Միկոտոքսինների որոշման մեթոդներ. Միկոտոքսիկոզների ախտորոշման լաբորատոր մեթոդներ. Միկոտոքսիններ և դրանց որոշման մեթոդներ
Քոթոթների ծնվելուց հետո շնիկի և նրա տերերի համար սկսվում է պատասխանատու շրջան, երբ պետք է հոգ տանել ոչ միայն շնիկի կերակրման և առողջության, այլև նորածին երեխաների մասին։ Քոթոթների ծնվելուց հետո առաջին մեկ-երկու օրվա ընթացքում շնիկը կարող է վատ ախորժակ ունենալ, մարսողության խանգարում, հատկապես, եթե նա շատ է կերել հետծննդաբերությունը:
Հիշեք, որ այս ժամանակահատվածում դուք չպետք է դիմեք հակաբիոտիկների, դա բացասաբար կանդրադառնա նորածինների առողջությանը: Փորձեք յոլա գնալ ավելի անվտանգ դեղամիջոցներով (օրինակ՝ դեղաբույսեր, պրոբիոտիկներ, ստամոքսի լվացում, ակտիվացված փայտածուխ և գերադասելի լիգնիտին): Շատ լավ արդյունքներ այս դեպքում ձեռք են բերվում Heel-ից բացարձակապես անվնաս հոմեոպաթիկ պատրաստուկների օգտագործմամբ, և պետք չէ անասնաբուժականներ փնտրել, «մարդկայինը» ավելի վատ չի աշխատում: Փորձեք մեկ կամ երկու ենթամաշկային ներարկումներ Echinacea compositum, Nux vomica, Berebe-ris-hommacord: Լավ արդյունքներ են ձեռք բերվում՝ օգտագործելով դեղը նույն Diar-heel ընկերության հաբերում։ Դեղը տրվում է օրական 3 անգամ, 1 դեղահատ։ Արդյունքն ավելի լավ է, եթե այն նախապես լուծվի 1,5 ճաշի գդալ եռացրած ջրի մեջ և մանրակրկիտ խառնվի։
Ծննդաբերությունից հետո առաջին երեք օրվա ընթացքում պետք է զգույշ լինել կերակրման հարցում, որպեսզի հնարավոր խանգարումը չսրվի։ Օտարերկրյա հեղինակներն այս ընթացքում առաջարկում են բիծին տալ խաշած փոքրիկ հավեր՝ ոսկորների հետ աղացած և խաշած բրնձի հետ խառնելով։
Ծննդաբերությունից հետո առաջին օրերից հետո շնիկը նկատելիորեն բարելավում է իր ախորժակը, և դա միանգամայն բնական է՝ նրա մարմնի կարիքները նկատելիորեն մեծանում են։ Սկզբում ակտիվորեն սկսում է արտադրվել կոլոստրումը, իսկ հետո՝ կաթը։ Մեծ չափով կաթի քանակն ու որակը կախված է ոչ միայն շնիկի անհատական հատկանիշներից, այլև նրա կերակրվելուց։
Առաջին շաբաթվա ընթացքում կերերի քանակը 1,5 անգամ գերազանցում է սովորական սննդակարգին։ Բայց այս ընթացքում բիծին չի կարելի չափից շատ միս տալ՝ էկլամպսիա չառաջացնելու համար։ Որպես սպիտակուցային բաղադրիչ այս պահին դուք կարող եք տալ ձուկ կամ կաթնաշոռ: Կերակրեք շնիկը պետք է հաճախակի լինի (4-5 ժամը մեկ), փոքր չափաբաժիններով: Ստամոքսի բնականոն գործունեությունը վերականգնելուց հետո անհրաժեշտ է վերսկսել հանքային հավելումներ և վերարկու ամրացնելու միջոցներ տալը։
- միս, ձուկ և ենթամթերք - 45%,
- հացահատիկային - 30%,
- կաթ և կաթնամթերք՝ 10%,
- բանջարեղեն - 15%:
Որպեսզի կերակրող բիծն ավելի շատ կաթ ունենա, նա պետք է իր սննդակարգում ներառի մթերքներ, որոնք նպաստում են լակտացիային՝ հում գազար, միս, ձուկ, արգանակ, վարսակի ալյուր և այլն: Հնարավորինս հաճախ առաջարկեք շնիկին խմել՝ կաթ (եթե դա այն է. խանգարումներ չի առաջացնում), թեյ՝ կաթով, թույլ սուրճ՝ կաթով։ Որպես կաթի քանակությունն ավելացնելու միջոց, կարող եք փորձել հետևյալը.
- օրեգանոյի եփուկ;
- կիտրոնի բալզամի թուրմ. մեկ թեյի գդալ խոտը լցնել երկու բաժակ եռման ջրի հետ, թողնել եփվի, ավելացնել շաքարավազ;
- երկու թեյի գդալ թեյ դնել թերմոսի մեջ, լցնել երկու բաժակ եռման կաթ, թողնել եփվի 3-4 ժամ, ապա ավելացնել շաքարավազ և սառչել;
- անիսոն թուրմ:
Apilac-ը, որը շատ տերեր տալիս են բիծներին լակտացիան մեծացնելու համար, իմ պրակտիկայում ցանկալի արդյունք չտվեց, չնայած ես փորձեցի այն տալ տարբեր բիծների:
Եթե շունը կտրականապես հրաժարվում է խմելուց, դուք, իհարկե, կարող եք փորձել ստիպել նրան խմել, բայց ավելի լավ է նախ փորձեք «խաբել» նրան՝ մի փոքր կտոր կարագ լցնելով դեռ բավականաչափ տաք ըմպելիքի մեջ: Շատ լավ կարող է լինել, որ կարագի հոտը գայթակղեցնի նրան։
Աղջիկների հյուծվածությունը կանխելու համար այս ժամանակահատվածում նրա կերակրումը պետք է լինի լիարժեք, և սնունդը պետք է պարունակի բավարար քանակությամբ կալորիաներ, սպիտակուցներ, վիտամիններ և հանքանյութեր:
Սակայն լակտացիայի ողջ ընթացքում սննդի քանակը հաստատուն չէ։ Ինչպես արդեն նշվեց, առաջին շաբաթվա ընթացքում սննդակարգը պետք է ավելացվի 1,5 անգամ։ Քանի որ շնիկի կաթի քանակն ավելանում է, պետք է ավելանա նաև չափաբաժինը. երկրորդ շաբաթում չափաբաժինը պետք է կրկնապատկվի, իսկ երրորդ շաբաթից մինչև լակտացիայի ավարտը եռապատկվի։ Համեմատությունը կատարվում է սննդակարգի հետ։ շուն իր նորմալ վիճակում. Սննդի քանակը, որն անհրաժեշտ է շնիկի համար, կախված է նրա աղբի չափից: Չորս քոթոթների համար անհրաժեշտ է սննդակարգի 2 անգամ ավելացում, իսկ ութ ձագերի համար անհրաժեշտ է առնվազն երեք անգամ ավելացում:
Սովորաբար բիճը ձագերին կերակրում է 4-6 շաբաթ։ Լակտացիայի ընթացքում բիծի արտադրած կաթի քանակը հաստատուն չէ: Մինչեւ 20-25-րդ օրը կաթի քանակությունն ավելանում է, իսկ հետո նվազում։ Արևմտյան փորձագետներն առաջարկում են այս ժամանակահատվածում կերի կալորիականությունը հաշվարկելու շատ հեշտ միջոց։ Այս մեթոդը բաղկացած է 3-4 օրական հասակում ամբողջ աղբը կշռելուց, յուրաքանչյուր կիլոգրամ շան ձագերի համար 250 կկալ հավելյալ էներգիա ավելացնելով բիծի սննդակարգին և, համապատասխանաբար, ավելացնելով սննդի քանակն ու կալորիականությունը:
Լակտացիայի տեւողությունը կախված է շան անհատական հատկանիշներից եւ կերակրումից: Յուրաքանչյուր դեպքում, իհարկե, պետք է հաշվի առնել շան անհատական առանձնահատկությունները: Կան բիձաներ, որոնք շան ձագերը բառացիորեն «ծծում» են, կաթ են արտադրում երկար, մեծ քանակությամբ, իսկ ձագերին կերակրում են մինչև երկու ամիս։ Բնականաբար, նրանց սննդակարգը պետք է լինի ավելի մեծ և ամբողջական, քան բիծերը, որոնք նույնիսկ «կաթնարտադրության գագաթնակետին» քիչ կաթ ունեն, որը համընկնում է լակտացիայի 14-17-րդ օրվա հետ, և որոնց տերը պարզապես երազում է, որ ինքը կերակրի: երեխաները մինչև երեք շաբաթ. Մեծ չափով բիծի կաթի արտադրության վրա ազդում է էական ամինաթթուներով հարուստ ամբողջական սպիտակուցային դիետան։ Ամինաթթուների պակասն առաջին հերթին ազդում է կաթի որակի, ինչպես նաև դրա քանակի վրա, ինչը հանգեցնում է ձագերի աճի տեմպերի նվազմանը և դանդաղեցնում նրանց զարգացումը։
Վիտամինները նույնպես կարևոր դեր են խաղում սնուցող բիծների սնուցման գործում։ Դրանք անհրաժեշտ են ոչ միայն բուն բզիկների համար, այլ նաև ձագերի զարգացման համար։ Անհրաժեշտ է ապահովել, որ բիծը լակտացիայի ողջ ընթացքում ստանա անհրաժեշտ քանակությամբ վիտամիններ։ Օրինակ, լակոտների աճի համար այդքան անհրաժեշտ վիտամին A-ի պարունակությունը կաթում կախված է միայն մոր կերի մեջ դրա առկայությունից*: Հետևաբար, սեփականատերը պետք է վերահսկի այս վիտամինի մշտական առկայությունը կերակրող բիծի սննդակարգում: Դա վերաբերում է նաև վիտամին D-ին և B խմբի վիտամիններին, որոնք մեծ քանակությամբ արտազատվում են շան կաթի միջոցով։
Կաթն արտադրելու համար շնիկը պահանջում է նույն քանակությամբ հավելյալ էներգիա, որքան պարունակվում է արտազատվող կաթում: Հետևաբար, սննդակարգի էներգիայի արժեքը առաջին հերթին կախված կլինի շնիկի կաթի մատակարարումից: Կերի կալորիականությունը նույնպես կախված է լակտացիայի շրջանից։ Հայտնի է, որ լակտացիայի առաջին և երկրորդ շաբաթներին բիծն ավելի քիչ կաթ է արտադրում, քան երրորդ և չորրորդում։ Հետևաբար, սննդակարգը պետք է մշակվի այնպես, որ լակտացիայի շրջանի առաջին կեսին կերակրման էներգիայի ինտենսիվությունը ավելանա 2 անգամ, երկրորդում՝ 3 անգամ՝ համեմատած նորմալ վիճակում բիծի կարիքի հետ։ Գործնականում դա հետևյալն է. լակտացիայի առաջին կեսին կաթի ձևավորման համար 10 կգ մարմնի քաշով կերակրող բիձին անհրաժեշտ է լրացուցիչ սննդակարգ՝ 750 կկալ կալորիականությամբ, բացի հիմնականից, և. հաջորդ երկու շաբաթները՝ օրական 1500 կկալ։
Ծննդաբերությունից անմիջապես հետո կանացի կաթնագեղձերը արտազատում են կոլոստրում։ Անհրաժեշտ է ապահովել, որ յուրաքանչյուր նորածին լակոտ ստանա հատուկ հակամարմիններ պարունակող colostrum:
Կաթի ձևավորման համար մեծ նշանակություն ունեն հանքանյութերը, որոնց պակասը տարբեր տեսակի օստեոդիստրոֆիկ հիվանդություններ է առաջացնում ոչ միայն կերակրող բիծների, այլև սերունդների մոտ։ Միևնույն ժամանակ, սնուցող էգերի ողնաշարը սպառվում է հանքանյութերով և դառնում ծակոտկեն, փխրուն, հայտնվում է օստեոպորոզ, իսկ նորածին ձագերի մոտ՝ ռախիտ: Կարևոր է կանխել հանքային պաշարների կուտակումը հղիության ընթացքում, իսկ երիտասարդ բիծների մոտ՝ աճի և առաջին լակտացիայի նախապատրաստման շրջանում: Կրծքով կերակրող բիծներին ավելի շատ աղ է հարկավոր, քան չծծող բիծներին:
Լակտացիայի առաջին-երկրորդ և երրորդ-չորրորդ շաբաթների ընթացքում 5 կգ կշռող լակտացիայի բիծների սննդակարգի որակական կազմը և օրական էներգիայի ինտենսիվությունը
Լակտացիայի առաջին-երկրորդ և երրորդ-չորրորդ շաբաթների ընթացքում 15 կգ քաշով կերակրող բիծների սննդակարգի որակական բաղադրությունը և օրական էներգիայի ինտենսիվությունը
Լակտացիայի առաջին-երկրորդ և երրորդ-չորրորդ շաբաթների ընթացքում 25 կգ քաշով կերակրող բիծների սննդակարգի որակական կազմը և էներգիայի օրական ինտենսիվությունը
Միկոտոքսինների որոշման մեթոդներ
Սննդի և կերի մեջ միկոտոքսինների հայտնաբերման և պարունակության որոշման ժամանակակից մեթոդները ներառում են սկրինինգի մեթոդները, քանակական, անալիտիկ և կենսաբանական մեթոդները: Mycotoxin մեթոդաբանությունը զարգանում է շատ արագ: Մշակված մեթոդների և տարբեր մոդիֆիկացիաների թիվն արդեն հասել է մի քանի հարյուրի և շարունակում է աճել։
Սքրինինգի մեթոդները, որոնք բնութագրվում են վերլուծության պարզությամբ և արագությամբ, թույլ են տալիս արագ և հուսալիորեն «դուրս հանել» չաղտոտված նմուշները: Դրանք ներառում են սովորաբար օգտագործվող մեթոդներ, ինչպիսիք են աֆլատոքսինների, օխրատոքսին A-ի և զեարալենոնի մինի-սյունակային վերլուծությունը; TLC մեթոդներ մինչև 30 տարբեր միկոտոքսինների միաժամանակյա որոշման համար. աֆլատոքսիններով աղտոտվածության հայտնաբերման լյումինեսցենտ մեթոդ և այլն:
