Методы определения микотоксинов. Лабораторные методы диагностики микотоксикозов. Микотоксины и методы их определения
После рождения щенков для суки и ее владельцев начинается ответственный период, когда следует заботиться не только о кормлении и состоянии здоровья суки, но и новорожденных малышей. После рождения шенков первые один-два дня у суки может быть плохой аппетит, расстройство желудка, особенно если она съела много последов.
Помните, что в этот период не следует прибегать к помощи антибиотиков - это вредно отразится на здоровье малышей. Старайтесь обойтись более безопасными препаратами (такими, как травы, пробиотики, промывание желудка, активированный уголь, а лучше лигнитин). Очень хорошие результаты в этом случае дает использование абсолютно безвредных гомеопатических препаратов фирмы «Хеель», причем не обязательно искать именно ветеринарные, «человеческие» работают не хуже. Попробуйте сделать одну-две подкожные инъекции «Эхинацеи композитум», «Нукс вомика», «Беребе-рис-гоммакорд». Хорошие результаты дает применение препарата в таблетках этой же фирмы «Диар-хеель». Препарат дают 3 раза в сутки по 1 таблетке. Результаты лучше, если ее предварительно растворить в 1,5 ложках кипяченой воды и тщательно размешать.
В первые три дня после родов нужно соблюдать осторожность в кормлении, чтобы не усугубить возможное расстройство. Зарубежные авторы в этот период предлагают давать суке вареных мелких цыплят, перемолотых вместе с костями и смешанных с вареным рисом.
После того, как пройдут первые дни после родов, у суки заметно улучшается аппетит, и это вполне естественно - потребности ее организма заметно возрастают. Начинает активно вырабатываться вначале молозиво, а потом и молоко. В значительной степени количество и качество молока зависят не только от индивидуальных особенностей суки, но и от ее кормления.
В первую неделю количество корма превышает обычный рацион в 1,5 раза. Но в этот период не следует давать суке слишком много мяса, чтобы не вызвать эклампсию. В качестве белковой составляющей в это время можно давать рыбу или творог. Кормить суку следует часто (через 4-5 часов), небольшими порциями. После восстановления нормальной функции желудка необходимо возобновить дачу минеральной подкормки и средств для укрепления шерсти.
- мясо, рыба и субпродукты - 45%,
- крупа - 30%,
- молоко и молочные продукты - 10%,
- овощи - 15%.
Для того чтобы у кормящей суки было больше молока, ей следует включать в рацион продукты, способствующие лактации: сырую морковь, мясо, рыбу, бульон, геркулес и т. д. Как можно чаще предлагайте суке пить: молоко (если у суки оно не вызывает расстройства), чай с молоком, слабый кофе с молоком. В качестве средств, увеличивающих количество молока, можно испробовать следующее:
- отвар душицы;
- отвар мелиссы: одну чайную ложку травы залить двумя стаканами кипятка, дать настояться, добавить сахар;
- две чайные ложки чая поместить в термос, залить двумя стаканами кипящего молока, дать настояться в течение 3-4 часов, после чего, добавив сахар, остудить;
- отвар аниса.
Апилак, который многие владельцы дают сукам для увеличения лактации, в моей практике желанных результатов не дал, хотя я пробовала его давать разным сукам.
Если собака наотрез отказывается пить, можно, конечно, попробовать напоить ее насильно, но лучше сначала попытаться ее «обмануть», положив в еще достаточно теплое питье маленький кусочек сливочного масла. Очень может быть, что запах сливочного масла ее соблазнит.
Чтобы не допускать истощения суки, кормление ее в этот период должно быть полноценным и пища должна содержать достаточное количество калорий, белков, витаминов и минеральных веществ.
Однако на протяжении всего периода лактации количество пищи не постоянно. Как уже говорилось, в первую неделю рацион должен быть увеличен в 1,5 раза. По мере увеличения количества молока у суки должен увеличиваться и рацион: во вторую неделю рацион - в два раза, а с третьей недели и до конца лактации - в три раза: Сравнение проводится с рационом собаки при ее обычном состоянии. Количество корма, необходимое суке, зависит и от величины ее помета. Четыре щенка в помете требуют двукратного увеличения рациона, а восемь щенков - как минимум трехкратного.
Обычно сука кормит щенков 4-6 недель. Количество молока, выделяемое сукой, не постоянно на протяжении всей лактации. До 20-25-го дня количество молока возрастает, а затем снижается. Западные специалисты предлагают очень легкий способ расчета калорийности корма в этот период. Этот способ заключается в том, что взвешивают весь помет в 3-4-суточ-ном возрасте, добавляют на каждый килограмм массы щенков в рацион суке 250 кал дополнительной энергии и в соответствии с этим увеличивают количество и калорийность пищи.
Продолжительность лактации зависит от индивидуальных особенностей и кормления собаки. В каждом случае, естественно, следует учитывать индивидуальные особенности собаки. Бывают суки, которых щенки буквально «высасывают», молоко у них вырабатывается долго, в больших количествах, и щенков они кормят до двух месяцев. Естественно, их рацион должен быть больше и полноценнее, чем у сук, у которых молока мало даже в самый «пик молочности», совпадаюший с 14-17-м днем лактации, и владелец которых просто мечтает, чтобы она докормила детей до трех недель. В большой степени на молочность суки оказывает влияние полноценная белковая пища, богатая незаменимыми аминокислотами. Недостаток аминокислот сказывается в первую очередь на качестве молока, а также на его количестве, а это вызывает снижение темпов роста щенков и замедляет их развитие.
Большую роль в питании лактирующих сук играют и витамины. Они нужны не только для самих сук, но и для развития щенков. Необходимо следить за тем, чтобы весь период лактации сука получала необходимое количество витаминов. Например, содержание в молоке витамина А, столь необходимого для роста щенков, зависит только от наличия его в корме* матери. Поэтому владелец должен следить за постоянным присутствием этого витамина в рационе кормящей суки. Это касается и витамина D, и витаминов группы В, которые в большом количестве выделяются через молоко собаки.
Для образования молока суке требуется такое же количество дополнительной энергии, сколько ее содержится в выделяемом молоке. Поэтому энергетическая ценность рациона будет в первую очередь зависеть от молочности суки. Калорийность корма зависит и от периода лактации. Известно, что в первую и вторую недели лактации у суки молока выделяется меньше, чем в третью и четвертую. Поэтому рацион следует составлять так, чтобы в первую половину периода лактации энергоемкость корма увеличилась в 2 раза, во втором - в 3 раза по сравнению с потребностью суки в обычном состоянии. На практике это выглядит следующим образом: кормящей суке с массой тела 10 кг для образования молока в первой половине лактации необходим добавочный рацион с калорийностью 750 ккал в дополнение основному, а в последующие две недели - 1500 ккал ежедневно.
Сразу после родов молочные железы суки выделяют молозиво. Надо следить за тем, чтобы каждый новорожденный щенок обязательно получил молозиво, содержащее специфические антитела.
Большое значение для образования молока имеют минеральные вещества, недостаток которых вызывает различного рода заболевания остеодистрофического характера не только у кормящих сук, но и у потомства. При этом костяк лактирующих сук обедняется минеральными веществами и становится пористым, непрочным, появляется остеопороз, а у новорожденных щенков - рахит. Важно профилактическое накопление минеральных резервов в период беременности, а у молодых сук - в период роста и подготовки их к первой лактации. Кормящие суки нуждаются и в большем количестве поваренной соли по сравнению с некормящими.
