Mykotoksiinien määritysmenetelmät. Laboratoriomenetelmät mykotoksikoosien diagnosoimiseksi. Mykotoksiinit ja niiden määritysmenetelmät

Pentujen syntymän jälkeen alkaa nartulle ja sen omistajille vastuullinen aika, jolloin tulee huolehtia paitsi nartun ruokinnasta ja terveydestä myös vastasyntyneistä. Pentujen syntymän jälkeen nartulla voi ensimmäisenä parina päivänä olla huono ruokahalu, ruoansulatushäiriöt, varsinkin jos hän söi paljon synnytyksen jälkeen.

Muista, että tänä aikana sinun ei pitäisi turvautua antibiooteihin - tämä vaikuttaa haitallisesti vauvojen terveyteen. Yritä selviytyä turvallisemmilla lääkkeillä (kuten yrteillä, probiootteilla, mahahuuhtelulla, aktiivihiilellä ja mieluiten lignitiinillä). Erittäin hyviä tuloksia saadaan tässä tapauksessa käyttämällä Heelin täysin vaarattomia homeopaattisia valmisteita, eikä eläinlääketieteellisiä ole tarpeen etsiä, "ihmisvalmisteet" eivät toimi huonommin. Kokeile yhtä tai kahta ihonalaista injektiota Echinacea compositum, Nux vomica, Berebe-ris-hommacord. Hyviä tuloksia saadaan käyttämällä lääkettä saman Diar-heel-yhtiön tabletteina. Lääkettä annetaan 3 kertaa päivässä, 1 tabletti. Tulokset ovat parempia, jos se liuotetaan etukäteen 1,5 ruokalusikalliseen keitettyä vettä ja sekoitetaan huolellisesti.

Ensimmäisenä kolmena päivänä synnytyksen jälkeen ruokinnassa on oltava varovainen, jotta mahdollinen häiriö ei pahenna. Ulkomaiset kirjailijat ehdottavat tänä aikana antamaan nartulle keitettyjä pieniä kanoja, jotka on jauhettu yhdessä luiden kanssa ja sekoitettu keitetyn riisin kanssa.

Ensimmäisten synnytyksen jälkeisten päivien jälkeen narttu parantaa ruokahaluaan huomattavasti, ja tämä on aivan luonnollista - hänen kehonsa tarpeet kasvavat huomattavasti. Ternimaitoa alkaa muodostua aktiivisesti ensin ja sitten maitoa. Maidon määrä ja laatu eivät suurelta osin riipu pelkästään nartun yksilöllisistä ominaisuuksista, vaan myös sen ruokinnasta.

Ensimmäisellä viikolla rehun määrä ylittää tavanomaisen ruokavalion 1,5 kertaa. Mutta tänä aikana nartulle ei pidä antaa liikaa lihaa, jotta se ei aiheuta eklampsiaa. Proteiinikomponenttina voit tällä hetkellä antaa kalaa tai raejuustoa. Syötä narttua usein (4-5 tunnin välein), pieninä annoksina. Kun vatsan normaali toiminta on palautunut, on tarpeen jatkaa kivennäislisäaineiden ja keinojen antamista turkin vahvistamiseksi.

• liha, kala ja muut eläimenosat - 45%,
• viljat - 30%,
• maito ja maitotuotteet - 10%,
• vihannekset - 15%.

Jotta imettävä narttu saisi enemmän maitoa, hänen tulisi sisällyttää ruokavalioonsa imetystä edistäviä ruokia: raakaa porkkanaa, lihaa, kalaa, liemi, kaurapuuro jne. Tarjoa nartulle juotavaksi mahdollisimman usein: maitoa (jos sitä on) ei aiheuta häiriöitä), tee maidon kanssa, heikko kahvi maidolla. Voit lisätä maidon määrää kokeilemalla seuraavia:

• keite oregano;
• sitruunamelissan keittäminen: kaada yksi teelusikallinen ruohoa kahdella kupilla kiehuvaa vettä, anna hautua, lisää sokeria;
• laita kaksi teelusikallista teetä termospulloon, kaada kaksi kupillista kiehuvaa maitoa, anna hautua 3-4 tuntia, lisää sitten sokeri ja jäähdytä;
• anis keite.

Apilac, jota monet omistajat antavat nartuille imetyksen lisäämiseksi, ei tuottanut toivottuja tuloksia harjoituksissani, vaikka yritin antaa sitä eri nartuille.

Jos koira kieltäytyy jyrkästi juomasta, voit tietysti yrittää pakottaa hänet juomaan, mutta on parempi ensin yrittää "pettää" häntä laittamalla pieni pala voita vielä riittävän lämpimään juomaan. Voi hyvinkin olla, että voin tuoksu viettelee hänet.

Nartun uupumisen estämiseksi sen ruokinnan tulee tänä aikana olla täydellistä ja ravinnon tulee sisältää riittävä määrä kaloreita, proteiineja, vitamiineja ja kivennäisaineita.

Ruoan määrä ei kuitenkaan ole vakio koko imetysajan. Kuten jo mainittiin, ensimmäisen viikon aikana ruokavaliota tulisi lisätä 1,5 kertaa. Kun nartun maidon määrä kasvaa, myös annoksen tulisi kasvaa: toisella viikolla annos tulee kaksinkertaistaa ja kolmannesta viikosta laktaation loppuun asti kolminkertaistaa: Vertailu tehdään koira normaalitilassaan. Nartun tarvitsema ravinnon määrä riippuu hänen pentueensa koosta. Neljä pentua pentueesta tarvitsee 2-kertaisen lisäyksen ja kahdeksan pentua vähintään kolminkertaisen lisäyksen.