Միկոտոքսինների որոշման քանակական անալիտիկ մեթոդները կարելի է բաժանել քիմիական, ռադիոիմունաքիմիական և ֆերմենտային իմունային վերլուծության: Քիմիական մեթոդները ներկայումս ամենատարածվածն են և ներառում են միկոտոքսինների մեկուսացման և պատշաճ քանակականացման հաջորդական փուլեր: Մեկուսացման փուլը բաղկացած է երկու փուլից՝ արդյունահանում - միկոտոքսինի առանձնացում սուբստրատից և մաքրում - միկոտոքսինի առանձնացում նմանատիպ ֆիզիկական և քիմիական բնութագրեր ունեցող միացություններից: Միկոտոքսինների վերջնական տարանջատումն իրականացվում է մեկ կամ երկչափ բարակ շերտով քրոմատոգրաֆիայի (TLC) սիլիկագելային թիթեղների վրա տարբեր լուծողական համակարգերում, գազային և գազահեղուկ քրոմատագրման, բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատագրման և զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով: Միկոտոքսինների քանակական որոշումը սովորաբար իրականացվում է TLC-ի վրա ուլտրամանուշակագույն լույսի ներքո ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվության ուղղակի համեմատության միջոցով հայտնի կոնցենտրացիայի ստանդարտների հետ, ինչպես տեսողական, այնպես էլ դենսիտոմետրիկ: Մեթոդների հուսալիությունը բարելավելու համար օգտագործվում են տարբեր հաստատող թեստեր՝ հիմնված միկոտոքսինի ածանցյալների պատրաստման վրա՝ այլ քրոմատոգրաֆիկ, գունաչափական կամ ֆտորաչափական բնութագրերով:
Վերջին տարիներին մեծ ուշադրություն է դարձվել միկոտոքսինների հայտնաբերման, նույնականացման և քանակականացման համար բարձր զգայուն և բարձր սպեցիֆիկ ռադիոիմունաքիմիական և ֆերմենտային իմունային հետազոտության մեթոդների մշակմանը: Այս մեթոդները հիմնված են տավարի շիճուկի ալբումինով միկոտոքսինային կոնյուգանտների նկատմամբ հակաշիճուկներ ստանալու վրա: Նրանց առավելությունը նրանց բացառիկ զգայունությունն է, որը հնարավորություն է տալիս հայտնաբերել միկոտոքսինների պիկոգրամներ և զարգացումներ իրականացնել որոշման գործընթացի ավտոմատացման ուղղությամբ։ Կենսաբանական մեթոդները, որոնք սովորաբար առանձնահատուկ և զգայուն չեն, հիմնականում օգտագործվում են միկոտոքսինների հայտնաբերման համար, որոնց վերլուծության քիմիական մեթոդները հասանելի չեն, կամ որպես հաստատող թեստեր: Տարբեր միկրոօրգանիզմներ, հավի սաղմերը, բազմաթիվ լաբորատոր կենդանիներ, բջջային և հյուսվածքային կուլտուրաներ ծառայում են որպես փորձարկման առարկա:
Սննդամթերքի բաղադրության մեջ միկոտոքսինների պարունակությունը որոշելու համար նմուշի պատրաստումն իրականացվում է «Դիապակ» խտացնող քարթրիջների վրա պինդ փուլային արդյունահանման մեթոդով (էջ 3.2.3): Պատրաստված նմուշներում միկոտոքսինների տարանջատումը, նույնականացումը և քանակական որոշումն իրականացվում է բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի միջոցով Milichrome-5 շարքի միկրոսյունակային քրոմատոգրաֆի վրա՝ մոդուլային դիզայնով (նկ. 12):
Բրինձ. 12. Միկրոսյունային քրոմատոգրաֆ
Թուղթը դիտարկում է HPLC-ի հակադարձ փուլային տարբերակը պատուլինի որոշման համար: Հայտնաբերումն իրականացվում է 276 նմ ալիքի երկարությամբ։ Պատուլինի ճշգրիտ նույնականացման համար օգտագործվում է նաև բազմալիքային հայտնաբերում, ինչը հնարավորություն է տալիս օգտագործել սպեկտրային հարաբերությունները որպես լրացուցիչ նույնականացման պարամետր։ Տարանջատումն իրականացվում է գրադիենտ էլյուցիոն ռեժիմով, ինչը բարելավում է վերլուծության լուծունակությունը և զգայունությունը:
Բրինձ. 13. Հեղուկ քրոմատոգրաֆ:
1 - պոմպ; 2 – նմուշի ներարկման միավոր; 3 – քրոմատոգրաֆիկ սյունակ; 4 - դետեկտոր;
5 - արտահոսք էլուատի կամ կոլեկցիոների համար ֆրակցիաների համար; 6 - գրանցող (ձայնագրիչ,
ինտեգրատոր կամ անհատական համակարգիչ)
6
4
Նմուշի վերլուծությունը հեղուկ քրոմատոգրաֆի միջոցով (նկ. 13) իրականացվում է հետևյալ կերպ. Վերլուծված նմուշի լուծույթի որոշակի ծավալը ներմուծվում է քրոմատոգրաֆիկ սյունակի (3) վերին մասում՝ օգտագործելով նմուշի ներարկման միավորը (2): Օգտագործելով պոմպ (1) վերլուծված խառնուրդը լուծիչով մղվում է քրոմատոգրաֆիկ սյունակով (3), որտեղ վերլուծված խառնուրդը բաժանվում է առանձին ֆրակցիաների (բաղադրիչների): Առանձնացված բաղադրիչներ պարունակող սյունակից հոսող էլուատը վերլուծվում է դետեկտորով (4), որի ընթերցումները գրանցվում են ձայնագրիչով (6):
HPLC-ի մեթոդաբանական հիմքերը
Էլուոտրոպային շարք. Էլյուենտի էլուենտի հզորությունը էլուենտի (լուծիչի կամ լուծիչների խառնուրդի) կարողությունն է՝ ներծծող նյութը ներծծող նյութի մակերեսից հեռացնելու: Այս դեպքում, որքան ուժեղ է էլյուենտի մոլեկուլները ներծծվում են սորբենտի ակտիվ տեղամասերում, այնքան բարձր է նրա արտանետման հզորությունը: Լուծիչները, որոնք դասավորված են անընդմեջ, աճող լուծողական ուժով, կազմում են էլուոտրոպային շարք:
Որպես հակափուլային քրոմատագրման համար օգտագործվող լուծիչների խառնուրդներ, որոնք պարունակում են ջուր և օրգանական միացություններ, որոնք փոփոխում են զտման ուժը. Նորմալ փուլային քրոմատագրության մեջ որպես էլուենտներ օգտագործվում են բևեռային մոդիֆիկատորներ՝ գծային և ցիկլային ածխաջրածիններ (հեքսան, ցիկլոհեքսան, հեպտան և այլն)։
Դետեկտորներ հեղուկ քրոմատոգրաֆների համար: Ներկայումս մշակվել են ավելի քան 20 HPLC դետեկտորներ։ Հինգը առավել լայնորեն կիրառվում են, որոնցից երեքը օպտիկական են, իսկ երկուսը` էլեկտրաքիմիական: Այս հինգ դետեկտորները թույլ են տալիս վերլուծել օրգանական և անօրգանական նյութերի բոլոր դասերը:
Օպտիկական դետեկտորները ներառում են սպեկտրոֆոտոմետրիկ դետեկտոր (ուլտրամանուշակագույն (ուլտրամանուշակագույն) ալիքի երկարության տիրույթում գործող
200–360 նմ և տեսանելի 360–780 նմ ալիքի երկարության միջակայքով), ֆտորաչափական և բեկման ինդեքսների դետեկտորներ. էլեկտրաքիմիական-վոլտամետրիկ և հաղորդունակ դետեկտորներին: Առանձնահատուկ նշանակություն ունի զանգվածային սպեկտրաչափական դետեկտորը, որն ունի եզակի տեղեկատվական բովանդակություն, քանի որ թույլ է տալիս նույնականացնել քրոմատոգրաֆիկորեն առանձնացված բաղադրիչները՝ օգտագործելով նյութերի զանգվածային սպեկտրի տվյալների բազաները:
Սպեկտրոֆոտոմետրիկ դետեկտորամենատարածված HPLC դետեկտորն է: Նրա գործողության սկզբունքը հիմնված է Բուգեր-Լամբեր-Գարեջրի լույսի կլանման հայտնի օրենքի վրա։ Սպեկտրոֆոտոմետրիկ դետեկտորը գրանցում է նյութի կողմից ճառագայթման ընտրովի կլանման կլանման սպեկտրը: Կլանման սպեկտրները կախված են ուսումնասիրվող նյութի կառուցվածքից: Սա թույլ է տալիս նույնականացնել նյութը իր սպեկտրով, ունենալով սպեկտրների կամ ստանդարտների գրադարան: Համաձայն Բուգեր-Լամբեր-Բիր օրենքի՝ սպեկտրային շերտերի ինտենսիվությունը կախված է նյութի կոնցենտրացիայից, որը հիմք է հանդիսանում քանակական վերլուծության, այսինքն՝ որոշելու նյութի կոնցենտրացիան։
Թույլ տվեք միագույն լույսը ինտենսիվությամբ աղբյուրից Ի 0 ընկնում է երկարությամբ խրամատի վրա լ (օպտիկական ուղի): Կյուվետը լցված է կոնցենտրացիայով նյութի լուծույթով Հետ. Նյութն ընդունակ է կլանել միագույն ճառագայթումը։ Տվյալ մոնոխրոմատիկ ճառագայթումը կլանելու ունակության չափանիշը արժեքն է ε մոլային կլանման գործակիցն է կամ մարման գործակիցը: Թուլացած լույսի ճառագայթը դուրս է գալիս կուվետից ինտենսիվությամբ Ի. Ալիքի երկարության վրա լույսի կլանման օրենքի համաձայն λ= հաստատ
Ի= Ի 0 ∙10 -ε Cl , (7)
որտեղ Իլույսի հոսքի ինտենսիվությունն է կյուվետի միջով անցնելուց հետո.
Ի 0-ը անկման լույսի հոսքի ինտենսիվությունն է. ε
մարման գործակիցն է; Հետնյութի մոլային կոնցենտրացիան է կյուվետում. լկյուվետի երկարությունն է։
Վերաբերմունք Իդեպի Ի 0-ը, որն արտահայտվում է որպես տոկոս, կոչվում է փոխանցում Տ, և արժեքը A = lg (I 0 / Ի) - օպտիկական խտություն.
A = lg (I 0 /I)= ε С∙լ. (8)
Նյութի օպտիկական խտությունը ուղիղ համեմատական է անալիտի կոնցենտրացիային: Սպեկտրոֆոտոմետրիկ դետեկտորներում անալիտիկ մեծությունը օպտիկական խտությունն է ԲԱՅՑ. Բանաձևը (8) սպեկտրոֆոտոմետրիկ դետեկտոր օգտագործելիս հիմք է հանդիսանում քանակական վերլուծության համար, քանի որ օպտիկական խտությունը ԲԱՅՑնյութը ուղիղ համեմատական է քրոմատոգրաֆիկ գագաթնակետի բարձրությանը կամ մակերեսին:
Օպտիկական խտության կախվածություն ԲԱՅՑ 190-ից 360 նմ ալիքի երկարության միջակայքում գտնվող նյութի հետ կուվետի վրա ընկած լույսի ալիքի երկարությունից կոչվում է ուլտրամանուշակագույն կլանման սպեկտր (նկ. 14):
200 230 260 290 320 350 λ , նմ
ԲԱՅՑ, f.r.p.
Բրինձ. 14. Ջրային լուծույթի ուլտրամանուշակագույն կլանման սպեկտրը
նյութեր X
3.2.3. Նմուշի պատրաստում
Ցանկացած նյութ ունի առավելագույն կլանման ալիքի երկարություն(λ նմ): Այս ալիքի երկարությունն օգտագործելիս դետեկտորն ունի նյութ հայտնաբերելու ամենացածր շեմը:
Սպեկտրոֆոտոմետրիկ դետեկտորի (SPD) միջոցով հայտնաբերվում են տարբեր դասերի մեծ քանակությամբ նյութեր, որոնք կլանում են ուլտրամանուշակագույն լույսը:
Քրոմատագրության մեջ սպեկտրոֆոտոմետրիկ դետեկտորի օգտագործումը մեծապես հեշտացնում է նույնականացումը: Բազմալիքային դետեկտորը ծրագրաշարի հետ համատեղ թույլ է տալիս միաժամանակ մի քանի ալիքի երկարությամբ քրոմատոգրամ ստանալ և բաղադրիչները նույնականացնելու լրացուցիչ պարամետր. սպեկտրալվերաբերմունք (Ք) տարբեր ալիքների երկարություններում քրոմատոգրաֆիկ գագաթնակետի բարձրությունների հարաբերակցությունն է
որտեղ ԲԱՅՑ 1 և ԲԱՅՑ 2 - օպտիկական խտության գործակիցներ 1 և 2 ալիքների երկարություններում: Արժեքը Քքանի որ յուրաքանչյուր նյութ հաստատուն բնութագիր է և կախված չէ դրա կոնցենտրացիայից: Սպեկտրային հարաբերությունների ճշգրտությունը կախված է նյութի օպտիկական խտության արժեքներից և դետեկտորի ձևավորումից:
Նմուշի պատրաստումը՝ օգտագործելով պինդ փուլային արդյունահանման մեթոդը կենտրոնացված փամփուշտների վրա, խնայում է ժամանակն ու աշխատուժը: Պինդ փուլով արդյունահանումը թույլ է տալիս խտացնել նմուշը և մաքրել այն ուղեկցող կեղտից: Կոշտ փուլային արդյունահանման բարդ սխեման նախատեսում է երկու փամփուշտների հաջորդական օգտագործում.