Качественный состав и суточная энергоемкость рационов лактирующих сук массой 5 кг в первую-вторую и третью-четвертую недели лактации
Качественный состав и суточная энергоемкость рационов лактирующих сук массой 15 кг в первую-вторую и третью-четвертую недели лактации
Качественный состав и суточная энергоемкость рациона лактирующих сук массой 25 кг в первую-вторую и третью-четвертую недели лактации
Методы определения микотоксинов
Современные методы обнаружения и определения содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количественные, аналитические и биологические методы. Методология микотоксинов развивается очень быстро. Число разработанных методов и различных модификаций достигло уже нескольких сотен и продолжает нарастать.
Скрининг-методы, отличающиеся простотой и быстротой проведения анализов, позволяют быстро и надежно "отсеивать" незагрязненные образцы. К ним относятся такие широко распространенные методы, как миниколоночный способ выявления афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона; ТСХ-методы для одновременного определения до 30 различных микотоксинов; флюоресцентный метод обнаружения загрязнения афлатоксинами, и др.
Количественные аналитические методы определения микотоксинов могут быть подразделены на химические, радиоиммунохимические и иммуноферментные. Химические методы в настоящее время являются наиболее распространенными и включают последовательные стадии выделения и собственно количественного определения микотоксинов. Стадия выделения состоит из двух этапов: экстракция - отделение микотоксина от субстрата, и очистка - отделение микотоксина от соединений с близкими физико-химическими характеристиками. Окончательное разделение микотоксинов осуществляют с помощью одно - или двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем в различных системах растворителей, газовой и газо-жидкостной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс - спектрометрии. Количественное определение микотоксинов проводят обычно путем прямого сравнения интенсивности флюоресценции при ТСХ в ультрафиолете со стандартами известной концентрации как визуально, так и денситометрически. Для повышения надежности методов применяют различные подтверждающие тесты, основанные на получении производных микотоксинов с иными хроматографическими, колометрическими или флюориметрическими характеристиками.
Последние годы характеризуются усилением внимания к разработке высокочувствительных и высокоспецифических радиоиммунохимических и иммуноферментных методов обнаружения, идентификации и количественного определения микотоксинов. Эти методы основаны на получении антисывороток к конъюгантам микотоксинов с бычьим сывороточным альбумином. Преимуществом их является исключительная чувствительность, позволяющая выявлять пикограммы микотоксинов, и вести разработки в направлении автоматизации процесса определения. Биологические методы, обычно не отличающиеся высокой специфичностью и чувствительностью, применяются главным образом для выявления микотоксинов, для которых отсутствуют химические методы анализа, или в качестве подтверждающих тестов. Тест-объектами служат различные микроорганизмы, куриные эмбрионы, многие лабораторные животные, культуры клеток и тканей .
Для определения содержания микотоксинов в составе пищевых продуктов проводят пробоподготовку методом твердофазной экстракции на концентрирующих патронах «Диапак» (п. 3.2.3). Разделение, иден-тификацию и количественное определение микотоксинов в подготовленных пробах осущест-вляют методом высокоэффекти-вной жидкостной хроматографии на микроколоночном хроматог-рафе серии «Милихром–5» в модульном исполнении (рис. 12).
Рис. 12. Микроколоночный хроматограф
В работе рассматривается обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ для определения патулина. Детектирование проводят на длине волны 276 нм. Для точной идентификации патулина использу-ют также многоволновое детектирование, позволяющее применить в качестве дополнительного параметра идентификации спектральные отно-шения. Разделение осуществляют в режиме градиентного элюирования, что позволяет повысить разрешающую способность и чувствительность анализа.
Рис. 13. Жидкостный хроматограф:
1 – насос; 2 – узел ввода проб; 3 – хроматографическая колонка; 4 – детектор;
5 – слив для элюата или коллектор для фракций; 6 – регистратор (самописец,
интегратор или персональный компьютер)
6
4
Анализ пробы с помощью жидкостного хроматографа (рис. 13) осуществляется следующим образом. Определенный объем раствора анализируемой пробы с помощью узла ввода проб (2) вводится в верхнюю часть хроматографической колонки (3). С помощью насоса (1) анализируемая смесь прокачивается элюентом через хроматогра-фическую колонку (3), в которой происходит разделение анализируемой смеси на отдельные фракции (компоненты). Вытекающий из колонки элюат, содержащий разделенные компоненты, анализируется детектором (4), показания которого фиксируются регистратором (6).
Методические основы ВЭЖХ
Элюотропные ряды. Элюирующей силой элюента называется способность элюента (растворителя или смеси растворителей) вытеснять адсорбат с поверхности адсорбента. При этом чем сильнее молекулы элюента адсорбируются на активных центрах сорбента, тем выше его элюирующая сила. Расположенные в ряд по возрастанию элюирующей силы растворители образуют элюотропный ряд .
В качестве элюентов для обращенно-фазовой хроматографии используются смеси растворителей, содержащие воду и органические соединения, модифицирующие элюирующую силу – н-спирты, ацетонитрил, тетрагидрофуран и другие, образующие с водой истинные растворы. В нормально-фазовой хроматографии в качестве элюентов используют полярные модификаторы – линейные и циклические углеводороды (гексан, циклогексан, гептан и др.).
Детекторы для жидкостных хроматографов. В настоящее время разработано более 20 детекторов для ВЭЖХ. Наибольшее распространение получили пять, три из которых являются оптическими, а два – электрохимическими. Эти пять детекторов позволяют анализировать все классы органических и неорганических веществ.
К оптическим детекторам относят спектрофотометрический детектор (ультрафиолетовый (УФ), работающий в волновом диапазоне
200–360 нм и видимый с волновым диапазоном 360–780 нм), флуориметрический и рефрактометрический детекторы; к электро-химическим – вольтамперометрический и кондуктометрический детекторы. Особое значение имеет масс-спектрометрический детектор, обладающий уникальной информативностью, так как позволяет проводить идентификацию хроматографически разделенных компо-нентов, используя базы данных масс-спектров веществ.
Спектрофотометрический детектор является наиболее распространенным детектором для ВЭЖХ. Принцип его действия основан на известном законе светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера . Спектро-фотометрический детектор регистрирует спектры избира-тельного абсорбционного поглощения излучения веществом. Спектры поглощения зависят от строения исследуемого вещества. Это позволяет идентифицировать вещество по его спектру, располагая библиотекой спектров или стандартами. Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера интенсивность полос спектров зависит от концентрации вещества, что является основой количественного анализа, т. е. определения концентра-ции вещества.
Пусть монохроматический свет от источника интенсивностью I 0 попадает на кювету длиной l (оптический путь). Кювета заполнена раствором вещества с концентрацией С . Вещество способно поглощать монохроматическое излучение. Мерой способности поглощения данного монохроматического излучения служит величина ε – коэффициент молярного поглощения, или коэффициент экстинкции. Из кюветы выходит ослабленный световой пучок интенсивностью I . Согласно закону светопоглощения при длине волны λ= const
I = I 0 ∙10 -ε Cl , (7)
где I
– интенсивность светового потока после прохождения кюветы;
I
0 – интенсивность падающего светового потока; ε
– коэффициент экстин-кции; С
– молярная концентрация вещества в кювете; l
– длина кюветы.
Отношение I к I 0 , выраженное в процентах, называется пропусканием Т , а величина А=lg(I 0 / I ) – оптической плотностью.
