจำกัดบนของช่วงของการพึ่งพาการสอบเทียบ ให้เตรียมตัวอย่างใหม่โดยเพิ่มการเจือจางด้วยน้ำแล้ววัดใหม่

10 ลักษณะทางมาตรวิทยา

ลักษณะทางมาตรวิทยาของวิธี PAT และ OTA สอดคล้องกับเงื่อนไขที่กำหนดในตารางที่ 3


ตารางที่ 3 - ความแม่นยำของวิธี HPLC-MS/MS

ช่วงการวัด µg/dm	ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ของการทำซ้ำ%	ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ของการทำซ้ำ%
เมื่อกำหนด PAT (ไม่มีแล้ว)
เมื่อกำหนด OTA (ไม่มาก)

ขีดจำกัดของการตรวจจับ PAT และ OTA ในตัวอย่างผลิตภัณฑ์น้ำผลไม้คือ: LOD- 0.03 ไมโครกรัม/dm LOQ- 0.1 mcg / dm.

11 การควบคุมคุณภาพของผลการวัด

การควบคุมคุณภาพของผลการวัดในห้องปฏิบัติการเกี่ยวข้องกับการตรวจสอบความเสถียรของผลการวัดโดยใช้การตรวจสอบความเสถียรของค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของความแม่นยำระดับกลาง การทดสอบความเสถียรดำเนินการโดยใช้แผนภูมิควบคุมของ Shewhart ความถี่ของการตรวจสอบความเสถียรของผลลัพธ์ของการวัดที่ดำเนินการจะถูกควบคุมในเอกสารภายในของระบบคุณภาพ ในกรณีที่ผลการควบคุมไม่เป็นที่น่าพอใจ เช่น เมื่อเกินขีดจำกัดการดำเนินการหรือเกินขีดจำกัดการเตือนเป็นประจำ จะพบสาเหตุของการเบี่ยงเบนเหล่านี้ รวมถึงการเปลี่ยนรีเอเจนต์ การตรวจสอบการทำงานของผู้ปฏิบัติงาน
GOST 12.1.007.

ความสนใจ!เมื่อทำงานกับสารพิษจากเชื้อรา ควรคำนึงว่า PAT และ OTA มีคุณสมบัติเป็นพิษที่รุนแรง โดยมีผลต่อไตอย่างชัดเจน ภูมิคุ้มกันบกพร่อง ทำให้ทารกอวัยวะพิการ และเป็นพิษต่อพันธุกรรม ตามการจำแนกประเภท IARC OTA หมายถึงสารก่อมะเร็งที่อาจเป็นอันตรายต่อมนุษย์ (กลุ่ม 2B) ต้องปฏิบัติตามข้อควรระวังด้านความปลอดภัยที่มากขึ้นเมื่อทำงานกับสารพิษจากเชื้อรา บุคลากรในห้องปฏิบัติการควรสวมชุดป้องกัน รวมทั้งกระบังหน้า ถุงมือ และแว่นตา การดำเนินการกับสารพิษจากเชื้อราทั้งหมดจะดำเนินการในตู้ดูดควัน หลังจากเสร็จสิ้นการทำงาน เครื่องแก้วที่ใช้แล้วในห้องปฏิบัติการและของเสียจะถูกกำจัดการปนเปื้อน

ภาคผนวก A (บังคับ). การตรวจสอบสเปกโตรโฟโตมิเตอร์และการกำหนดปัจจัยการแก้ไข CF สำหรับการคำนวณความเข้มข้นมวลของสารพิษจากเชื้อราในสารละลายมาตรฐาน

ภาคผนวก A
(บังคับ)

การตรวจสอบสเปกโตรโฟโตมิเตอร์และการกำหนดปัจจัยการแก้ไขสำหรับการคำนวณความเข้มข้นมวลของสารพิษจากเชื้อราในสารละลายมาตรฐาน

ก.1 เพื่อตรวจสอบความเข้มข้นมวลของสารพิษจากเชื้อราในสารละลายสต็อค (ดู 7.4.1.1 และ 7.4.2.1) ให้ใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่เหมาะสมสำหรับการวัดค่าการดูดกลืนแสงของสารละลายในคิวเวตต์แบบควอตซ์ที่มีความยาวเส้นทางแสง 1 ซม. ในช่วงความยาวคลื่นตั้งแต่ 200 นาโนเมตร ถึง 400 นาโนเมตร

การสอบเทียบเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ดำเนินการดังนี้

วัดความหนาแน่นเชิงแสงของสารละลายโพแทสเซียมไดโครเมต (KCrO) สามตัวในกรดซัลฟิวริก (HSO) - 0.25; 0.125 และ 0.0625 mmol / dm ที่จุดดูดซับสูงสุด (ความยาวคลื่นประมาณ 350 nm) โดยใช้สารละลายกรดซัลฟิวริก (HSO) ควบคุมด้วยความเข้มข้น 0.009 mmol / dm

จากนั้นจึงคำนวณค่าสัมประสิทธิ์โมลาร์ของความหนาแน่นเชิงแสง m/mol สำหรับแต่ละความเข้มข้นของโพแทสเซียม ไดโครเมตตามสูตร

โดยที่ค่าที่วัดได้ของความหนาแน่นเชิงแสงของสารละลายโพแทสเซียมไดโครเมตในกรดซัลฟิวริกสำหรับความเข้มข้นที่สอดคล้องกันคือหน่วย อ๊อฟ;

- ความเข้มข้นของสารละลายโพแทสเซียม ไดโครเมตในกรดซัลฟิวริก mmol/dm

หากความแตกต่างระหว่างค่าที่วัดได้สามค่าอยู่นอกช่วงที่รับประกันความถูกต้องของการวัดความหนาแน่นของแสง ให้ตรวจสอบขั้นตอนการสอบเทียบหรืออุปกรณ์ คำนวณค่าเฉลี่ยเลขคณิต

กำหนดปัจจัยการแก้ไข (ค่าไร้มิติ) สำหรับอุปกรณ์เฉพาะ (สเปกโตรโฟโตมิเตอร์และคิวเวตต์) ตามสูตร

โดยที่ค่าคุณลักษณะของสัมประสิทธิ์ความหนาแน่นเชิงแสงของโมลาร์สำหรับสารละลายโพแทสเซียมไดโครเมต (KCrO), m/mol คือที่ไหน

- ค่าสัมประสิทธิ์โมลาร์ของความหนาแน่นเชิงแสง คำนวณตามสูตร (ก.1), m/mol

หากค่าตัวประกอบการแก้ไขที่เป็นผลลัพธ์น้อยกว่า 0.95 หรือมากกว่า 1.05 จะต้องตรวจสอบขั้นตอนการสอบเทียบหรืออุปกรณ์เพื่อขจัดความเบี่ยงเบน (ใช้คิวเวตชุดเดียวกันสำหรับการสอบเทียบและความบริสุทธิ์) -

ภาคผนวก B (ข้อมูล) ตัวอย่างระบบ HPLC-MS/MS สำหรับการตรวจวัดสารพิษจากเชื้อราในน้ำผลไม้และผลิตภัณฑ์น้ำผลไม้อื่นๆ*

ภาคผนวก B
(อ้างอิง)

________________
* ตัวอย่างเหล่านี้ได้รับการแนะนำและจัดทำขึ้นเพื่อความสะดวกของผู้ใช้มาตรฐานสากลนี้

B.1 ระบบ HPLC-MS/MS หมายเลข 1

แพลตฟอร์มฮาร์ดแวร์: Varian 320-MS LC/MS/MS

อิออน