– ունիվերսալ կոնցենտրացիոն քարթրիջ «DIAPAK P-Z» – բազմակի օգտագործման քարթրիջ (մինչև 50 նմուշ) վերին և ստորին ֆիլտրերի հավաքածուով (10 հատ);
– ունիվերսալ քարթրիջ նուրբ մաքրման համար “DIAPAK S” – մեկանգամյա օգտագործման քարթրիջ:
Համար համակենտրոնացման փամփուշտների պատրաստում դուք պետք է կատարեք հետևյալ գործողությունները.
Համար «DIAPAK P-Z» կոնցենտրացիոն քարթրիջի պատրաստում.:
- քարթրիջի միջով մղել 10 մլ ջուր-ացետոնիտրիլի խառնուրդ (58:42);
– նմուշի պատրաստումից անմիջապես առաջ 10 մլ թորած ջուր մղեք քարթրիջի միջով:
Համար համակենտրոնացման քարթրիջի պատրաստում «ԴԻԱՊԱԿ Ս»:
- 5 մլ բենզոլ մղեք փամփուշտի միջով և միացրեք փամփուշտը երկու ծայրերում:
Սննդամթերքի պատրաստում համակենտրոնացման համար
10,0 գ կշռող նմուշը դնում ենք ապակե բաժակի մեջ, խառնում փոքր քանակությամբ թորած ջրի հետ և քանակապես տեղափոխում 50 մլ ծավալային կոլբայի մեջ։ Կոլբայի մեջ ավելացրեք 6,0 մլ Carrez I լուծույթ և Carrez II լուծույթ։ Կոլբայի պարունակությունը թորած ջրով հասցրեք նշագծին, մանրակրկիտ խառնեք և թղթե ծալքավոր ֆիլտրի միջոցով զտեք աստիճանավոր գլան: Չափել թափանցիկ ֆիլտրատի ծավալը P.
Հստակեցված հյութեր և ըմպելիքներ պատրաստելիս նմուշը զտեք խիտ թղթե ֆիլտրի միջով մինչև ստացվի 20 մլ թափանցիկ ֆիլտրատ P:
Նմուշի կոնցենտրացիան «DIAPAK P-Z» քարթրիջի վրա.
Ֆիլտրատ P-ի ամբողջ ծավալը քսել նախապես պատրաստված քարթրիջին՝ վայրկյանում 1–2 կաթիլ արագությամբ:
Քարթրիջը ողողեք 5 մլ երկթորած ջրով, դեն նետեք բոլոր լվացումները:
10 մլ էթիլացետատի քարթրիջից պատուլինը մաքրեք կոլբայի կամ խցանված ծավալային խողովակի մեջ, որը պարունակում է 5 մլ
Նատրիումի կարբոնատի 1,5% ջրային լուծույթ, խցան, եռանդով խառնեք և թույլ տվեք շերտավորվել:
Հավաքեք չորացման սյունը՝ լցնելով ֆիլտրի պատյանը մոտավորապես 2 գ անջուր նատրիումի սուլֆատով, սեղմեք չորացնող նյութը՝ հպելով սյունակի պատին և ամրացրեք բամբակյա շվաբրով:
Էթիլացետատի վերին շերտը քսել պիպետտով, զտել չորացման սյունակի միջով, ֆիլտրատը հավաքել 50 մլ սրտաձև կոլբայի մեջ; Նատրիումի կարբոնատի ջրային լուծույթը լրացուցիչ արդյունահանվում է սկզբում 10 մլ, այնուհետև 5 մլ էթիլացետատով և բաժանումից հետո էթիլացետատի թափված ծավալները հաջորդաբար զտում են չորացման սյունակի միջով նույն կոլբայի մեջ։
Էթիլացետատը վակուումում գոլորշիացնել 40°C-ից ոչ ավելի ջերմաստիճանում մինչև մոտ 0,5 մլ ծավալը (չորացնել մինչև չորանալը), ավելացնել 2,5 մլ բենզոլ (պահպանել ծավալների հարաբերակցությունը 1:5):
Նմուշի մաքրում «DIAPAK S» քարթրիջի վրա
Հեռացրեք կափարիչները պատրաստված քարթրիջից և անցկացրեք բենզոլ-էթիլացետատի նմուշի լուծույթը վայրկյանում 1-2 կաթիլ արագությամբ: Կոլբը լվացեք ևս 0,5-1,0 մլ բենզոլ-էթիլացետատով (85:15) և քսեք փամփուշտի վրա՝ դեն նետելով լվացումները:
6 մլ քարթրիջից պատուլինը մաքրեք բենզոլով:էթիլացետատով (7:3)՝ հավաքելով լուծույթը միջուկը մաքրող կոլբայի մեջ:
Ելյուտը մինչև չորանա գոլորշիացնել չոր օդային լոգարանում 40°C-ից ոչ ավելի ջերմաստիճանում:
Անմիջապես! Գոլորշիացումից հետո նմուշը նորից լուծեք 0,2–0,25 մլ լուծիչ A-ի մեջ (բաժին 3.2.4.2), սառեցված մինչև 5–8°C:
3.2.4. Աշխատանքային կարգը
Օբյեկտիվ– Սննդամթերքի բաղադրության մեջ միկոտոքսին պատուլինի պարունակության որոշում Milichrome-5 սերիայի միկրոսյունակային քրոմատոգրաֆի միջոցով բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատագրմամբ:3.2.4.1. Չափման տեխնիկա
Չափումները ներառում են հետևյալ հիմնական քայլերը.- քրոմատոգրաֆի չափորոշում ըստ պատուլինի հայտնի զանգվածային կոնցենտրացիայով լուծույթների.
- սննդամթերքի նմուշի պատրաստում պինդ փուլային արդյունահանման մեթոդով` համաձայն պարբերությունների. 3.2.3;
– քաղվածքի վերլուծություն HPLC-ով` ուլտրամանուշակագույն դետեկտորի միջոցով ազդանշանի գրանցմամբ;
- պատուլինի նույնականացում պահպանման պարամետրերով և սպեկտրային հարաբերակցությամբ.
– նմուշում պատուլինի զանգվածային կոնցենտրացիայի հաշվարկը՝ հիմնված գրանցված անալիտիկ ազդանշանի (գագաթի բարձրության) և տրամաչափման գրաֆիկի վրա.
- պարենային ապրանքի բաղադրության մեջ պատուլինի զանգվածային բաժնի հաշվարկը.
Գործիքներ, ռեակտիվներ և նյութեր,աշխատանքը կատարելու համար անհրաժեշտ է.
– Milichrome-5 սերիայի քրոմատոգրաֆ կամ ցանկացած այլ HPLC քրոմատոգրաֆ WinXrom կամ Multichrome ծրագրաշարով;
– HPLC քրոմատոգրաֆիկ սյունակ՝ Diasfer–110–С10СN (5 մկմ, 2×80 մմ, TU 4215–001–05451931–94);
– փոփոխական ծավալի դիսպենսեր 1-100 մկլ-ի համար;
– 100–1000 մկլ-ի փոփոխական ծավալի դիսպենսեր;
- մինչև 10 մլ հզորությամբ սերտորեն աղացած բարակ հատվածով կոնաձև կոլբա;
- թաղանթային ֆիլտրեր;
- պատուլինի ստանդարտ լուծույթների հավաքածու 1, 2, 5 և 10 մգ/լ կոնցենտրացիայով;
- ֆոսֆորական թթու 85%;
– ացետոնիտրիլ հեղուկ քրոմատագրման համար (հատուկ մաքրության սպեցիֆիկացիա TU 6–09–3513–86, ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման կլանումը մինչև 200 նմ);
– քիմիապես մաքուր հեքսան (ռեկտիֆիկացված);
- տրիֆտորքացախաթթու;
– Կարեզ I լուծույթ – 100 մլ ջրի մեջ լուծել 15,0 գ կալիումի հեքսացիանոֆերատ II:
- Carrez II լուծույթ - լուծարել 30,0 գ ցինկի ացետատ 100 մլ ջրի մեջ;
- Էլյուենտներ A, B և C:
Էլյուենտների պատրաստում
Էլյուենտ Ա. 20 մլ ացետոնիտրիլ և 0,5 մլ տրիֆտորքացախաթթվի 10% լուծույթ ավելացվում է 100 մլ տարողությամբ ամուր աղացած ապակյա հատվածով ծավալային կոլբայի մեջ։ Լուծույթը մանրակրկիտ խառնվում և հասցվում է թորած ջրով, որը նախապես զտված է նեյլոնե թաղանթային ֆիլտրի միջով (0,2 մկմ): Այնուհետև էլյուենտը գազազերծվում է տարհանման միջոցով 1 րոպե 1 կգ∙վ/սմ 2 հազվադեպությամբ:
Էլյուենտներ B և C պատրաստված նույն ձևով, ինչպես էլյուենտ A-ն, 100 մլ լուծույթի դիմաց ընդունում են համապատասխանաբար միայն 10 և 0 մլ ացետոնիտրիլ:
3.2.4.2. Քրոմատոգրաֆիկ տարանջատման ռեժիմների կարգավորում
և արդյունքների գրանցում
Չափումներ իրականացնելու համար անհրաժեշտ է սահմանել քրոմատոգրաֆի գործառնական ռեժիմները։ Դիսպենսերի ռեժիմներ.
– վերածնում – 300 մկլ;
– նմուշի ծավալը – 5 մկլ;
– էլուենտի սպառում – 150 μl/min;
- գրադիենտ էլյուցիայի ռեժիմներ՝ 800 μl – էլյուենտ A,
500 μl - eluent B, 300 μl - eluent C;
- թերմոստատի ջերմաստիճանը - 35 0 С:
Հայտնաբերման ռեժիմներ.
– ալիքների երկարությունների թիվը – 3;
- ալիքի երկարություն - 250, 276, 290 նմ;
– չափման ժամանակը – 0,04 վ.
Քրոմատոգրաֆիական համակարգի կարգավորումն իրականացվում է չափումներից 30 րոպե առաջ՝ կատարելով «դատարկ» անալիզ, որի ժամանակ պատուլին պարունակող ստանդարտ խառնուրդը փոխարինվում է 5–10 մկլ էլուենտով, այնուհետև առանձնացվում է միկոտոքսինների ստանդարտ խառնուրդը։
Վարժություն 1. Ուսումնասիրել սննդամթերքի նմուշների պատրաստման եղանակը՝ պատուլինի պարունակությունը որոշելու համար։ Պատրաստել նմուշներ՝ համաձայն 3.2.3 կետի:
Առաջադրանք 2. Կալիբրացնել քրոմատոգրաֆը: Քրոմատոգրաֆը տրամաչափվում է՝ հաջորդաբար ներմուծելով պատուլինի ստանդարտ լուծույթներ 1, 2, 5 և 10 մգ/լ կոնցենտրացիաներով:
Ուսուցչի ղեկավարությամբ առաջարկվում է համակարգչի ստեղնաշարից քրոմատոգրաֆիկ տարանջատման պարամետրերը (կետ 3.2.4.3) մուտքագրել ծրագիր (WinXrom) և ավտոմատ ռեժիմով սկսել 2-4 քրոմատոգրաֆիկ անալիզ։ Արդյունքները ներկայացված են աղյուսակի տեսքով: 6.
T a b l e 6
Ստացված քրոմատոգրաֆիկ պրոֆիլների հիման վրա կառուցեք տրամաչափման գրաֆիկ (կոնցենտրացիան գծագրված է օրդինատների առանցքի երկայնքով՝ մգ/լ, աբսցիսային առանցքի երկայնքով՝ միկոտոքսինի օպտիկական խտությունը։ ԲԱՅՑ- s.o.p.):
Առաջադրանք 3. Սննդամթերքի փորձանմուշում հայտնաբերել պատուլինը և որոշել դրա կոնցենտրացիան:
Ուսուցչի ղեկավարությամբ սկսեք պատրաստի սննդամթերքի նմուշի չափումը ավտոմատ ռեժիմով
(2-րդ առաջադրանքում ընտրված քրոմատոգրաֆիկ տարանջատման պարամետրերով): Չափումն ավարտելուց հետո նույնականացրեք պատուլինային միկոտոքսինը՝ համաձայն 2-րդ առաջադրանքում ստացված ստանդարտ ֆայլի («StandardDD–MM–YY.001»: Օգտագործելով 2-րդ առաջադրանքում կառուցված չափաբերման գրաֆիկը, որոշեք պատուլինի կոնցենտրացիան սննդի նմուշում:
Արդյունքները գրանցեք աղյուսակում: 7.