A=lg(I 0 /I)= ε С∙ l . (8)
Оптическая плотность вещества прямо пропорциональна концентрации анализируемого вещества. В спектрофотометрических детекторах аналитической величиной является оптическая плотность А . Формула (8) служит основой количественного анализа при использовании спектрофотометрического детектора, так как оптическая плотность А вещества прямо пропорциональна высоте или площади хроматографического пика.
Зависимость оптической плотности А от длины волны падающего на кювету с веществом света в диапазоне длин волн от 190 до 360 нм называется ультрафиолетовым спектром поглощения (рис. 14).
200 230 260 290 320 350 λ , нм
А
, е.о.п.
Рис. 14. Ультрафиолетовый спектр поглощения водного раствора
вещества х
3.2.3. Пробоподготовка образцов
Любое вещество имеет длину волны максимального поглощения(λ , нм). При использовании данной длины волны детектор имеет наименьший порог обнаружения вещества.
С помощью спектрофотометрического детектора (СФД) детектируется большое количество веществ различных классов, поглоща-ющих ультрафиолетовый свет.
Использование спектрофотометрического детектора в хроматогра-фии значительно облегчает идентификацию. Многоволновый детектор в сочетании с программным обеспечением позволяет получить хроматограмму на нескольких длинах волн одновременно и рассчитать дополнительный параметр для идентификации компонентов – спектральное отношение (Q ) – отношение высот хроматографического пика на разных длинах волн
где А 1 и А 2 – коэффициенты оптической плотности на длинах волн 1 и 2. Величина Q для каждого вещества является постоянной характеристикой и не зависит от его концентрации. Точность спектральных отношений зависит от значений оптической плотности вещества и конструкции детектора.
Пробоподготовка образцов при помощи метода твердофазной экстракции на концентрирующих патронах обеспечивает экономию временных и трудовых затрат. Твердофазная экстракция позволяет сконцентрировать пробу и очистить ее от сопутствующих примесей. Комплексная схема твердофазной экстракции предусматривает последовательное использование двух патронов:
– универсального концентрирующего патрона «ДИАПАК П-З» – патрона многоразового применения (до 50 проб) с набором верхних и нижних фильтров (10 шт.);
– универсального патрона для тонкой очистки «ДИАПАК С» – патрон одноразового применения.
Для подготовки концентрирующих патронов необходимо выполнить следующие операции.
Для подготовки концентрирующего патрона «ДИАПАК П-З» :
– прокачать через патрон 10 мл смеси вода-ацетонитрил (58:42);
– непосредственно перед проведением пробоподготовки прокачать через патрон 10 мл дистиллированной воды.
Для подготовки концентрирующего патрона «ДИАПАК С» :
– прокачать через патрон 5 мл бензола и заглушить патрон с обоих концов.
Подготовка пищевого продукта к концентрированию
Навеску пробы массой 10,0 г поместить в стеклянный стакан, смешать с небольшим количеством дистиллированной воды и коли-чественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл. В колбу внести по 6,0 мл раствора Карреза I и раствора Карреза II. Содержание колбы довести дистиллированной водой до метки, тщательно перемешать и отфильтровать в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Измерить объем прозрачного фильтрата П.
При подготовке осветленных соков и напитков отфильтровать пробу через плотный бумажный фильтр до получения 20 мл прозрачного фильтрата П.
Концентрирование пробы на патроне «ДИАПАК П-З»
Весь объем фильтрата П нанести на предварительно подготовленный патрон со скоростью 1–2 капли в секунду.
Промыть патрон 5 мл бидистиллированной воды, отбрасывая все смывы.
Элюировать патулин с патрона 10 мл этилацетата в колбу или мерную пробирку с пришлифованной пробкой, содержащую 5 мл
1,5%-ного водного раствора карбоната натрия, закрыть пробкой, интенсивно перемешать и дать расслоиться.
Собрать осушительную колонку, заполнив корпус с фильтром примерно 2 г безводного сульфата натрия, уплотнить осушитель постукиванием по стенке колонки и зафиксировать ватным тампоном.
Декантировать верхний этилацетатный слой при помощи пипетки, профильтровать через осушительную колонку, собирая фильтрат в отгонную сердцевидную колбу на 50 мл; дополнительно проэкстрагировать водный раствор карбоната натрия сначала 10 мл, а затем 5 мл этилацетата и, после расслоения, последовательно профильтровать декантированные объемы этилацетата через осушительную колонку в ту же колбу.
Упарить этилацетат в вакууме при температуре не выше 40°С до объема около 0,5 мл (не упаривать досуха!), добавить 2,5 мл бензола (соблюдать соотношение объемов 1:5).
Очистка пробы на патроне «ДИАПАК С»
Снять заглушки с подготовленного патрона и пропустить бензол-этилацетатный раствор пробы со скоростью 1–2 капли в секунду. Обмыть колбу еще 0,5–1,0 мл смеси бензол-этилацетат (85:15) и нанести на патрон, отбросив смывы.
Элюировать патулин с патрона 6 мл смеси бензол:этилацетат (7:3), собирая элюат в сердцевинную отгонную колбу.
Упарить элюат досуха на суховоздушной бане при температуре не более 40°С.
Немедленно! После упаривания перерастворить пробу в 0,2–0,25 мл элюента А (п. 3.2.4.2), охлажденного до 5–8°С.
3.2.4. Порядок выполнения работы
Цель работы – определение содержания микотоксина патулина в составе пищевых продуктов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на микроколоночном хроматографе серии «Милихром–5».3.2.4.1. Методика измерений
Проведение измерений включает следующие основные этапы:– градуировку хроматографа по растворам с известной массовой концентрацией патулина;
– подготовку пищевой пробы методом твердофазной экстракции по пп. 3.2.3;
– анализ экстракта методом ВЭЖХ с регистрацией сигнала УФ детектором;
– идентификацию патулина по параметрам удерживания и спектральным отношениям;
– вычисление массовой концентрации патулина в пробе на основе зарегистрированного аналитического сигнала (высоты пика) и градуировочного графика;
– вычисление массовой доли патулина в составе пищевого продукта.
Приборы, реактивы и материалы, необходимые для выполнения работы:
– хроматограф серии «Милихром–5» или любой другой хроматограф для ВЭЖХ с программным обеспечением WinXrom или Мультихром;
– хроматографическая колонка для ВЭЖХ: Диасфер–110–С10СN (5 мкм, 2×80 мм, ТУ 4215–001–05451931–94);
– дозатор переменного объема на 1–100 мкл;
– дозатор переменного объема на 100–1000 мкл;
– коническая колба с плотно притертым шлифом емкостью до 10 мл;
– мембранные фильтры;
– набор стандартных растворов патулина с концентрацией – 1, 2, 5 и 10 мг/л;
– фосфорная кислота 85%-ная;
– ацетонитрил для жидкостной хроматографии (о.с.ч. ТУ 6–09–3513–86, УФ поглощение до 200 нм);
– гексан, химически чистый (ректифицированный);
– трифторуксусная кислота;
– раствор Карреза I – 15,0 г гексацианоферата II калия растворить в 100 мл воды.
– раствор Карреза II – 30,0 г ацетата цинка растворить в 100 мл воды;
– элюенты А, Б и С.
Приготовление элюентов
Элюент А. В мерную колбу с плотно притертым стеклянным шлифом емкостью 100 мл вносят 20 мл ацетонитрила и 0,5 мл 10%-ного раствора трифторуксусной кислоты. Раствор тщательно перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой, предварительно отфильтрованной через мембранный капроновый фильтр (0,2 мкм). Затем проводят дегазацию элюента вакуумированием в течение 1 минуты при разрежении 1кг∙с/см 2 .