Աղյուսակ 7
Սննդի նմուշում պատուլինի զանգվածային կոնցենտրացիան հաշվարկվում է բանաձևով
որտեղ Հետ– նմուշում պատուլինի զանգվածային կոնցենտրացիան, մգ/լ (հաշվարկվում է ըստ տրամաչափման կախվածության՝ ելնելով անալիտիկ գագաթնակետի բարձրությունից). Վ էջ նմուշի ծավալն է, մլ; Ռ - նմուշի պատրաստման փուլում միկոտոքսինի արդյունահանման աստիճանը (հավասար է 60%). Մ pr-ը սննդամթերքի նմուշի զանգվածն է, որն օգտագործվում է մաքրման և հետագա քրոմատոգրաֆիկ որոշման համար, g.
Որոշվող օբյեկտում միկոտոքսինի զանգվածային բաժնի չափման արդյունքը ներկայացված է հետևյալ ձևով. X± մգ/կգ; ժամը Ռ\u003d 0.95 և գրանցված արձանագրությունում (Հավելված 1), որտեղ X ես , նմուշում պատուլինի զանգվածային կոնցենտրացիան է, մգ/կգ; Ռ- հավանականություն; բացարձակ սխալի սահմանն է՝ հաշվարկված բանաձևով
Արդյունքը ստանալուց հետո անհրաժեշտ է գնահատել կոնվերգենցիայի գործառնական հսկողության ստանդարտների արժեքները, որոնք տրված են համապատասխան ԳՕՍՏ-ներում վերահսկողության (վերլուծության) մեթոդների համար:
Եզրակացություն արեք ուսումնասիրված սննդամթերքում պատուլինի պարունակության համապատասխանության (կամ անհամապատասխանության) մասին SanPiN 2.3.2.1078-01-ով սահմանված թույլատրելի մակարդակներին:
Հարցեր ինքնատիրապետման համար
1. Ի՞նչ սկզբունքների հիմքում ընկած է անալիզի քրոմատոգրաֆիկ մեթոդների դասակարգումը:
2. Ո՞րն է քրոմատոգրաֆիկ տարանջատման էությունը: Ինչպե՞ս է իրականացվում որակական նույնականացում և քանակական վերլուծություն:
3. Ո՞ր սննդամթերքն է պարունակում միկոտոքսիններ: Ի՞նչ միկոտոքսիններ են որոշվում սննդամթերքի բաղադրության մեջ՝ SanPiN-ի պահանջներին համապատասխան:
4. Ի՞նչ քրոմատոգրաֆիական մեթոդ է կիրառվում սննդամթերքում միկոտոքսինների պարունակությունը որոշելու համար:
5. Ինչի՞ վրա է հիմնված սպեկտրոֆոտոմետրիկ հայտնաբերումը: Ի՞նչ են սպեկտրային հարաբերությունները և ինչի՞ համար են դրանք օգտագործվում:
6. Ինչպե՞ս է կատարվում սննդամթերքի նմուշի պատրաստումը HPLC-ով պատուլինի պարունակությունը որոշելու համար:
7. Ի՞նչ գործողություններ են ներառված պատուլինի որոշման HPLC մեթոդում:
8. Ի՞նչ է էլյուենտը և գրադիենտ էլյուցիան: Ի՞նչ էլուենտներ են օգտագործվում HPLC-ով պատուլինի որոշման ժամանակ:
9. Ինչպե՞ս է հայտնաբերվում և քանակականորեն որոշվում պատուլինը:
10. Ինչպե՞ս է ապահովվում պատուլինի HPLC որոշման ճշգրտությունը:
Միկոտոքսինների որոշման մեթոդներ
Սննդի և կերի մեջ միկոտոքսինների հայտնաբերման և պարունակության որոշման ժամանակակից մեթոդները ներառում են սկրինինգի մեթոդները, քանակական անալիտիկ և կենսաբանական մեթոդները:
Սքրինինգի մեթոդներարագ և հարմար են սերիական վերլուծության համար, թույլ են տալիս արագ և հուսալիորեն առանձնացնել աղտոտված և չաղտոտված նմուշները: Զննման մեթոդները ներառում են բարակ շերտով քրոմատոգրաֆիա (TLC մեթոդներ), աֆլատոքսիններով աղտոտված հացահատիկի որոշման լյումինեսցենտ մեթոդ:
Միկոտոքսինների որոշման քանակական անալիտիկ մեթոդները ներկայացված են քիմիական, ռադիոիմունոլոգիական և ֆերմենտային իմունային վերլուծության մեթոդներով: Այսօր առավել տարածված են քիմիական մեթոդները, որոնք ներառում են երկու փուլ՝ մեկուսացման փուլ և միկոտոքսինների քանակական որոշման փուլ։ Մեկուսացման փուլը ներառում է արդյունահանում (միկոտոքսինի առանձնացում սուբստրատից) և մաքրում (միկոտոքսինի առանձնացում նմանատիպ ֆիզիկական և քիմիական բնութագրերով միացություններից): Միկոտոքսինների վերջնական տարանջատումը և քանակականացումը կատարվում է տարբեր քրոմատոգրաֆիկ մեթոդների կիրառմամբ: Միկոտոքսինների բոլոր տեսակների որոշման ունիվերսալ մեթոդը բարակ շերտով քրոմատոգրաֆիան է (TLC):
Արտադրանքի խմբաքանակից նմուշառում կատարելիս հիմնական նպատակն է ստանալ միջին նմուշ կամ միջին նմուշ, որը միկոտոքսինի կոնցենտրացիայի առումով ամբողջ խմբաքանակին ներկայացնող է (վերցված նմուշները պետք է բնութագրեն ամբողջ խմբաքանակի որակը): Այս առաջադրանքի կատարումը կախված է միկոտոքսինների բնույթից և բաշխումից, արտադրանքի բնութագրերից (հում, վերամշակված, ազատ հոսող, հեղուկ, մածուցիկ և այլն), նմուշի պատրաստման եղանակից։ Օրինակ, գետնանուշների աղտոտումը աֆլատոքսիններով ունի ընդգծված տարասեռ բնույթ. առանձին գետնանուշ հատիկների մեջ դրանց պարունակությունը կարող է տատանվել միլիգրամի հազարերորդականից մինչև տասնյակ կամ ավելի միլիգրամ 1 կգ-ի համար, այսինքն՝ տարբերվել 5-6 աստիճանի մեծությամբ: Այդ իսկ պատճառով, նմուշառման սխալի ներդրումը գետնանուշում աֆլատոքսինների որոշման ընդհանուր վերլուծության սխալի մեջ գլխավորն է և որոշ դեպքերում կարող է լինել ավելի քան 90%:
Միկոտոքսիններով աղտոտվածության միատեսակության տեսանկյունից բոլոր ապրանքները կարելի է բաժանել երկու խմբի. 2) միատեսակ աղտոտվածություն ունեցող ապրանքներ (հեղուկներ՝ կաթ, բուսական յուղեր, հյութեր, խյուսեր, ալյուր, աղացած սնունդ).
l-րդ խմբի արտադրանքի միջին ներկայացուցչական նմուշ ստանալու համար նախնական նմուշի չափը պետք է լինի հնարավորինս մեծ (առնվազն 2 կգ), մինչդեռ միջին լաբորատոր նմուշը պետք է մեկուսացված լինի գետնին (համասեռացված) միջին նմուշից: .
2-րդ խմբի համասեռ արտադրանքի համար (ջեմ, մարմելադ, թիթեղյա փոքր տարաներում մրգահյութեր, խտացրած կաթ, չոր կաթնամթերք և այլն) նմուշները պետք է վերցվեն միջին նմուշի չափին համապատասխան փաթեթավորման միավորների քանակով (100): -200 գ), պայմանով, որ ապրանքը նույն խմբաքանակից է:
Առանձին աֆլատոքսինների հայտնաբերման և նույնականացման քիմիական մեթոդները հիմնված են ուլտրամանուշակագույն լույսի ներքո դրանց հատուկ ֆլուորեսցենտության վրա (մոտ 365 նմ), բարակ շերտի քրոմատագրության մեջ շարժունակության տարբերությունների, դրանց կլանման և ֆլուորեսցենտային սպեկտրների առանձնահատկությունների վրա:
Ի տարբերություն աֆլատոքսինների, տրիխոտեկենները սպեկտրի տեսանելի մասում ներծծում կամ ֆլուորեսցենտ չունեն, ինչը դժվարացնում է դրանք հայտնաբերելը բարակ շերտով քրոմատոգրաֆիայի միջոցով: Միևնույն ժամանակ, տրիխոտեցենները կարող են հայտնաբերվել TLC-ով, օգտագործելով մեթոդներ, որոնք հիմնված են TLC թիթեղների մշակման վրա հատուկ ռեակտիվներով, որոնք գունավոր կամ ֆլուորեսցենտային ածանցյալներ են կազմում տրիխոտեկենների հետ: Օրինակ, T-2 տոքսին, երբ մշակվում է թիթեղները; խտացված ծծմբաթթուն ուլտրամանուշակագույն լույսի ներքո ձևավորում է կապույտ ֆլյուորեսցենտով բծեր։
Միկոտոքսինների քանակական որոշման արբիտրաժային մեթոդները հետևյալն են.
‣‣‣ գազ-հեղուկ քրոմատոգրաֆիա (T-2 տոքսինի համար);
‣‣‣ բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիա (HPLC)՝ օգտագործելով ուլտրամանուշակագույն լուսաչափական դետեկտոր (դեզօքսինիվալենոլի և պատուլինի համար);
‣‣‣ HPLC՝ օգտագործելով լյումինեսցենտային դետեկտոր (աֆլատոքսինների և զեարալենոնի համար):
Նկ. 2-ում ներկայացված է ժամանակակից հեղուկ քրոմատոգրաֆի սարքը ամենապարզ դիզայնով:
Շարժական փուլը տանկ 1-ից մուտքային ֆիլտր 9-ի միջոցով մատակարարվում է բարձր ճնշման պոմպ 2-ի միջոցով նմուշի մուտքագրման համակարգ 3 - ձեռքով ներարկիչ կամ ավտոմատ նմուշառիչ, որտեղ նմուշը նույնպես ներարկվում է: Այնուհետև, 8-րդ ֆիլտրի միջոցով, շարժական փուլի հոսանք ունեցող նմուշը նախասյունակի միջով մտնում է բաժանման սյունակ 4: Այնուհետև շարժական փուլի հոսքը դուրս է գալիս սյունակից և պարունակում է բաժանվող խառնուրդի բաղադրիչները (էլյուտ) մտնում է դետեկտոր 5 և դուրս է բերվում հոսող բաքի մեջ 7: Երբ լուծույթը հոսում է դետեկտորի օղակի չափման միջով, քրոմատոգրամը գրանցվում է և տվյալները փոխանցվում են ձայնագրիչ 6 կամ համակարգիչ:
Հեղուկ քրոմատոգրաֆ սարք (իզոկրատական համակարգ).
1 - հզորություն; 2 - բարձր ճնշման համակարգ; 3 - ձեռքով ներարկիչ կամ ավտոմատ նմուշառիչ; 4 - բաժանարար սյունակ; 5 - դետեկտոր; բ - գրանցող կամ համակարգիչ; 7 - արտահոսքի բաք; 8 - ֆիլտր; 9 - մուտքային զտիչ
Համակարգը ցույց է տրված նկ. 2-ը իզոկրատական է՝ շարժական փուլի բաղադրությունը քրոմատագրման ընթացքում չի փոխվում։ Եթե քրոմատոգրաֆիական անալիզի ժամանակ չափազանց կարևոր է փոխել շարժական փուլի մեկ կամ մի քանի բաղադրիչների կոնցենտրացիան, ապա օգտագործվում են այսպես կոչված գրադիենտ համակարգեր, որոնք սովորաբար բաղկացած են երկու կամ ավելի պոմպերից։ Գրադիենտային լուծույթի դեպքում յուրաքանչյուր լուծիչ առանձին անոթից սնվում է մագնիսական հարիչով հատուկ խառնիչ խցիկի մեջ, որտեղ, ըստ որոշակի ծրագրի, դրանք խառնվում են տվյալ ծավալային հարաբերակցությամբ։
Միկոտոքսինների վերլուծության համար ավելի հաճախ օգտագործվում են գրադիենտ համակարգեր, որտեղ որպես շարժական փուլ օգտագործվում են ացետոնիտրիլի լուծույթները ջրի մեջ՝ ժամանակի հետ գծային փոփոխվող կոնցենտրացիայով:
Քրոմատոգրաֆիկ սյունակը 150-ից 250 մմ տրամագծով մետաղյա խողովակ է՝ 4,6 մմ ներքին տրամագծով, լցված հատուկ սորբենտով, որը հիմնված է սիլիկատային գելի վրա՝ պատվաստված ածխաջրածնային ռադիկալներով: Պահակային սյունը ծառայում է քրոմատոգրաֆիկ սյունը աղտոտվածությունից պաշտպանելու համար:
Ուլտրամանուշակագույն լուսաչափական դետեկտորը HPLC դետեկտորի ամենատարածված տեսակն է: Դետեկտորի աշխատանքի սկզբունքը նման է սովորական սպեկտրոֆոտոմետրի սկզբունքին. այն գրանցում է լուծույթի օպտիկական խտությունը: Տարբերությունն այն է, որ ուլտրամանուշակագույն դետեկտորը հոսքի դետեկտոր է, լուծույթով կյուվետի փոխարեն օգտագործում է ֆոտոմետրիկ բջիջ։ Էլյուենտի հոսքը հոսում է աշխատանքային բջիջով, իսկ մաքուր շարժական փուլը հոսում է հղման բջիջով: Լույսի աղբյուրը սնդիկի լամպ է, որն առաջացնում է ինտենսիվ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթում: Ցանկալի ալիքի երկարությամբ լույսն ընտրվում է համապատասխան օպտիկական ֆիլտրերի միջոցով, անցնում է բջիջներով, մասամբ կլանում շարժական փուլի մոլեկուլները և տարանջատվող բաղադրիչները և գրավվում ֆոտոդետեկտորի միջոցով: Էլյուատի լույսի կլանումը (օպտիկական խտությունը) շարունակաբար գրանցվում է գծապատկերային ձայնագրիչի կամ համակարգչի միջոցով՝ գրանցելով քրոմատոգրամը: Խառնուրդի առանձնացված բաղադրիչները (օրինակ՝ միկոտոքսինները) ներկայացված են քրոմատոգրամայում որպես գագաթներ։ Քրոմատոգրամի վրա գագաթնակետի դիրքն օգտագործվում է նյութը նույնականացնելու համար, իսկ գագաթնակետի տարածքը՝ քանակական որոշման համար:
Ավելի բարդ սարքը լյումինեսցենտային (ֆտորաչափական) դետեկտորն է:
Տեղակայված է ref.rf
Նման դետեկտորն օգտագործում է օրգանական միացությունների, մասնավորապես՝ աֆլատոքսինների և զեարալենոնի կարողությունը՝ ֆլյուորեսցելու, երբ ենթարկվում են ուլտրամանուշակագույն կամ տեսանելի ճառագայթման: Լյումինեսցենտային դետեկտորն ունի հոսքի բջիջ՝ երկու փոխադարձ ուղղահայաց օպտիկական ալիքներով: Դրանցից մեկը ծառայում է հուզիչ ճառագայթման մատակարարմանը, մյուսը թույլ է տալիս չափել լյումինեսցենցիայի ինտենսիվությունը։ B 1 և M 1 աֆլատոքսինների վերլուծության դեպքում գրգռման ալիքի երկարությունը 360 նմ է, իսկ արտանետվող ճառագայթման ալիքի երկարությունը՝ 420 նմ։
Պետք է նշել, որ ուլտրամանուշակագույն դետեկտորը կարող է օգտագործվել նաև աֆլատոքսինների վերլուծության համար, սակայն դրա զգայունությունը մի կարգով ավելի ցածր է, քան ֆտորաչափական դետեկտորը, հետևաբար, ֆլյուորեսցենտային հայտնաբերումը նախընտրելի է աֆլատոքսինների ցածր կոնցենտրացիաների վերլուծության ժամանակ (MPC-ում): մակարդակ և ցածր):
Միկոտոքսինների որոշման մեթոդներ - հայեցակարգ և տեսակներ: «Միկոտոքսինների որոշման մեթոդներ» կատեգորիայի դասակարգումը և առանձնահատկությունները 2017, 2018 թ.
ԳՕՍՏ 32835-2014
ՄԻՋՊԵՏԱԿԱՆ ՍՏԱՆԴԱՐՏ
ՀՅՈՒԹԵՐԻ ԱՊՐԱՆՔՆԵՐ
Միկոտոքսինների որոշում տանդեմի բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-զանգվածային սպեկտրոմետրիայով (HPLC-MS/MS)
Հյութի արտադրանք. Միկոտոքսինների որոշում տանդեմի բարձր արդյունավետության հեղուկ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով (HPLC-MS/MS)
MKS 67.080.01
Ներածման ամսաթիվ 2016-01-01
Առաջաբան
Միջպետական ստանդարտացման աշխատանքների իրականացման նպատակները, հիմնական սկզբունքները և հիմնական ընթացակարգը սահմանվում են ԳՕՍՏ 1.0-92 «Միջպետական ստանդարտացման համակարգ. Հիմնական դրույթներ» և ԳՕՍՏ 1.2-2009 «Միջպետական ստանդարտացման համակարգ. Միջպետական ստանդարտներ, կանոններ և առաջարկություններ միջպետական ստանդարտացման համար»: Մշակման, ընդունման, կիրառման, նորացման և չեղարկման կանոններ
Ստանդարտի մասին
1 ՄՇԱԿՎԱԾ է Բարձրագույն մասնագիտական կրթության դաշնային պետական ուսումնական հաստատության «Մոսկվայի սննդի արտադրության պետական համալսարան» (FGBOU VPO «MGUPP»)
2 ՆԵՐԴՐՎԵԼ Է Տեխնիկական կարգավորման և չափագիտության դաշնային գործակալության կողմից
3 ԸՆԴՈՒՆՎԵԼ Է Ստանդարտացման, չափագիտության և սերտիֆիկացման միջպետական խորհրդի կողմից (2014 թվականի հունիսի 25-ի N 45-2014 արձանագրություն)
Քվեարկվել է ընդունելու համար.
Երկրի կարճ անվանումը ըստ MK (ISO 3166) 004-97 | Ազգային ստանդարտների մարմնի կրճատ անվանումը |
|
Հայաստան | Հայաստանի Հանրապետության էկոնոմիկայի նախարարություն |
|
Բելառուս | Բելառուսի Հանրապետության պետական ստանդարտ |
|
Ղրղզստան | Ղրղզստանի ստանդարտ |
|
Ռուսաստան | Ռոսստանդարտ |
4 Տեխնիկական կարգավորման և չափագիտության դաշնային գործակալության 2014 թվականի օգոստոսի 19-ի N 896-րդ ԳՕՍՏ 32835-2014 հրամանով ուժի մեջ է մտել որպես Ռուսաստանի Դաշնության ազգային ստանդարտ 2016 թվականի հունվարի 1-ից:
5 Սույն ստանդարտը մշակվել է՝ հաշվի առնելով հետևյալ միջազգային փաստաթղթերի դրույթները.
- CODEX STAN 247-2005* Codex General Standard For Fruit Juices and Nectars of the Codex Alimentarius Commission;
________________
* Տեքստում այսուհետ նշված միջազգային և արտասահմանյան փաստաթղթերին հասանելիություն կարելի է ստանալ՝ սեղմելով http://shop.cntd.ru կայքի հղմանը: - Տվյալների բազայի արտադրողի նշումը.
- Եվրոպական միության հանձնաժողովի 23.02.2006թ. ոչ 406/2006/EC «Սննդամթերքում միկոտոքսինների մակարդակի պաշտոնական հսկողության համար նմուշառման մեթոդները և վերլուծության մեթոդները սահմանող՝ սննդամթերքում միկոտոքսինների մակարդակի պաշտոնական հսկողության համար»);
- Մրգային հյութերի եվրոպական ասոցիացիայի մրգային և բանջարեղենային հյութերի որակի և իսկության գնահատման AIJN պրակտիկայի կանոնագիրք:
6 ԱՌԱՋԻՆ ԱՆԳԱՄ ՆԵՐԿԱՅԱՑՎԵԼ
Սույն ստանդարտի փոփոխությունների մասին տեղեկատվությունը հրապարակվում է «Ազգային ստանդարտներ» տարեկան տեղեկատվական ինդեքսում, իսկ փոփոխությունների և լրացումների տեքստը՝ «Ազգային ստանդարտներ» ամսական տեղեկատվական ինդեքսում: Սույն ստանդարտի վերանայման (փոխարինման) կամ չեղարկման դեպքում համապատասխան ծանուցում կհրապարակվի «Ազգային ստանդարտներ» ամենամսյա տեղեկատվական ինդեքսում: Համապատասխան տեղեկատվությունը, ծանուցումը և տեքստերը տեղադրված են նաև հանրային տեղեկատվական համակարգում՝ Տեխնիկական կարգավորման և չափագիտության դաշնային գործակալության պաշտոնական կայքում ինտերնետում:
1 օգտագործման տարածք
1 օգտագործման տարածք
Սույն ստանդարտը վերաբերում է մրգերից և բանջարեղենից ստացված հյութերին և այլ հյութեղ արտադրանքներին, բացառությամբ ցիտրուսային մրգային բջիջների, և սահմանում է միկոտոքսինների՝ պատուլինի և օկրատոքսին A-ի որոշման մեթոդ՝ օգտագործելով բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոզայի սպեկտրաչափությունը չափման տիրույթում: պատուլինի զանգվածային կոնցենտրացիան 0,1-ից մինչև 100,0 մկգ/դմ և օխրատոքսին A-ն՝ 0,1-ից մինչև 20,0 մկգ/դմ:
Ծանոթագրություն - Սույն ստանդարտը խորհուրդ է տրվում կիրառել դրա կիրառման վերաբերյալ հավելյալ տեղեկատվության հաստատման և կուտակման նպատակով:
2 Նորմատիվ հղումներ
Այս ստանդարտը օգտագործում է նորմատիվ հղումներ հետևյալ միջպետական ստանդարտներին.
ԳՕՍՏ 12.1.004-91 Աշխատանքի անվտանգության ստանդարտների համակարգ. Հրդեհային անվտանգություն. Ընդհանուր պահանջներ
ԳՕՍՏ 12.1.007-76 Աշխատանքի անվտանգության ստանդարտների համակարգ. Դասակարգում և ընդհանուր անվտանգության պահանջներ
ԳՕՍՏ 12.1.010-76 Աշխատանքի անվտանգության ստանդարտների համակարգ. Պայթյունի անվտանգություն. Ընդհանուր պահանջներ
ԳՕՍՏ 12.1.019-79 Աշխատանքի անվտանգության ստանդարտների համակարգ. Էլեկտրական անվտանգություն. Ընդհանուր պահանջներ և պաշտպանության տեսակների անվանացանկ
ԳՕՍՏ 61-75 Ռեակտիվներ. Քացախաթթու. Տեխնիկական պայմաններ
ԳՕՍՏ ՕԻՄԼ Ռ 76-1-2011 Չափումների միասնականության ապահովման պետական համակարգ. Ոչ ավտոմատ կշեռքներ. Մաս 1. Չափագիտական և տեխնիկական պահանջներ. Թեստեր
ԳՕՍՏ 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) Չափիչ լաբորատոր ապակյա իրեր. Բալոններ, բաժակներ, կոլբաներ, փորձանոթներ: Ընդհանուր բնութագրեր
ԳՕՍՏ ԻՍՕ 3696-2013 Ջուր լաբորատոր անալիզի համար. Տեխնիկական պահանջներ և վերահսկման մեթոդներ
ԳՕՍՏ ԻՍՕ 5725-1-2003 Չափման մեթոդների և արդյունքների ճշգրտություն (ճշգրտություն և ճշգրտություն): Մաս 1. Հիմնական դրույթներ և սահմանումներ
ԳՕՍՏ ԻՍՕ 5725-2-2003 Չափման մեթոդների և արդյունքների ճշգրտություն (ճշգրտություն և ճշգրտություն): Մաս 2. Չափման ստանդարտ մեթոդի կրկնելիության և վերարտադրելիության որոշման հիմնական մեթոդ
ԳՕՍՏ 5789-78 Ռեակտիվներ. Տոլուոլ. Տեխնիկական պայմաններ
ԳՕՍՏ 16317-87 Կենցաղային էլեկտրական սառնարանային սարքեր. Ընդհանուր բնութագրեր
ԳՕՍՏ 20015-88 Քլորոֆորմ. Տեխնիկական պայմաններ
ԳՕՍՏ 25336-82 Ապակյա իրեր և լաբորատոր սարքավորումներ. Տեսակներ. Հիմնական պարամետրերը և չափերը
ԳՕՍՏ 26313-84 Մրգերի և բանջարեղենի վերամշակված արտադրանք. Ընդունման կանոններ, նմուշառման մեթոդներ
ԳՕՍՏ 26671-85 Վերամշակված մրգեր և բանջարեղեն, մսի և միս և բանջարեղենի պահածոներ. Նմուշի պատրաստում լաբորատոր վերլուծության համար
ԳՕՍՏ 29030-91 Մրգերի և բանջարեղենի վերամշակման արտադրանք. Լուծվող պինդ մարմինների հարաբերական խտության և պարունակության որոշման պիկնոմետրիկ մեթոդ
ԳՕՍՏ 29227-91 (ԻՍՕ 835/1-81) Լաբորատոր ապակյա իրեր. Պիպետներն ավարտեցին: Մաս 1. Ընդհանուր պահանջներ
ԳՕՍՏ ԻՍՕ/ԻԷԿ 17025-2009 Փորձարկման և չափաբերման լաբորատորիաների իրավասության ընդհանուր պահանջներ
ԳՕՍՏ 32689.1-2014 Բուսական ծագման սննդամթերք. Թունաքիմիկատների մնացորդների գազաքրոմատագրական որոշման բազմամեթոդներ. Մաս 1. Ընդհանուր դրույթներ
ԳՕՍՏ 32689.2-2014 Բուսական ծագման սննդամթերք. Թունաքիմիկատների մնացորդների գազաքրոմատագրական որոշման բազմամեթոդներ. Մաս 2. Արդյունահանման և մաքրման մեթոդներ
ԳՕՍՏ 32689.3-2014 Բուսական ծագման սննդամթերք. Թունաքիմիկատների մնացորդների գազաքրոմատագրական որոշման բազմամեթոդներ. Մաս 3. Արդյունքների որոշում և վավերացում
Նշում - Այս ստանդարտն օգտագործելիս խորհուրդ է տրվում ստուգել տեղեկատու ստանդարտների վավերականությունը հանրային տեղեկատվական համակարգում՝ Տեխնիկական կարգավորման և չափագիտության դաշնային գործակալության պաշտոնական կայքում ինտերնետում կամ «Ազգային ստանդարտներ» տարեկան տեղեկատվական ինդեքսի համաձայն: , որը հրապարակվել է ընթացիկ տարվա հունվարի 1-ի դրությամբ, իսկ ընթացիկ տարվա «Ազգային ստանդարտներ» ամենամսյա տեղեկատվական ինդեքսի հարցերով։ Եթե հղման ստանդարտը փոխարինված է (փոփոխված), ապա այս ստանդարտն օգտագործելիս դուք պետք է առաջնորդվեք փոխարինող (փոփոխված) ստանդարտով: Եթե մատնանշված ստանդարտը չեղարկվում է առանց փոխարինման, դրույթը, որում տրված է դրան հղումը, կիրառվում է այնքանով, որքանով այդ հղումը չի ազդում:
3 հապավումներ
HPLC-MS/MS - տանդեմի բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-զանգվածային սպեկտրոմետրիա;
OTA, օկրատոքսին A;
PAT - պատուլին;
ESI- ցրման իոնացում էլեկտրական դաշտում ( Էլեկտրական իոնացում);
IARC- Քաղցկեղի հետազոտությունների միջազգային գործակալություն;
LOD- հայտնաբերման սահմանը;
LOQ- քանակական որոշման սահման;
SRM- բաղադրիչների նույնականացում ընտրովի ռեակցիաների վերահսկման ռեժիմում ( Ընտրված ռեակցիայի մոնիտորինգ).