Элюенты Б и С готовят также как элюент А, только на 100 мл раствора берут 10 и 0 мл ацетонитрила, соответственно.
3.2.4.2. Установка хроматографических режимов разделения
и регистрации результатов
Для проведения измерений необходимо установить рабочие режимы хроматографа.Режимы дозатора:
– регенерация – 300 мкл;
– объем пробы – 5 мкл;
– расход элюента – 150 мкл/мин;
– режимы градиентного элюирования: 800 мкл – элюента А,
500 мкл – элюента Б, 300 мкл – элюента С;
– температура термостата – 35 0 С.
Режимы детектирования:
– число длин волн – 3;
– длины волн – 250, 276, 290 нм;
– время измерения – 0,04 с.
Кондиционирование хроматографической системы осуществляют за 30 минут до проведения измерений путем выполнения «холостого» анализа, в котором стандартную смесь, содержащую патулин, заменяют 5–10 мкл элюента, а затем проводят разделение стандартной смеси микотоксинов.
Задание 1. Изучить методику пробоподготовки пищевых продуктов для определения содержания патулина. Приготовить пробы в соответствии с п. 3.2.3.
Задание 2. Провести градуировку хроматографа. Градуировку хроматографа осуществляют последовательным вводом стандартных растворов патулина с концентрациями 1, 2, 5 и 10 мг/л.
Под руководством преподавателя предлагается с клавиатуры ПК в программу (WinXrom) ввести параметры проведения хроматографического разделения (пп. 3.2.4.3) и запустить в автоматическом режиме 2–4 хроматографических анализа. Результаты оформить в виде табл. 6.
Т а б л и ц а 6
На основе полученных хроматографических профилей построить калибровочный график (по оси ординат откладывается концентрация – мг/л, по оси абсцисс оптическая плотность микотоксина А – е.о.п.).
Задание 3. Идентифицировать в исследуемом образце пищевого продукта патулин и определить его концентрацию.
Под руководством преподавателя запустить измерение подготовленной пробы пищевого продукта в автоматическом режиме
(с параметрами хроматографического разделения, выбранными в задании 2). По окончании измерения провести идентификацию микотоксина патулина по файлу стандарта («СтандартДД–ММ–ГГ.001»), полученному в задании 2. Используя калибровочный график, построенный в задании 2, определить концентрацию патулина в пробе пищевого продукта.
Результаты занести в табл. 7.
Т а б л и ц а 7
Массовую концентрацию патулина в пробе пищевого продукта вычисляют по формуле
где С – массовая концентрация патулина в пробе, мг/л (вычисляется по градуировочной зависимости, исходя из значения высоты аналитического пика); V p – объем пробы, мл; R – степень извлечения микотоксина на стадии пробоподготовки (равна 60%); М пр – масса пробы пищевого продукта, использованной для очистки и последующего хроматографического определения, г.
Результат измерения массовой доли микотоксина в определяемом объекте представляют в следующем виде: Х ± мг/кг; при Р =0,95 и заносят в протокол (прил. 1), где X i , – массовая концентрация патулина в пробе, мг/кг; Р – вероятность; – граница абсолютной погрешности, вычисляемая по формуле
После получения результата необходимо оценить значения нормативов оперативного контроля сходимости, которые приведены в соответствующих ГОСТах на методы контроля (анализа).
Сделать заключение о соответствии (или несоответствии) содержания патулина в исследованном пищевом продукте допустимым уровням, установленным СанПиН 2.3.2.1078–01.
Вопросы для самоконтроля
1. Какие принципы лежат в основе классификации хроматографических методов анализа?
2. В чем сущность хроматографического разделения? Как проводят качественную идентификацию и количественный анализ?
3. В каких пищевых продуктах нормируется содержание микотоксинов? Какие микотоксины определяют в составе пищевых продуктов в соответствии с требованиями СанПиН?
4. Какой хроматографический метод используют для определения содержания микотоксинов в составе пищевых продуктов?
5. На чем основано спектрофотометрическое детектирование? Что такое спектральные отношения и для чего их используют?
6. Как проводят пробоподготовку пищевых продуктов для определения содержания патулина методом ВЭЖХ?
7. Проведение каких операций включает методика определения патулина методом ВЭЖХ?
8. Что такое элюент и градиентное элюирование? Какие элюенты используют при определении патулина методом ВЭЖХ?
9. Как проводят идентификацию патулина и его количественное определение?
10. Как обеспечивается точность определения патулина методом ВЭЖХ?
Методы определения микотоксинов
Современные методы обнаружения и определения содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количественные аналитические и биологические методы.
Скрининг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения серийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и незагрязненные образцы. К числу скрининг-методов относятся методы тонкослойной хроматографии (ТСХ-методы), флуоресцентный метод определения зерна, загрязненного афлатоксинами.
Количественные аналитические методы определения микотоксинов представлены химическими, радиоиммунологическими и иммуноферментными методами. Сегодня наиболее распространенными являются химические методы, включающие две стадии: стадию выделения и стадию количественного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от соединений с близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение и количественное определение микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов. Универсальным методом определения всех видов микотоксинов является тонкослойная хроматография (ТСХ).
При отборе проб из партии продукта основной задачей является получение среднего образца или средней пробы, по концентрации микотоксинов являющейся представительной для всей партии (отобранные образцы должны характеризовать качество всей партии). Выполнение этой задачи зависит от природы и распределения микотоксинов, характеристики продукта (сырой, обработанный, сыпучий, жидкий, пастообразный и т. д.), способа подготовки образца. К примеру, загрязнение арахиса афлатоксинами имеет выраженный гетерогенный характер: в отдельных зернах арахиса их содержание может колебаться от тысячных долей миллиграмма до десятков и более миллиграммов на 1 кг, т. е. различаться на 5-6 порядков. По этой причине вклад ошибки при отборе пробы в общую ошибку анализа при определении афлатоксинов в арахисе является основным и в ряде случаев может составлять более 90 %.
С точки зрения однородности загрязнения микотоксинами все продукты можно разделить на две группы: 1) продукты с высокой степенью неоднородности (очищенный и неочищенный арахис, масличные семена, целые или грубомолотые зерна, орехи); 2) продукты с однородным характером загрязнения (жидкости: молоко, растительные масла, соки, пюре; мука, размолотые шроты).
Для получения представительного среднего образца продуктов l-й группы размер исходного образца должен быть максимально возможным (не менее 2 кг), при этом средний лабораторный образец следует выделять из перемолотого (гомогенизированного) среднего образца.
Для однородных продуктов 2-й группы (джем, повидло, фруктовые соки в мелкой жестяной таре, сгущенное молоко, сухие молочные продукты и др.) пробы следует отбирать в количестве единиц упаковки, соответствующих величине среднего образца (100-200 г), при условии, что продукт происходит из одной партии.
Химические методы обнаружения и идентификации отдельных афлатоксинов основаны на их специфической флуоресценции в УФ-свете (около 365 нм), на различиях в подвижности при тонкослойной хроматографии, на специфичности их спектров поглощения и флуоресценции.
В отличие от афлатоксинов трихотецены не обладают поглощением или, флуоресценцией в видимой части спектра, что затрудняет их обнаружение при тонкослойной хроматографии. При этом выявить трихотецены с помощью ТСХ возможно при использовании методов, основанных на обработке ТСХ-пластин специальными реагентами, которые образуют с трихотеценами окрашенные или флуоресцирующие производные. К примеру, Т -2 токсин при обработке пластин; концентрированной серной кислотой образует пятна с голубой флуоресценцией;) в УФ-свете.