4 Մեթոդի էությունը
Մեթոդի էությունը կայանում է նրանում, որ PAT և OTA միկոտոքսինների նախնական արդյունահանումը ացետոնիտրիլով անջուր մագնեզիումի սուլֆատի առկայության, կոնցենտրացիայի, ացետոնիտրիլում կրկին լուծարման և միկոտոքսինների զանգվածային կոնցենտրացիայի քանակական որոշման մեջ է HPLC-MS/MS ցողացիրով իոնիզացիայի միջոցով: էլեկտրական դաշտում և բաղադրիչների նույնականացում ընտրովի ռեակցիաների վերահսկման ռեժիմում:
5 Չափիչ գործիքներ, օժանդակ սարքավորումներ, տեղեկատու նյութեր, ռեակտիվներ և ապակյա իրեր
Վերլուծական HPLC-MS/MS* համակարգ եռաբևեռ զանգվածային դետեկտորով 10-ից մինչև 3000 ատոմային զանգվածի միավորի միջակայքում չափումների համար, զանգվածի չափման ճշգրտությամբ առնվազն 0,1 ա. ընտրված ռեակցիաների վերահսկման և մանկական և ծնողական իոնների սկանավորման ռեժիմում աշխատելու ունակություն, ազդանշանի և աղմուկի նվազագույն հարաբերակցությունը 1000:1: Վերլուծական համակարգը պետք է ներառի HPLC մոդուլ, որը բաղկացած է երկուական պոմպից՝ խառնիչով, քրոմատոգրաֆիկ սյունակային թերմոստատից, որն ապահովում է մինչև 50°C ջեռուցման ջերմաստիճան և քրոմատոգրաֆիկ սյունակ՝ հակադարձ փուլային սորբենտով՝ 5 մկմ C հատիկի չափով: , 150 մմ երկարությամբ և 3 մմ ներքին տրամագծով։ Օգտագործված համակարգը պետք է ապահովի միկոտոքսինների հայտնաբերումը 0,1-ից մինչև 100,0 մկգ/դմ միջակայքում:
________________
* Առաջարկվող LC/MS/MS համակարգերի մասին լրացուցիչ տեղեկությունների համար տե՛ս Հավելված Ա:
Չափման տիրույթով սպեկտրոֆոտոմետր, որը թույլ է տալիս փորձարկել 250-ից 400 նմ ալիքի երկարությամբ, որը թույլատրվում է 0,1%-ից ոչ ավելի օպտիկական խտության չափումների բացարձակ սխալով:
Կշեռքներ՝ համաձայն ԳՕՍՏ ՕԻՄԼ Ռ 76-1-ի, որոնք ապահովում են կշռման ճշգրտությունը մեկ կշռման թույլատրելի բացարձակ սխալի սահմանով՝ ±0,01 մգ-ից ոչ ավելի:
Լոգանքի ուլտրաձայնային.
4000-5000 պտ/րոպ ռոտորի արագությամբ ցենտրիֆուգ՝ 50 մլ տարողությամբ փորձանոթների համար:
Ցենտրիֆուգ՝ 10000-12000 պտ/րոպ ռոտորի արագությամբ՝ Էպենդորֆ տեսակի փորձանոթների համար՝ 1,5-2,0 մլ տարողությամբ:
Չորացնող պահարան, որն ապահովում է ջերմաստիճանի պահպանում մինչև 200°С:
Կենցաղային սառնարան ըստ ԳՕՍՏ 16317.
Շեյքեր խառնելու համար։
20-1000 մմ հաստատուն կամ փոփոխական տարողությամբ հեղուկ նմուշների դոզավորման սարքեր՝ 2,5%-ից ոչ ավելի իրական ծավալի դոզավորման հարաբերական սխալով:
Միկրոֆիլտր - վարդակ ներարկիչի վրա (վերականգնված ցելյուլոզա, տրամագիծը 13 մմ, ծակոտի չափը 0,2-0,4 մկմ):
Քվարցային կուվետներ 1 սմ աշխատանքային երկարությամբ։
PAT և OTA միկոտոքսիններ որպես տեղեկատու նմուշներ օգտագործելու համար հիմնական նյութի առնվազն 98% պարունակությամբ:
Սառցադաշտային քացախաթթու ըստ ԳՕՍՏ 61, անալիտիկ դասի.
Ացետոնիտրիլ գրադիենտ HPLC-ի համար:
Մեթանոլ գրադիենտ HPLC-ի համար:
Մագնեզիումի սուլֆատ անջուր, քիմիապես մաքուր
Կալցիումի քլորիդ անջուր, հատիկավոր, քիմիապես մաքուր
Քլորոֆորմ ըստ ԳՕՍՏ 20015, քիմիապես մաքուր
Տոլուոլ՝ համաձայն ԳՕՍՏ 5789, քիմիապես մաքուր
Էթիլային սպիրտ, բացարձակ։
Ջուր լաբորատոր անալիզի համար, մաքրությունը 1՝ համաձայն ԳՕՍՏ ԻՍՕ 3696:
Ճշգրտության 2-րդ դասի աստիճանավոր պիպետներ՝ 2-րդ ճշտության դասի 1, 2, 5, 10 սմ 2 տարողությամբ՝ համաձայն ԳՕՍՏ 29227:
5, 10, 25, 50, 100 և 1000 սմ 2 կամ 2ա հզորությամբ 2-րդ կարգի ճշգրտության ծավալային կոլբաներ՝ համաձայն ԳՕՍՏ 1770-ի:
Սուր հատակով կոլբայներ՝ 10,25 սմ3 տարողությամբ։
Eppendorf տիպի ցենտրիֆուգային խողովակ՝ 1,5-2,0 մլ տարողությամբ։
Microtest խողովակ 100-400 մմ հզորությամբ:
Ճշգրտության 2-րդ դասի չափիչ բալոններ՝ 25, 50, 250 սմ3 տարողությամբ ցանկացած դիզայնի ԳՕՍՏ 1770-ի համաձայն:
Պտուտակային գլխարկով ցենտրիֆուգային խողովակ, 50 սմ
Ճենապակյա բաժակ 125-150 մմ տրամագծով։
3 դմ տարողությամբ լաբորատոր չորացուցիչ:
Ձագարների լաբորատորիա՝ ԳՕՍՏ 25336-ի համաձայն.
50, 100, 250 սմ3 տարողությամբ հարթ հատակով կոլբաներ՝ համաձայն ԳՕՍՏ 25336:
10, 20, 50, 100 և 200 սմ3 տարողությամբ քիմիական ապակիներ՝ ԳՕՍՏ 25336-ի համաձայն:
Թույլատրվում է օգտագործել այլ չափիչ գործիքներ, օժանդակ սարքավորումներ, սպասք, որոնք չափագիտական և տեխնիկական բնութագրերով չեն զիջում վերոնշյալին և ապահովում են անհրաժեշտ չափումների ճշգրտությունը, ինչպես նաև ստանդարտ նմուշներ, ռեակտիվներ և նյութեր՝ վերը նշվածից ոչ վատ որակով։ .
6 Նմուշառում
Նմուշառում - ԳՕՍՏ 26313-ի համաձայն: Նմուշների պատրաստում և պահպանում - համաձայն ԳՕՍՏ 26671, ԳՕՍՏ 32689.1, ԳՕՍՏ 32689.2 և ԳՕՍՏ 32689.3:
7 Նախապատրաստում փորձարկման
7.1 Ընդհանուր պահանջներ
Փորձարկումից առաջ կատարվում է լաբորատոր ապակյա իրերի նախնական պատրաստում, ինչպես նաև ռեակտիվների և օժանդակ նյութերի որակի հսկողություն՝ ԳՕՍՏ 32689.1, ԳՕՍՏ 32689.2 և ԳՕՍՏ 32689.3 պահանջներին համապատասխան:
7.2 Օժանդակ լուծույթների պատրաստում
7.2.1 Շարժական Ա փուլի պատրաստում
1000 մլ տարողությամբ ծավալային կոլբայի մեջ կիպ փակված աղացած ապակիով կամ ֆտորոպլաստիկ խցանով, 1 մլ սառցադաշտային քացախաթթու, 100 մլ մեթանոլ պիպետտացրեք և բիթորած ջրով հասցրեք նշագծին: Խառնուրդը մանրակրկիտ խառնվում է։
Շարժական A փուլի պահպանման ժամկետը սենյակային ջերմաստիճանում` ոչ ավելի, քան մեկ ամիս:
7.2.2 Շարժական B փուլի պատրաստում
1000 մլ տարողությամբ ծավալային կոլբայի մեջ կիպ փակված աղացած ապակիով կամ ֆտորոպլաստիկ խցանով 1 մլ սառցադաշտային քացախաթթու դրվում է պիպետտով և մեթանոլով հասցվում նշագծին։ Խառնուրդը մանրակրկիտ խառնվում է։
Շարժական B փուլի պահպանման ժամկետը սենյակային ջերմաստիճանում` ոչ ավելի, քան մեկ ամիս:
ԾԱՆՈԹՈՒԹՅՈՒՆ Շարժական փուլը չպետք է շփվի ռետինե և պոլիմերային նյութերի հետ [բացառությամբ պոլիտետրաֆտորէթիլենի (PTFE)]:
7.2.3 Լուծիչի պատրաստում 1
Հարմար տարայի մեջ խառնում ենք 99 ծավալային մաս տոլուոլ և մեկ ծավալային մաս սառցադաշտային քացախաթթու։ Խառնուրդը մանրակրկիտ խառնվում է։
Սենյակային ջերմաստիճանում լուծիչ 1-ի պահպանման ժամկետը 6 ամսից ոչ ավելի է:
7.3 Մագնեզիումի սուլֆատի պատրաստում
Անջուր մագնեզիումի սուլֆատը, որն օգտագործվում է արդյունահանման մեջ որպես սորբենտ, պետք է չորացնել նույնիսկ պիտանելիության ժամկետի ընթացքում՝ օդից կլանված խոնավությունը հեռացնելու համար: Սորբենտը կալցինացվում է 180°C - 200°C ջերմաստիճանում 6-10 ժամ և պահվում է չորացուցիչի մեջ անջուր կալցիումի քլորիդի վրա։ Ռեագենտի պիտանիության չափանիշը լուծույթը տաքացնելիս լրացուցիչ ջրային շերտի բացակայությունն է, արդյունահանման փուլն իրականացվում է մինչև 30°C - 40°C ջերմաստիճանում և 2-3 րոպե հետո ռեակցիայի զանգվածը խառնվում է։ .
7.4 Միկոտոքսինի պահեստային լուծույթների պատրաստում
7.4.1 ՊԱՏ լուծույթների պատրաստում
7.4.1.1 ՊԱՏ պարունակող լուծույթի պատրաստում, զանգվածային կոնցենտրացիան 200 մկգ/սմ
Վերցրեք 2,0 մգ մաքուր բյուրեղային ՊԱՏ, կշռված 0,01 մգ ճշգրտությամբ, լուծեք 10 մլ ծավալային կոլբայի մեջ փոքր քանակությամբ քլորոֆորմի մեջ, այնուհետև քլորոֆորմով լուծույթի ծավալը հասցրեք նշագծին։
Նախնական PAT լուծույթի պահպանման ժամկետը 0°C ջերմաստիճանի դեպքում, ալյումինե փայլաթիթեղի մեջ սերտորեն փաթաթված աղացած խցանով ապակե ծավալային կոլբայի մեջ 1 ամսից ոչ ավելի է:
7.4.1.2 ՊԱՏ լուծույթի պատրաստում, զանգվածային կոնցենտրացիան 20 մկգ/սմ
Ստացված PAT լուծույթի 1 մլ (տե՛ս 7.4.1.1) տեղափոխել 10 մլ ծավալային կոլբայի մեջ և նոսրացնել մինչև նշագիծը քլորոֆորմով: Լուծույթում PAT-ի զանգվածային ճշգրիտ կոնցենտրացիան որոշելու համար վերցվում է ստացված PAT ստանդարտ լուծույթի 5,0 մլ և տեղափոխվում մոտ 15 սմ տարողությամբ տարայի մեջ, այնուհետև քլորոֆորմը հանվում է ազոտի մաքրման միջոցով մինչև չոր նյութ ստանալը: Չոր նյութը ստանալուց անմիջապես հետո տարայի մեջ ավելացվում է 5,0 մլ բացարձակ էթանոլ։ Լիովին լուծարել PAT-ը: Ստացված PAT լուծույթը ներմուծվում է 1 սմ օպտիկական ուղու երկարությամբ քվարցային կյուվետի մեջ, այնուհետև լուծույթի սպեկտրը գրանցվում է սպեկտրոֆոտոմետրի վրա 250-ից 350 նմ ալիքի երկարության միջակայքում՝ օգտագործելով բացարձակ էթանոլը հղումային կյուվետում որպես հսկիչ: .