Арбитражными методами количественного определения микотоксинов являются следующие:
‣‣‣ газожидкостная хроматография (для Т-2 токсина);
‣‣‣ высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с использованием УФ-фотометрического детектора (для дезоксиниваленола и патулина);
‣‣‣ ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектора (для афлатоксинов; и зеараленона).
На рис. 2 представлено устройство современного жидкостного хроматографа в простейшем исполнении.
Подвижная фаза из емкости 1 через входной фильтр 9 подается насосом высокого давления 2 в систему ввода образца 3 - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Далее через фильтр 8 образец с током подвижной фазы поступает через предколонку в разделительную колонку 4. Далее поток подвижной фазы, выходящий из колонки и содержащий компоненты разделяемой смеси (элюат), поступает в детектор 5 и удаляется в сливную емкость 7. При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на регистратор 6 или в компьютер.
Устройство жидкостного хроматографа (изократическая система):
1 - емкость; 2 - система высокого давления; 3 - ручной инжектор или автосамплер; 4 - разделительная колонка; 5 - детектор; б - регистратор или компьютер; 7 - сливная емкость; 8 - фильтр; 9 - входной фильтр
Система, приведенная на рис. 2, является изократической: в процессе хроматографирования состав подвижной фазы не изменяется. В случае если в ходе хроматогфического анализа крайне важно изменять концентрацию одного или нескольких компонентов подвижной фазы, то применяют так называемые градиентные системы, состоящие обычно из двух или более насосов. В случае градиентного элюирования каждый растворитель подается из отдельного сосуда в специальную смесительную камеру с магнитной мешалкой, где по определенной программе происходит их смешивание с заданным соотношением объёмов.
Для анализа микотоксинов чаще применяются градиентные системы, где в качестве подвижной фазы используются растворы ацетонитрила в воде с линейно изменяющейся во времени концентрацией.
Хроматографическая колонка представляет собой металлическую трубку ой от 150 до 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, заполненную специальным сорбентом на базе силикагеля с привитыми углеводородными радикалами. Предколонка служит для защиты хроматографической колонки от загрязнений.
УФ-фотометрический детектор является наиболее распространенным видом детекторов для ВЭЖХ. Принцип действия детектора аналогичен принципу действия обычного спектрофотометра: он регистрирует оптическую плотность раствора. Различие состоит в том, что УФ-детектор является проточным, вместо кюветы с раствором в нем используется фотометрическая ячейка. Поток элюента протекает через рабочую ячейку, а через сравнительную ячейку направляется поток чистой подвижной фазы. Источником света служит ртутная лампа, дающая интенсивное УФ-излучение. Свет с нужной длиной волны выделяется с помощью подходящих оптических фильтров, проходит через ячейки, частично поглощается молекулами подвижной фазы и разделяемых компонентов и улавливается фотоприемником. Светопоглощение (оптическую плотность) элюата непрерывно регистрирует самописец или компьютер, записывая хроматограмму. Разделяемые компоненты смеси (к примеру, микотоксины) представлены на хроматограмме в виде пиков. Положение пика на хроматограмме используют для идентификации вещества, а площадь пика - для количественного определения.
Более сложное устройство представляет собой флуоресцентный (флуориметрический) детектор.
Размещено на реф.рф
Такой детектор использует способность органических соединений, в частности афлатоксинов и зеараленона, флуоресцировать под действием УФ- или видимого излучения. Флуоресцентный детектор имеет проточную ячейку с двумя взаимно перпендикулярными оптическими каналами. Один из них служит для подвода возбуждающего излучения, другой позволяет измерять интенсивность флуоресценции. В случае анализа афлатоксинов B 1 и М 1 длина волны возбуждающего излучения составляет 360 нм, а длина волны испускаемого излучения - 420 нм.
Следует отметить, что для анализа афлатоксинов можно применять также УФ-детектор, однако его чувствительность на порядок ниже, чем у флуориметрического детектора, в связи с этим при анализе низких концентраций афлатоксинов (на уровне ПДК и ниже) предпочтительным является флуоресцентное детектирование.
Методы определения микотоксинов - понятие и виды. Классификация и особенности категории "Методы определения микотоксинов" 2017, 2018.
ГОСТ 32835-2014
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ
Определение микотоксинов методом тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС)
Juice products. Determination of mycotoxins by tandem high performance liquid mass spectrometry (HPLC-MS/MS)
МКС 67.080.01
Дата введения 2016-01-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования "Московский государственный университет пищевых производств" (ФГБОУ ВПО "МГУПП")
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. N 45-2014)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
|
Армения | Минэкономики Республики Армения |
|
Беларусь | Госстандарт Республики Беларусь |
|
Киргизия | Кыргызстандарт |
|
Россия | Росстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2014 г. N 896-ст ГОСТ 32835-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2016 г.
5 Настоящий стандарт разработан с учетом положений следующих международных документов:
- CODEX STAN 247-2005* Codex General Standard For Fruit Juices And Nectars of the Codex Alimentarius Commission (Единый международный стандарт Комиссии Кодекс Алиментариус на фруктовые соки и нектары);
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить, перейдя по ссылке на сайт http://shop.cntd.ru . - Примечание изготовителя базы данных.
- Regulation of the Commission of the European Union of 23.02.2006 r. No. 406/2006/EC Laying down the sampling methods and methods of analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs (Регламент Комиссии Европейского союза от 23.02.2006 г. N 406/2006/ЕС "О методах отбора проб и методах анализа для официального контроля уровней микотоксинов в пищевых продуктах");
- AIJN Code of Practice for Evaluation of Quality and Authenticity of Fruit and Vegetable Juices of the European Fruit Juice Association (Свод правил для оценки качества и подлинности фруктовых и овощных соков Европейской ассоциации фруктовых соков).
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на соки и другую соковую продукцию из фруктов и овощей, за исключением клеток цитрусовых фруктов, и устанавливает метод определения микотоксинов - патулина и охратоксина А - с применением тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии в диапазоне измерений массовой концентрации патулина от 0,1 до 100,0 мкг/дм и охратоксина А от 0,1 до 20,0 мкг/дм.
Примечание - Настоящий стандарт рекомендуется применять в целях апробации и накопления дополнительной информации в части его применения.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ ISO 3696-2013 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля
ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
ГОСТ ИСО 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные. Типы. Основные параметры и размеры
ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб
ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов
ГОСТ 29030-91 Продукты переработки плодов и овощей. Пикнометрический метод определения относительной плотности и содержания растворимых сухих веществ
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835/1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 32689.1-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 1. Общие положения
ГОСТ 32689.2-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 2. Методы экстракции и очистки
ГОСТ 32689.3-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 3. Определение и подтверждение результатов
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Сокращения
ВЭЖХ-МС/МС - тандемная высокоэффективная жидкостная хроматомасс-спектрометрия;
ОТА - охратоксин А;
ПАТ - патулин;
ESI
- ионизация распылением в электрическом поле (Electrospray Ionization
);
IARC
- Международное агентство по исследованию онкологических заболеваний;
LOD
- предел детектирования;
LOQ
- предел количественного определения;
SRM
- идентификация компонентов в режиме контроля селективных реакций (Selected Reaction Monitoring
).
4 Сущность метода
Сущность метода заключается в предварительной экстракции микотоксинов ПАТ и ОТА ацетонитрилом в присутствии безводного сульфата магния, концентрировании, перерастворении в ацетонитриле и количественном определении массовой концентрации микотоксинов с применением ВЭЖХ-МС/МС с ионизацией распылением в электрическом поле и идентификацией компонентов в режиме контроля селективных реакций.
5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, стандартные образцы, реактивы и посуда
Система аналитическая ВЭЖХ-МС/МС* с трехквадрупольным масс-детектором для измерения в диапазоне масс от 10 до 3000 атомных единиц массы (а.е.м.), с точностью измерения массы не ниже 0,1 а.е.м, ионизацией распылением в электрическом поле, возможностями работы в режиме контроля выбранных реакций и сканирования дочерних и родительских ионов, минимальным отношением сигнал/шум 1000:1. Аналитическая система должна включать модуль ВЭЖХ, состоящий из бинарного насоса со смесителем, термостат хроматографической колонки, обеспечивающий температуру нагрева до 50°С, и хроматографическую колонку с обращенно-фазовым сорбентом зернением 5 мкм C длиной 150 мм и внутренним диаметром 3 мм. Применяемая система должна обеспечивать обнаружение микотоксинов в интервале от 0,1 до 100,0 мкг/дм.
________________
* Дополнительная информация о рекомендуемых ВЭЖХ-МС/МС системах приведена в приложении А.
Спектрофотометр диапазоном измерения, позволяющим проводить испытания при длине волны от 250 до 400 нм, допускаемой абсолютной погрешностью измерений оптической плотности не более 0,1%.
Весы по ГОСТ OIML R 76-1, обеспечивающие точность взвешивания с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,01 мг.
Баня ультразвуковая.
Центрифуга со скоростью вращения ротора 4000-5000 об/мин для пробирок вместимостью 50 см.
Центрифуга со скоростью вращения ротора 10000-12000 об/мин для пробирок типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см.
Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры до 200°С.
Холодильник бытовой по ГОСТ 16317 .
Встряхиватель для перемешивания.
Устройства дозирующие жидких проб постоянной или переменной вместимостью 20-1000 мм с относительной погрешностью дозирования фактического объема не более 2,5%.
Микрофильтр - насадка на шприц (регенерированная целлюлоза, диаметр 13 мм, размер пор 0,2-0,4 мкм).
Кюветы кварцевые рабочей длиной 1 см.
Микотоксины ПАТ и ОТА для использования в качестве образцов сравнения с содержанием основного вещества не менее 98%.
Кислота ледяная уксусная по ГОСТ 61 , ч.д.а.
Ацетонитрил для градиентной ВЭЖХ.
Метанол для градиентной ВЭЖХ.
Магний сернокислый безводный, х.ч.
Кальций хлористый безводный, гранулированный, х.ч.
Хлороформ по ГОСТ 20015 , х.ч.
Толуол по ГОСТ 5789 , х.ч.
Спирт этиловый абсолютированный.
Вода для лабораторного анализа степени чистоты 1 по ГОСТ ISO 3696.
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1, 2, 5, 10 см 2-го класса точности по ГОСТ 29227 .
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 5, 10, 25, 50, 100 и 1000 см исполнений 2 или 2а по ГОСТ 1770 .
Колбы остродонные вместимостью 10, 25 см.
Центрифужная пробирка типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см.
Микропробирка вместимостью 100-400 мм.
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 250 см любого исполнения по ГОСТ 1770 .
Пробирка для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см
Чашка фарфоровая диаметром 125-150 мм.
Эксикатор лабораторный вместимостью 3 дм.
Воронки лабораторные по ГОСТ 25336 .
Колбы плоскодонные вместимостью 50, 100, 250 см по ГОСТ 25336 .
Стаканы химические вместимостью 10, 20, 50, 100 и 200 см по ГОСТ 25336 .
Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также стандартных образцов, реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
6 Отбор проб
Отбор проб - по ГОСТ 26313 . Подготовка и хранение проб - по ГОСТ 26671 , ГОСТ 32689.1 , ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32689.3 .
7 Подготовка к проведению испытаний
7.1 Общие требования
Перед испытанием проводят предварительную подготовку лабораторной посуды, а также проверку качества реактивов и вспомогательных материалов согласно требованиям ГОСТ 32689.1 , ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32689.3 .
7.2 Приготовление вспомогательных растворов
7.2.1 Приготовление подвижной фазы А
В мерную колбу вместимостью 1000 см с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1 см ледяной уксусной кислоты, 100 см метанола и доводят до метки бидистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения подвижной фазы А при комнатной температуре - не более одного месяца.
7.2.2 Приготовление подвижной фазы Б
В мерную колбу вместимостью 1000 см с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1 см ледяной уксусной кислоты и доводят до метки метанолом. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения подвижной фазы Б при комнатной температуре - не более одного месяца.
Примечание - Недопустим контакт подвижной фазы с резиной и полимерными материалами [за исключением политетрафторэтилена (ПТФЭ)].
7.2.3 Приготовление растворителя 1
В подходящей емкости смешивают 99 объемных частей толуола и одну объемную часть ледяной уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения растворителя 1 при комнатной температуре - не более 6 мес.
7.3 Подготовка сернокислого магния
Используемый при проведении экстракции в качестве сорбента сернокислый безводный магний даже в пределах срока годности необходимо высушивать для удаления поглощенной влаги воздуха. Сорбент прокаливают при температуре 180°С - 200°С в течение 6-10 ч и хранят в эксикаторе над безводным хлористым кальцием. Критерием годности реактива служит отсутствие дополнительного водного слоя при нагревании раствора, проведении стадии экстракции до температуры 30°С - 40°С и через 2-3 мин перемешивания реакционной массы.
7.4 Приготовление исходных растворов микотоксинов
7.4.1 Приготовление растворов ПАТ
7.4.1.1 Приготовление исходного раствора ПАТ массовой концентрации 200 мкг/см
Берут 2,0 мг чистого кристаллического ПАТ, взвешенного с точностью 0,01 мг, растворяют в мерной колбе вместимостью 10 см в небольшом количестве хлороформа и затем доводят объем раствора хлороформом до метки.
Срок хранения исходного раствора ПАТ при температуре 0°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 1 мес.
7.4.1.2 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 20 мкг/см
Переносят 1 см полученного исходного раствора ПАТ (см. 7.4.1.1) в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят объем раствора хлороформом до метки. Для определения точной массовой концентрации ПАТ в растворе отбирают 5,0 см полученного стандартного раствора ПАТ и переносят в емкость вместимостью около 15 см, затем продуванием азотом удаляют хлороформ до получения сухого вещества. Сразу после получения сухого вещества вносят в емкость 5,0 см абсолютного этанола. Полностью растворяют ПАТ. Полученный раствор ПАТ вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см, затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервале длин волн от 250 до 350 нм, используя в кювете сравнения в качестве контроля абсолютный этанол.
Массовую концентрацию ПАТ в растворе , мкг/см, рассчитывают по формуле
где - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 275 нм), ед. ОП;
- молекулярная масса ПАТ, равная 153,1 г/моль;
- коэффициент пересчета;
- молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции), равный 14600, м/моль.
7.4.1.3 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 100 мкг/см
5 см исходного раствора ПАТ в хлороформе массовой концентрации 200 мкг/см (см. 7.4.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10 см, концентрируют до сухого остатка при комнатной температуре под током азота и немедленно перерастворяют в ацетонитриле, доводя им объем в колбе до метки.
7.4.1.4 Срок хранения растворов ПАТ по 7.4.1.2 и 7.4.1.3 при температуре 0°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 24 ч.