PAT-ի զանգվածային կոնցենտրացիան լուծույթում, μg/cm, հաշվարկվում է բանաձևով
որտեղ է սպեկտրի օպտիկական խտության առավելագույն արժեքը (ալիքի երկարությունը մոտ 275 նմ), միավորներ: OP;
- PAT-ի մոլեկուլային քաշը, որը հավասար է 153,1 գ/մոլի;
- փոխակերպման գործակից;
- օպտիկական կլանման (մարման) մոլային գործակիցը հավասար է 14600, մ/մոլ.
7.4.1.3 100 մկգ/սմ PAT լուծույթի պատրաստում
5 մլ PAT-ի սկզբնական լուծույթը քլորոֆորմում 200 մկգ/մլ զանգվածային կոնցենտրացիայով (տես 7.4.1.1 կետը) տեղափոխվում է 10 մլ տարողությամբ ծավալային կոլբայի մեջ՝ խտացրած չոր մնացորդի մեջ սենյակային ջերմաստիճանում, հոսանքի տակ: ազոտը և անմիջապես վերալուծվում է ացետոնիտրիլի մեջ՝ հասցնելով այն կոլբայի ծավալին՝ պիտակավորման համար:
7.4.1.4 PAT լուծույթների պահպանման ժամկետը, համաձայն 7.4.1.2 և 7.4.1.3-ի, 0°C ջերմաստիճանում, ալյումինե փայլաթիթեղի մեջ սերտորեն փաթաթված աղացած խցանով, ոչ ավելի, քան 24 ժամ:
Օգտագործելուց առաջ լուծույթների ջերմաստիճանը հասցնում են սենյակային ջերմաստիճանի (չթույլատրվում է ալյումինե փայլաթիթեղը հանել ծավալային կոլբայից, քանի դեռ պարունակությունը չի հասել սենյակային ջերմաստիճանի)։ PAT-ի ոչնչացման պատճառով չի թույլատրվում տեղեկատու նմուշներ պահել լուծիչը հեռացնելուց հետո ստացված չոր նյութի բարակ թաղանթի տեսքով:
7.4.2 OTA պահեստային լուծույթի պատրաստում
7.4.2.1 20 մկգ/մլ OTA լուծույթի պատրաստում
Լուծել 2,0 մգ մաքուր բյուրեղային OTA, կշռված 0,01 մգ 25 մլ բաժակի մեջ 1-ին լուծիչով (տես 7.2.3) և քանակապես տեղափոխել 100 մլ ծավալային կոլբայի մեջ և նոսրացնել 1 լուծիչով մինչև նշագիծը:
Լուծույթում OTA-ի զանգվածային ճշգրիտ կոնցենտրացիան որոշելու համար ստացված նախնական OTA լուծույթը ներմուծվում է 1 սմ օպտիկական ուղու երկարությամբ քվարցային կյուվետի մեջ, այնուհետև լուծույթի սպեկտրը գրանցվում է սպեկտրոֆոտոմետրի վրա 300-ից մինչև ալիքի երկարության միջակայքում: 370 նմ, օգտագործելով լուծիչ 1 որպես տեղեկատու կուվետ:
Նախնական լուծույթում OTA-ի զանգվածային կոնցենտրացիան՝ μg/cm, հաշվարկվում է բանաձևով
որտեղ է սպեկտրի օպտիկական խտության առավելագույն արժեքը (ալիքի երկարությունը մոտ 333 նմ), միավորներ։ OP;
- OTA-ի մոլեկուլային քաշը, որը հավասար է 402,7 գ/մոլի;
- փոխակերպման գործակից;
- Հավելված Ա-ի համաձայն որոշված ուղղման գործակիցը.
- օպտիկական կլանման (մարման) մոլային գործակիցը հավասար է 544, մ/մոլ.
Օրիգինալ OTA լուծույթի պահպանման ժամկետը մինուս 18°C ջերմաստիճանի դեպքում, ալյումինե փայլաթիթեղի մեջ սերտորեն փաթաթված աղացած խցանով ապակե ծավալային կոլբայի մեջ չորս տարուց ոչ ավելի է:
7.4.2.2 5 մկգ/մլ OTA լուծույթի պատրաստում
Հանեք 2,5 մլ OTA հիմնական լուծույթը (7.4.2.1), տեղափոխեք 10 մլ ծավալային կոլբայի մեջ և նոսրացրեք լուծիչով 1 (7.2.3) մինչև նշագիծը:
OTA լուծույթի պահպանման ժամկետը 4°C ջերմաստիճանում ապակյա ծավալային կոլբայի մեջ, որն ունի աղացած խցան, որը սերտորեն փաթաթված է ալյումինե փայլաթիթեղի մեջ, ոչ ավելի, քան 24 ժամ:
Օգտագործելուց առաջ լուծույթի ջերմաստիճանը հասցվում է սենյակային ջերմաստիճանի (չի թույլատրվում ալյումինե փայլաթիթեղը հանել ծավալային կոլբայից մինչև պարունակությունը չհասնի սենյակային ջերմաստիճանի):
7.5 PAT և OTA տրամաչափման լուծույթների պատրաստում
PAT և OTA տրամաչափման լուծույթները պատրաստվում են դրանց պահեստային լուծույթների որոշակի ծավալներ խառնելով (տես 7.4.1.1 և 7.4.2.1) մաքրված խնձորի հյութի հետ, որը չի պարունակում որոշվող անալիտներ:
7.5.1 ՊԱՏ տրամաչափման լուծույթների պատրաստում
7.5.1.1 ՊԱՏ զանգվածային կոնցենտրացիայի միջանկյալ լուծույթի պատրաստում 1000 նգ/սմ (լուծույթ n-1)
1 մլ PAT լուծույթը (տես 7.4.1.3) կամ 1 մլ PAT բաղադրության ստանդարտ նմուշի 100 մկգ/սմ PAT զանգվածային կոնցենտրացիայով տեղափոխվում է 100 մլ տարողությամբ և ծավալով կոլբայի մեջ. լուծումը ճշգրտվում է նշագծին ացետոնիտրիլով:
7.5.1.2 ՊԱՏ զանգվածային կոնցենտրացիայի միջանկյալ լուծույթի պատրաստում 10 նգ/սմ (լուծույթ n-2)
1 մլ լուծույթ -1 (տես 7.5.1.1) տեղափոխել 100 մլ ծավալային կոլբայի մեջ և նոսրացնել մինչև նշագծին ացետոնիտրիլով:
7.5.1.3 PAT տրամաչափման լուծույթների պատրաստում
Ընտրված է աղյուսակ 1-ին համապատասխան, միջանկյալ լուծույթների որոշակի ծավալներ n-1 և n-2 (տես 7.5.1.1 և 7.5.1.2) և բաժանել 10 մլ ծավալային կոլբայի մեջ:
Աղյուսակ 1 - Լուծումների ծավալները n-1 և n-2 PAT տրամաչափման լուծույթների պատրաստման համար
Ցուցանիշի անվանումը | Կալիբրացիոն լուծումներ |
||||||
Լուծման ծավալը n-2 սմ | |||||||
Լուծման ծավալը n-1 սմ | |||||||
Ներարկված PAT-ի քանակը, նգ | |||||||
PAT-ի զանգվածային կոնցենտրացիան լուծույթում, նգ/սմ | |||||||
7.5.2 OTA տրամաչափման լուծույթների պատրաստում
7.5.2.1 200 նգ/մլ OTA միջանկյալ լուծույթի պատրաստում (լուծույթ Ա-1)
Խտացրեք 1 մլ 5 մկգ/մլ OTA լուծույթը (տես 7.4.2.2) մինչև չորանա ազոտի հոսքի տակ սենյակային ջերմաստիճանում և անմիջապես ացետոնիտրիլով տեղափոխեք 25 մլ ծավալային կոլբայի մեջ:
7.5.2.2 10 նգ/մլ OTA միջանկյալ լուծույթի պատրաստում (լուծույթ ԲԱՅՑ-2)
0.5 մլ OTA միջանկյալ լուծույթ ԲԱՅՑ-1-ը (տես 7.5.2.1) տեղափոխվում է 10 մլ ծավալային կոլբայի մեջ և նոսրացվում է մինչև նշագիծը ացետոնիտրիլով:
7.5.2.3 OTA տրամաչափման լուծույթների պատրաստում
Ընտրված է աղյուսակ 2-ի համաձայն՝ միջանկյալ լուծույթների որոշակի ծավալներ ԲԱՅՑ-1 և ԲԱՅՑ-2 (տես 7.5.2.1 և 7.5.2.2) և տարածել 10 մլ ծավալային կոլբայի մեջ:
Աղյուսակ 2 - Լուծումների ծավալները ԲԱՅՑ-1 և ԲԱՅՑ-2 OTA calibration լուծումների պատրաստման համար
Ցուցանիշի անվանումը | Կալիբրացիոն լուծումներ |
||||||
Լուծման ծավալը ԲԱՅՑ-2 սմ | |||||||
Լուծման ծավալը ԲԱՅՑ-1 սմ | |||||||
Կառավարվող OTA-ի գումարը, նգ | |||||||
OTA-ի զանգվածային կոնցենտրացիան լուծույթում, նգ/սմ | |||||||
Հստակեցրած խնձորի (կամ այլ ֆիլտրացված) հյութով տարաների մեջ լուծույթի ծավալը հասցրեք նշագծին:
HPLC-MS/MS-ում փորձարկման համար համակարգը ներարկվում է 7.5.1.3 և 7.5.2.3-ի համաձայն պատրաստված 10 մմ PAT և OTA տրամաչափման լուծույթներով և 7.7-ի համաձայն՝ հաշվի առնելով 8.3.1-ի պայմանները:
Կալիբրացիոն լուծույթի պահպանման ժամկետը 0°C - 4°C ջերմաստիճանում ապակյա ծավալային կոլբայի մեջ աղացած խցանով 24 ժամից ոչ ավելի է:
7.6 LC/MS/MS համակարգի պատրաստում
Չափումների համար HPLC-MS/MS համակարգի պատրաստումն իրականացվում է շահագործման ձեռնարկի (հրահանգի) և Հավելված Բ-ում տրված տեղեկատվության համաձայն:
Զանգվածային սպեկտրոմետրի աշխատանքային ռեժիմները կարգավորելիս խորհուրդ է տրվում օգտագործել MS/MS պարամետրերը միկոտոքսինների որոշման համար, որոնք տրված են Հավելված Բ-ում:
Այս դեպքում պետք է պահպանվեն հետևյալ պայմանները.
- շրջակա օդի ջերմաստիճանը 20°С-ից մինչև 25°С;
- մթնոլորտային ճնշում 84-ից 106 կՊա;
- լարումը ցանցում (220±10) V;
- ցանցում հոսանքի հաճախականությունը 49-ից 51 Հց;
- օդի հարաբերական խոնավությունը 40%-ից մինչև 80%:
7.7 HPLC-MS/MS համակարգի չափորոշում
Համակարգի չափաբերումը հյութերում միկոտոքսինների լուծույթներով՝ ըստ 7.5-ի, իրականացվում է HPLC-MS/MS համակարգի գործառնական ձեռնարկի (ցուցումների) համաձայն և 8.3.1-ի համաձայն պայմանները հաշվի առնելով՝ ամիսը մեկ անգամ: PAT-ի և OTA-ի գագաթնակետային տարածքները որոշվում են քրոմատոգրամների վրա և սահմանվում է չափաբերման կախվածություն կոնցենտրացիայի տիրույթում գագաթնակետային տարածքից՝ համաձայն 7.5-ի: Հաշվարկեք հարաբերակցության գործակիցը և յուրաքանչյուր տրամաչափման կետում միկոտոքսինների զանգվածային կոնցենտրացիայի հաշվարկված արժեքների շեղումը իրական արժեքից՝ ըստ տրամաչափման լուծույթների պատրաստման կարգի (տես 7.5): Չափորոշումը համարվում է ընդունելի, եթե հարաբերակցության գործակիցը առնվազն 0,999 է (PAT-ի համար) և 0,965 (OTA-ի համար), իսկ զանգվածի կոնցենտրացիայի հաշվարկված արժեքի հարաբերական շեղումը իրական արժեքից ոչ ավելի, քան ±10%:
Հարաբերական շեղման փոխարեն տրամաչափման բնութագրիչի ընդունելիությունը կարող է գնահատվել հարաբերական ստանդարտ շեղումով, որը չպետք է գերազանցի 5%-ը։
8 Փորձարկում
8.1 Արդյունահանում
10 մլ () նախապես մանրակրկիտ խառնված հյութամթերքը տեղադրվում է 50 մլ տարողությամբ պտուտակավոր գլխարկով ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ, փորձանոթին ավելացվում է 20 մլ ացետոնիտրիլ և 15 գ անջուր մագնեզիումի սուլֆատ: Խառնուրդը ինտենսիվ խառնվում է երեքից հինգ րոպե ձեռքով կամ թափահարողով: Հարելուց հետո ստացված էքստրակտը ցենտրիֆուգում են 10 րոպե 4000-5000 պտ/րոպում սենյակային ջերմաստիճանում կամ 5 րոպե ցենտրիֆուգի առկայությամբ 5°C ջերմաստիճանում սառեցմամբ։ Չափել էքստրակտի ընդհանուր ծավալը ցենտրիֆուգումից հետո (): Մզվածքի 18-19 սմ () վերցված պիպետտով կամ չափիչ սարքով տեղափոխվում է 25 սմ տարողությամբ սուր հատակով կոլբայի մեջ, 1 սմ () ացետոնիտրիլ։
Եթե նավի պատերին անլուծելի կարամելային թաղանթ կա, այն ոչնչացվում է ուլտրաձայնային լոգարանում երեքից հինգ րոպե: Լուծույթը տեղափոխում են Էպենդորֆ տեսակի 1,5-2,0 սմ3 տարողությամբ խողովակի մեջ և ցենտրիֆուգում 10000-12000 պտ/րոպում 3-5 րոպե։ Վերին շերտը վերցվում և զտվում է 0,2-0,4 մկմ ծակոտի չափով միկրոֆիլտրի միջոցով, անմիջապես 100-400 մմ տարողությամբ միկրոխողովակի մեջ: HPLC-MS/MS թեստի համար պատրաստված նմուշի 10 մմ ներարկվում է համակարգ:
8.2 Նմուշի պատրաստում խտացված արտադրանքից
Խտացրած հյութերը (խյուսը) վերականգնվում են ջրով մինչև լուծվող պինդ նյութերի նվազագույն մակարդակը, որը նախատեսված է որոշակի տեսակի հյութի արտադրանքի կարգավորող փաստաթղթերով: Խտացված հյութերի արտադրանքները, որոնց համար նախատեսված չէ լուծելի պինդ նյութերի նվազագույն մակարդակները, վերականգնվում են երկթորած ջրով մինչև 11,2% լուծելի պինդ նյութերի պարունակություն: Լուծվող պինդ նյութերի պարունակությունը վերահսկվում է ԳՕՍՏ 29030-ի համաձայն:
Վերակառուցված նմուշների արդյունահանումն իրականացվում է համաձայն 8.1.