Перед использованием температуру растворов доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры). По причине деструкции ПАТ не допускается хранить образцы сравнения в виде тонкой пленки сухого вещества, полученной после удаления растворителя -.
7.4.2 Приготовление исходного раствора ОТА
7.4.2.1 Приготовление исходного раствора ОТА массовой концентрации 20 мкг/см
2,0 мг чистого кристаллического ОТА, взвешенного с точностью 0,01 мг, растворяют в химическом стакане вместимостью 25 см растворителем 1 (см. 7.2.3) и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят растворителем 1 объем раствора до метки.
Для определения точной массовой концентрации ОТА в растворе полученный исходный раствор ОТА вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см, затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервале длин волн от 300 до 370 нм, используя в кювете сравнения в качестве контроля растворитель 1.
Массовую концентрацию ОТА в исходном растворе , мкг/см, рассчитывают по формуле
где - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 333 нм), ед. ОП;
- молекулярная масса ОТА, равная 402,7 г/моль;
- коэффициент пересчета;
- поправочный коэффициент, определенный согласно приложению А;
- молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции), равный 544, м/моль.
Срок хранения исходного раствора ОТА при температуре минус 18°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более четырех лет.
7.4.2.2 Приготовление раствора ОТА массовой концентрации 5 мкг/см
Отбирают 2,5 см исходного раствора ОТА (7.4.2.1), переносят в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят растворителем 1 (см. 7.2.3) до метки.
Срок хранения раствора ОТА при температуре 4°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 24 ч.
Перед использованием температуру раствора доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры) -.
7.5 Приготовление градуировочных растворов ПАТ и ОТА
Градуировочные растворы ПАТ и ОТА готовят путем смешивания определенных объемов их исходных растворов (см. 7.4.1.1 и 7.4.2.1) с осветленным яблочным соком, который не содержит определяемые аналиты.
7.5.1 Приготовление градуировочных растворов ПАТ
7.5.1.1 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 1000 нг/см (раствор n
-1)
1 см раствора ПАТ (см. 7.4.1.3) или 1 см стандартного образца состава ПАТ массовой концентрации ПАТ 100 мкг/см переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.
7.5.1.2 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 10 нг/см (раствор n
-2)
1 см раствора -1 (см. 7.5.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.
7.5.1.3 Приготовление градуировочных растворов ПАТ
Отбирают в соответствии с таблицей 1 определенные объемы промежуточных растворов n
-1 и n
-2 (см. 7.5.1.1 и 7.5.1.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 см.
Таблица 1 - Объемы растворов n
-1 и n
-2 для приготовления градуировочных растворов ПАТ
Наименование показателя | Градуировочные растворы |
||||||
Объем раствора n
-2, см | |||||||
Объем раствора n
-1, см | |||||||
Количество введенного ПАТ, нг | |||||||
Массовая концентрация ПАТ в растворе, нг/см | |||||||
7.5.2 Приготовление градуировочных растворов ОТА
7.5.2.1 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 200 нг/см (раствор A
-1)
1 см раствора ОТА концентрацией 5 мкг/см (см. 7.4.2.2) концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре и немедленно переносят с помощью ацетонитрила в мерную колбу вместимостью 25 см.
7.5.2.2 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 10 нг/см (раствор А
-2)
0,5 см промежуточного раствора ОТА А
-1 (см. 7.5.2.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят ацетонитрилом раствор до метки.
7.5.2.3 Приготовление градуировочных растворов ОТА
Отбирают в соответствии с таблицей 2 определенные объемы промежуточных растворов А
-1 и А
-2 (см. 7.5.2.1 и 7.5.2.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 см.
Таблица 2 - Объемы растворов А
-1 и А
-2 для приготовления градуировочных растворов ОТА
Наименование показателя | Градуировочные растворы |
||||||
Объем раствора А
-2, см | |||||||
Объем раствора А
-1, см | |||||||
Количество введенного ОТА, нг | |||||||
Массовая концентрация ОТА в растворе, нг/см | |||||||
Доводят объем раствора в колбах до метки осветленным яблочным (или иным фильтрованным) соком.
Для проведения испытания в ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют по 10 мм приготовленных по 7.5.1.3 и 7.5.2.3 градуировочных растворов ПАТ и ОТА и проводят градуировку согласно 7.7 с учетом условий по 8.3.1.
Срок хранения градуировочного раствора при температуре 0°С - 4°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой - не более 24 ч.
7.6 Подготовка ВЭЖХ-МС/МС системы
Подготовку ВЭЖХ-МС/МС системы к измерениям проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и информацией, приведенной в приложении Б.
При настройке режимов работы масс-спектрометра рекомендуется использовать МС/МС параметры для определения микотоксинов, приведенные в приложении Б.
При этом должны быть соблюдены следующие условия:
- температура окружающего воздуха от 20°С до 25°С;
- атмосферное давление от 84 до 106 кПа;
- напряжение в электросети (220±10) В;
- частота тока в электросети от 49 до 51 Гц;
- относительная влажность воздуха от 40% до 80%.
7.7 Градуировка ВЭЖХ-МС/МС системы
Градуировку системы растворами микотоксинов в соках по 7.5 проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации к ВЭЖХ-МС/МС системе и с учетом условий по 8.3.1 один раз в месяц. На хроматограммах определяют площади пиков ПАТ и ОТА и по площади пика устанавливают градуировочную зависимость в интервале концентраций согласно 7.5. Рассчитывают коэффициент корреляции и отклонения рассчитанных значений массовой концентрации микотоксинов в каждой градуировочной точке от фактического значения в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (см. 7.5). Градуировку считают приемлемой, если коэффициент корреляции составляет не менее 0,999 (для ПАТ) и 0,965 (для ОТА), а относительное отклонение рассчитанного значения массовой концентрации от фактического значения не более ±10%.
Вместо относительного отклонения приемлемость градуировочной характеристики может быть оценена по относительному стандартному отклонению, которое не должно превышать 5%.
8 Проведение испытаний
8.1 Экстракция
10 см () предварительно тщательно перемешанной соковой продукции вносят в пробирку для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см. В пробирку добавляют 20 см ацетонитрила и 15 г безводного сернокислого магния. Смесь интенсивно перемешивают в течение трех-пяти минут вручную или с помощью встряхивателя. После перемешивания полученный экстракт центрифугируют в течение 10 мин при 4000-5000 об/мин при комнатной температуре или 5 мин при наличии центрифуги с охлаждением при температуре 5°С. Измеряют общий объем экстракта после центрифугирования (). 18-19 см () экстракта, отобранного с помощью пипетки или дозирующего устройства, переносят в остродонную колбу вместимостью 25 см. Раствор концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре или на роторном испарителе при температуре не более 40°С и немедленно перерастворяют в 1 см () ацетонитрила.
При наличии на стенках сосуда нерастворимой карамельной пленки проводят ее разрушение в ультразвуковой ванне в течение трех-пяти минут. Раствор переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см и центрифугируют при 10000-12000 об/мин в течение 3-5 мин. Отбирают верхний слой и фильтруют через микрофильтр с размерами пор 0,2-0,4 мкм непосредственно в микропробирку вместимостью 100-400 мм. Для проведения испытания в ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют 10 мм приготовленной пробы.
8.2 Приготовление пробы из концентрированных продуктов
Концентрированные соки (пюре) восстанавливают водой до минимального уровня растворимых сухих веществ, предусмотренного нормативными документами на конкретный вид соковой продукции. Концентрированную соковую продукцию, минимальные уровни растворимых сухих веществ для которой не предусмотрены, восстанавливают бидистиллированной водой до содержания растворимых сухих веществ 11,2%. Содержание растворимых сухих веществ контролируют по ГОСТ 29030 .
Экстракцию восстановленных проб проводят по 8.1.
8.3 Проведение измерений
8.3.1 Общие условия
Инжекцию подготовленных по 8.1 проб и градуировочных растворов проводят в выбранной последовательности. Наиболее распространен способ, когда инжекция градуировочных растворов начинает и завершает серию инжекций проб.
ВЭЖХ-МС/МС система должна быть настроена на режим SRM
с переходами, обеспечивающими селективное детектирование анализируемых микотоксинов. Времена удерживания и площади пиков определяют с помощью программного обеспечения для регистрации и расчета результатов анализа, прилагаемого к ВЭЖХ-МС/МС системе. Примеры ВЭЖХ/МС/МС систем, условия разделения и масс-спектрометрического детектирования приведены в приложении Б.
Испытания проб проводят в условиях повторяемости для двух параллельных определений в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ ИСО 5725-2.
8.3.2 Идентификация микотоксинов
Для идентификации микотоксинов времена удерживания, полученные на растворах проб, сравнивают со временем удерживания соответствующих микотоксинов из градуировочных растворов. Для подтверждения присутствия микотоксинов проводят сравнение соотношения интенсивностей сигналов из первого и второго m/z
-перехода с соотношением интенсивностей сигналов микотоксинов из градуировочных растворов.
Соотношение пиков для одного микотоксина не должно отличаться более чем на 20% от ожидаемого соотношения интенсивностей сигналов.
9 Обработка и оформление результатов испытаний
9.1 Количественное определение
Количественное определение микотоксинов в инжектированном объеме приготовленного экстракта (см. 8.1) проводят путем сравнения площади (или высоты) пика микотоксина с соответствующей градуировочной характеристикой для данного микотоксина.
Массовую концентрацию микотоксинов в испытуемой продукции , мкг/дм, рассчитывают по формуле
где - коэффициент перевода из кубических сантиметров в кубические дециметры;
- концентрация микотоксина в объеме экстракта 10 мм, инжектированном в ВЭЖХ-МС/МС систему, определенное по градуировочной зависимости, нг;
- объем ацетонитрила, в котором был перерастворен экстракт после концентрирования, см;
- общий объем экстракта, из которого отбирается для концентрирования объем , см;
- объем пробы, введенный в хроматограф (=10 мм), мм;
- объем пробы соковой продукции, взятой для испытания, см;
- объем экстракта, отобранный для концентрирования, см.
При расчете количества микотоксинов в концентрированной соковой продукции учитывают степень ее разбавления водой согласно 8.2.
За результат измерений принимают среднеарифметическое результатов трех параллельных определений, если выполняется условие приемлемости
где , - максимальное и минимальное значения из полученных трех результатов параллельных определений, мкг/дм;
, , - результаты трех параллельных определений, мкг/дм;
- значение критического диапазона, %.
Расхождение между тремя параллельными определениями (в процентах от среднего значения), выполненными в одной лаборатории, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) , равного 3,6· при вероятности =0,95. При соблюдении этого условия за окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение трех параллельных определений, округленное до третьего десятичного знака.
Результаты измерений регистрируют в протоколе в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 .
9.2 В случае, если полученный результат показывает, что содержание микотоксина превышает верхнюю границу диапазона градуировочной зависимости, подготавливают новую пробу, увеличивая ее разбавление водой, и проводят повторное измерение.
10 Метрологические характеристики
Метрологические характеристики метода для ПАТ и ОТА соответствуют условиям, приведенным в таблице 3.
Таблица 3 - Показатели прецизионности метода ВЭЖХ-МС/МС
Диапазон измерений, мкг/дм | Относительное стандартное отклонение повторяемости , % | Относительное стандартное отклонение воспроизводимости , % |
при определении ПАТ (не более) |
||
при определении ОТА (не более) |
||
Пределы обнаружения ПАТ и ОТА в пробах соковой продукции составляют: LOD
- 0,03 мкг/дм, LOQ
- 0,1 мкг/дм.
11 Контроль качества результатов измерений
Контроль показателей качества результатов измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с использованием проверки стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля стабильности результатов выполняемых измерений регламентируют во внутрилабораторных документах системы качества. При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.
ГОСТ 12.1.007 .
ВНИМАНИЕ!
При работе с микотоксинами следует учитывать, что ПАТ и ОТА обладают сильными токсическими свойствами с выраженным нефротоксическим, иммунотоксическим, тератогенным и генотоксическим действием. Согласно классификации IARC
ОТА относится к потенциально опасным для человека канцерогенным веществам (группа 2В). При работе с микотоксинами необходимо соблюдать повышенные меры безопасности. Персонал лаборатории должен носить защитную одежду, в том числе защитную маску, перчатки и очки. Все операции с микотоксинами проводят в вытяжном шкафу. После завершения работ использованную лабораторную посуду и отходы подвергают деактивации.
Приложение А (обязательное). Поверка спектрофотометра и определение поправочного коэффициента CF для расчета массовых концентраций микотоксинов в стандартных растворах
Приложение А
(обязательное)
Поверка спектрофотометра и определение поправочного коэффициента для расчета массовых концентраций микотоксинов в стандартных растворах
А.1 Для определения массовых концентраций микотоксинов в исходных растворах (см. 7.4.1.1 и 7.4.2.1) используют спектрофотометр, пригодный для измерения оптической плотности растворов в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см в интервале длин волн от 200 до 400 нм.
Калибровку спектрофотометра проводят следующим образом.
Измеряют оптическую плотность трех растворов дихромата калия (KCrO) в серной кислоте (HSO) - 0,25; 0,125 и 0,0625 ммоль/дм в максимальной точке поглощения (длина волны около 350 нм), используя в качестве контроля раствор серной кислоты (HSO) концентрации 0,009 ммоль/дм.
Затем рассчитывают значение молярного коэффициента оптической плотности , м/моль, для каждой концентрации дихромата калия по формуле
где - измеренное значение оптической плотности раствора дихромата калия в серной кислоте для соответствующей концентрации, ед. ОП;
- концентрация раствора дихромата калия в серной кислоте, ммоль/дм.
Если разница между тремя полученными значениями выходит за пределы гарантированного интервала точности измерений оптической плотности , то необходимо проверить процедуру выполнения калибровки или оборудование. Рассчитывают среднеарифметическое значение .
Определяют поправочный коэффициент (безразмерная величина) для конкретного оборудования (спектрофотометра и кювет) по формуле
где - характерное значение молярного коэффициента оптической плотности для растворов дихромата калия (KCrO), м/моль;
- молярный коэффициент оптической плотности, рассчитанный по формуле (А.1), м/моль.
Если полученное значение поправочного коэффициента менее 0,95 или более 1,05, то для устранения отклонений необходимо проверить процедуру выполнения калибровки или оборудование (для калибровки и проверки чистоты используют один и тот же набор кювет) -.
Приложение Б (справочное). Примеры ВЭЖХ-МС/МС систем для определения микотоксинов в соках и другой соковой продукции*
Приложение Б
(справочное)
________________
* Данные примеры являются рекомендуемыми и приведены для удобства пользователей настоящего стандарта.
Б.1 ВЭЖХ-МС/МС система N 1
Аппаратная платформа: Varian 320-MS LC/MS/MS.
Ионный