8.3 Չափումներ կատարելը
8.3.1 Ընդհանուր պայմաններ
8.1-ին համապատասխան պատրաստված նմուշները և տրամաչափման լուծույթները ներարկվում են ընտրված հաջորդականությամբ: Ամենատարածված մեթոդն այն է, երբ տրամաչափման լուծույթների ներարկումը սկսվում և ավարտվում է մի շարք նմուշների ներարկումներով:
HPLC-MS/MS համակարգը պետք է միացված լինի SRMվերլուծված միկոտոքսինների ընտրովի հայտնաբերում ապահովող անցումներով: Պահպանման ժամանակները և գագաթնակետային տարածքները որոշվում են HPLC-MS/MS համակարգին կցված վերլուծության ծրագրաշարի միջոցով՝ վերլուծության արդյունքները գրանցելու և հաշվարկելու համար: HPLC/MS/MS համակարգերի, տարանջատման պայմանների և զանգվածային սպեկտրաչափական հայտնաբերման օրինակներ տրված են Հավելված Բ-ում:
Նմուշները փորձարկվում են կրկնելիության պայմաններում երկու զուգահեռ որոշման համար՝ համաձայն ԳՕՍՏ ԻՍՕ 5725-1 (ենթաբաժին 3.14) և ԳՕՍՏ ԻՍՕ 5725-2:
8.3.2 Միկոտոքսինների նույնականացում
Միկոտոքսինները նույնականացնելու համար նմուշների լուծույթներից ստացված պահման ժամանակները համեմատվում են տրամաչափման լուծույթներից համապատասխան միկոտոքսինների պահպանման ժամանակների հետ: Միկոտոքսինների առկայությունը հաստատելու համար համեմատություն է արվում առաջին և երկրորդ ազդանշանների ինտենսիվության հարաբերակցության միջև. մ/զ- անցում տրամաչափման լուծույթներից միկոտոքսինի ազդանշանների ինտենսիվության հարաբերակցությամբ:
Մեկ միկոտոքսինի գագաթնակետերի հարաբերակցությունը չպետք է տարբերվի ավելի քան 20% ազդանշանի ինտենսիվության ակնկալվող հարաբերակցությունից:
9 Փորձարկման արդյունքների մշակում և ներկայացում
9.1 Քանակականացում
Պատրաստված էքստրակտի ներարկված ծավալում միկոտոքսինների քանակականացումը (տես 8.1) իրականացվում է միկոտոքսինի գագաթնակետի մակերեսը (կամ բարձրությունը) համեմատելով այս միկոտոքսինին համապատասխան չափաբերման հատկանիշի հետ:
Փորձարկվող արտադրանքներում միկոտոքսինների զանգվածային կոնցենտրացիան՝ μg/dm, հաշվարկվում է բանաձևով
որտեղ է փոխակերպման գործակիցը խորանարդ սանտիմետրից խորանարդ դեցիմետրի;
- միկոտոքսինի կոնցենտրացիան 10 մմ էքստրակտի ծավալում, ներարկված HPLC-MS/MS համակարգում, որը որոշվում է տրամաչափման կախվածությամբ, նգ;
ացետոնիտրիլի ծավալն է, որում էքստրակտը կրկին լուծվել է կոնցենտրացիայից հետո, սմ;
- քաղվածքի ընդհանուր ծավալը, որից ծավալը վերցված է կոնցենտրացիայի համար, սմ.
- քրոմատոգրաֆ մուտքագրված նմուշի ծավալը (=10 մմ), մմ;
- փորձարկման համար վերցված հյութամթերքի նմուշի ծավալը, սմ.
կոնցենտրացիայի համար ընտրված էքստրակտի ծավալն է, տես
Խտացված հյութամթերքում միկոտոքսինների քանակությունը հաշվարկելիս հաշվի է առնվում ջրով նոսրացման աստիճանը` համաձայն 8.2-ի:
Չափման արդյունքը վերցվում է որպես երեք զուգահեռ որոշումների արդյունքների միջին թվաբանական, եթե ընդունման պայմանը բավարարված է.
որտեղ, զուգահեռ որոշումների երեք արդյունքների առավելագույն և նվազագույն արժեքներն են, μg/dm.
, , - երեք զուգահեռ որոշումների արդյունքներ, μg/dm;
- կրիտիկական միջակայքի արժեքը, %:
Միևնույն լաբորատորիայում կատարված երեք զուգահեռ որոշումների միջև (որպես միջին արժեքի տոկոս) անհամապատասխանությունը չպետք է գերազանցի կրկնելիության (կոնվերգենցիայի) սահմանը, որը հավասար է 3,6· հավանականությամբ = 0,95: Եթե այս պայմանը բավարարված է, վերջնական չափման արդյունքը վերցվում է որպես երեք զուգահեռ որոշումների թվաբանական միջին՝ կլորացված մինչև երրորդ տասնորդական թիվը:
Չափումների արդյունքները գրանցվում են արձանագրության մեջ՝ համաձայն ԳՕՍՏ ISO / IEC 17025:
9.2 Եթե ստացված արդյունքը ցույց է տալիս, որ միկոտոքսինի պարունակությունը գերազանցում է չափաբերման կախվածության միջակայքի վերին սահմանը, պատրաստեք նոր նմուշ՝ ավելացնելով դրա նոսրացումը ջրով և նորից չափեք:
10 Չափագիտական բնութագրեր
PAT-ի և OTA-ի մեթոդի չափագիտական բնութագրերը համապատասխանում են Աղյուսակ 3-ում բերված պայմաններին:
Աղյուսակ 3 - HPLC-MS/MS մեթոդի ճշգրտումներ
Չափման միջակայք, μg/dm | Կրկնելիության հարաբերական ստանդարտ շեղում, % | Վերարտադրելիության հարաբերական ստանդարտ շեղում, % |
PAT-ը որոշելիս (ոչ ավելին) |
||
OTA-ն որոշելիս (ոչ ավելին) |
||
Հյութամթերքի նմուշներում PAT-ի և OTA-ի հայտնաբերման սահմաններն են. LOD- 0,03 մկգ/դմ, LOQ- 0,1 մկգ / դմ.
11 Չափումների արդյունքների որակի վերահսկում
Լաբորատորիայում չափումների արդյունքների որակի վերահսկումը ներառում է չափումների արդյունքների կայունության մոնիտորինգ՝ օգտագործելով միջանկյալ ճշգրտության ստանդարտ շեղման կայունության ստուգումը: Կայունության փորձարկումն իրականացվում է Shewhart-ի կառավարման գծապատկերների միջոցով: Կատարված չափումների արդյունքների կայունության մոնիտորինգի հաճախականությունը կարգավորվում է որակի համակարգի ներքին փաստաթղթերում: Անբավարար հսկողության արդյունքների դեպքում, օրինակ, երբ գերազանցվում է գործողության սահմանաչափը կամ պարբերաբար գերազանցվում է նախազգուշացման սահմանը, պարզվում են այդ շեղումների պատճառները, այդ թվում՝ ռեակտիվներ փոխելը, օպերատորի աշխատանքը ստուգելը:
ԳՕՍՏ 12.1.007.
ՈՒՇԱԴՐՈՒԹՅՈՒՆ.Միկոտոքսինների հետ աշխատելիս պետք է հաշվի առնել, որ PAT-ը և OTA-ն ունեն ուժեղ թունավոր հատկություններ՝ արտահայտված նեֆրոտոքսիկ, իմունոտոքսիկ, տերատոգեն և գենոտոքսիկ ազդեցություններով: Ըստ դասակարգման IARC OTA-ն վերաբերում է մարդկանց համար պոտենցիալ վտանգավոր քաղցկեղածիններին (2B խումբ): Միկոտոքսինների հետ աշխատելիս պետք է պահպանվեն անվտանգության ավելի մեծ նախազգուշական միջոցներ: Լաբորատորիայի անձնակազմը պետք է կրի պաշտպանիչ հագուստ, ներառյալ դեմքի վահան, ձեռնոցներ և ակնոցներ: Միկոտոքսիններով բոլոր վիրահատությունները կատարվում են գոլորշիացման սարքի մեջ: Աշխատանքի ավարտից հետո օգտագործված լաբորատոր ապակյա իրերը և թափոնները ենթարկվում են ախտահանման:
Հավելված Ա (պարտադիր): Ստանդարտ լուծույթներում միկոտոքսինների զանգվածային կոնցենտրացիաների հաշվարկման համար սպեկտրոֆոտոմետրի ստուգում և CF ուղղիչ գործոնի որոշում
Հավելված Ա
(պարտադիր)
Ստանդարտ լուծույթներում միկոտոքսինների զանգվածային կոնցենտրացիաների հաշվարկման համար սպեկտրոֆոտոմետրի ստուգում և ուղղիչ գործոնի որոշում
Ա.1 Պահեստային լուծույթներում միկոտոքսինների զանգվածային կոնցենտրացիաները որոշելու համար (տես 7.4.1.1 և 7.4.2.1), օգտագործեք սպեկտրոֆոտոմետր, որը հարմար է լուծույթների օպտիկական խտությունը չափելու համար 1 սմ օպտիկական ուղու երկարությամբ քվարցային կյուվետում ալիքի երկարության միջակայքում: 200 նմ-ից մինչև 400 նմ:
Սպեկտրոֆոտոմետրի չափաբերումն իրականացվում է հետևյալ կերպ.
Չափել կալիումի երկքրոմատի (KCrO) երեք լուծույթների օպտիկական խտությունը ծծմբական թթուում (HSO) – 0,25; 0,125 և 0,0625 մմոլ/դմ առավելագույն կլանման կետում (ալիքի երկարությունը մոտ 350 նմ)՝ որպես հսկիչ՝ օգտագործելով ծծմբական թթվի (HSO) լուծույթ՝ 0,009 մմոլ/դմ կոնցենտրացիայով:
Այնուհետև կալիումի երկքրոմատի յուրաքանչյուր կոնցենտրացիայի համար հաշվարկվում է օպտիկական խտության մոլային գործակիցի արժեքը՝ մ/մոլ՝ ըստ բանաձևի.
որտեղ է կալիումի երկքրոմատի լուծույթի օպտիկական խտության չափված արժեքը ծծմբաթթվի համապատասխան կոնցենտրացիայի համար, միավորներ: OP;
- կալիումի երկքրոմատի լուծույթի կոնցենտրացիան ծծմբաթթվի մեջ, մմոլ/դմ.
Եթե երեք չափված արժեքների միջև տարբերությունը դուրս է օպտիկական խտության չափման ճշգրտության երաշխավորված միջակայքից, ապա պետք է ստուգել տրամաչափման ընթացակարգը կամ սարքավորումը: Հաշվի՛ր միջին թվաբանականը։
Որոշեք ուղղիչ գործակիցը (անչափ արժեք) կոնկրետ սարքավորումների համար (սպեկտրոֆոտոմետր և կուվետ) ըստ բանաձևի.
որտեղ է կալիումի երկքրոմատի (KCrO) լուծույթների մոլային օպտիկական խտության գործակցի բնորոշ արժեքը, մ/մոլ;
- օպտիկական խտության մոլային գործակիցը, որը հաշվարկվում է (A.1) բանաձևով, մ/մոլ.
Եթե ստացված ուղղման գործակցի արժեքը 0,95-ից փոքր է կամ 1,05-ից ավելի, ապա ստուգաչափման կարգը կամ սարքավորումը պետք է ստուգվեն՝ շեղումները վերացնելու համար (չափորոշման և մաքրության համար օգտագործվում է նույն կուվետների հավաքածուն):
Հավելված Բ (տեղեկատվական). HPLC-MS/MS համակարգերի օրինակներ՝ հյութերի և այլ հյութերի մեջ միկոտոքսինների որոշման համար*
Հավելված Բ
(տեղեկանք)
________________
* Այս օրինակները խորհուրդ են տրվում և տրամադրվում են սույն ստանդարտի օգտագործողների հարմարության համար:
B.1 HPLC-MS/MS համակարգ թիվ 1
Սարքավորման հարթակ՝ Varian 320-MS LC/MS/MS:
Իոնական