Yleensä narttu ruokkii pentuja 4-6 viikkoa. Nartun maidon määrä ei ole vakio koko imetyksen ajan. 20-25 päivään asti maidon määrä kasvaa ja sitten vähenee. Länsimaiset asiantuntijat tarjoavat erittäin helpon tavan laskea rehun kaloripitoisuus tänä aikana. Tässä menetelmässä punnitaan koko pentue 3-4 päivän iässä, lisätään 250 cal lisäenergiaa nartun ruokavalioon jokaista pentukiloa kohden ja tämän mukaisesti lisätään ruuan määrää ja kaloripitoisuutta.

Imetyksen kesto riippuu koiran yksilöllisistä ominaisuuksista ja ruokinnasta. Jokaisessa tapauksessa on tietysti otettava huomioon koiran yksilölliset ominaisuudet. On narttuja, joita pennut kirjaimellisesti "imevät ulos", ne tuottavat maitoa pitkään, suuria määriä ja ruokkivat pentuja jopa kaksi kuukautta. Luonnollisesti heidän ruokavalionsa tulisi olla suurempi ja täydellisempi kuin nartuilla, joilla on vähän maitoa jopa "maidontuotannon huipulla", joka osuu 14-17. imetyspäivään ja joiden omistaja vain haaveilee ruokkivansa. lapset enintään kolme viikkoa. Nartun maidontuotantoon vaikuttaa suurelta osin täysproteiininen ruokavalio, jossa on runsaasti välttämättömiä aminohappoja. Aminohappojen puute vaikuttaa ensisijaisesti maidon laatuun ja määrään, mikä hidastaa pentujen kasvunopeutta ja hidastaa niiden kehitystä.

Vitamiineilla on tärkeä rooli myös imettävien narttujen ruokinnassa. Niitä tarvitaan paitsi nartuille itselleen, myös pentujen kehitykselle. On tarpeen varmistaa, että narttu saa tarvittavan määrän vitamiineja koko laktaatiojakson ajan. Esimerkiksi pentujen kasvulle niin välttämättömän A-vitamiinin pitoisuus maidossa riippuu vain sen läsnäolosta emon rehussa*. Siksi omistajan tulee seurata tämän vitamiinin jatkuvaa läsnäoloa imettävän nartun ruokavaliossa. Tämä koskee myös D-vitamiinia ja B-vitamiineja, joita erittyy suuria määriä koiranmaidon mukana.

Narttu tarvitsee maidon tuottamiseen saman määrän lisäenergiaa kuin erittyvä maito sisältää. Siksi ruokavalion energiaarvo riippuu ensisijaisesti nartun maidon määrästä. Rehun kaloripitoisuus riippuu myös laktaatiojaksosta. Tiedetään, että ensimmäisellä ja toisella imetysviikolla narttu tuottaa vähemmän maitoa kuin kolmannella ja neljännellä viikolla. Siksi ruokavalio tulee suunnitella siten, että imetysjakson ensimmäisellä puoliskolla rehun energiaintensiteetti nousi 2 kertaa, toisessa - 3 kertaa verrattuna nartun tarpeeseen normaalitilassa. Käytännössä se näyttää tältä: maidon muodostumiseen imetyksen ensimmäisellä puoliskolla 10 kg painava imettävä narttu tarvitsee pääruokavalion lisäksi lisäruokavalion, jonka kaloripitoisuus on 750 kcal, ja seuraavat kaksi viikkoa - 1500 kcal päivittäin.

Välittömästi synnytyksen jälkeen naisen maitorauhaset erittävät ternimaitoa. On tarpeen varmistaa, että jokainen vastasyntynyt pentu saa ternimaitoa, joka sisältää spesifisiä vasta-aineita.

Suuri merkitys maidon muodostumiselle on kivennäisaineilla, joiden puute aiheuttaa erilaisia ​​osteodystrofisia sairauksia paitsi imettävillä nartuilla myös jälkeläisillä. Samanaikaisesti imettävien naaraiden selkäranka tyhjenee mineraaleista ja muuttuu huokoiseksi, hauras, ilmaantuu osteoporoosia ja riisitautia vastasyntyneillä pennuilla. On tärkeää estää mineraalivarantojen kertyminen tiineyden aikana ja nuorilla nartuilla - kasvun ja ensimmäiseen laktaatioon valmistautumisen aikana. Imettävät nartut tarvitsevat enemmän suolaa kuin ei-imettävät nartut.

5 kg painavien imettävien narttujen ruokien laadullinen koostumus ja päivittäinen energiaintensiteetti ensimmäisellä-toisella ja kolmannella-neljännellä imetysviikolla

15 kg painavien imettävien narttujen ruokien laadullinen koostumus ja päivittäinen energiaintensiteetti ensimmäisellä-toisella ja kolmannella-neljännellä imetysviikolla

25 kg painavien imettävien narttujen ruokavalion laadullinen koostumus ja päivittäinen energiaintensiteetti ensimmäisellä-toisella ja kolmannella-neljännellä imetysviikolla

Mykotoksiinien määritysmenetelmät

Nykyaikaisia ​​menetelmiä elintarvikkeiden ja rehujen mykotoksiinipitoisuuksien havaitsemiseksi ja määrittämiseksi ovat seulontamenetelmät, kvantitatiiviset, analyyttiset ja biologiset menetelmät. Mykotoksiinimenetelmät kehittyvät erittäin nopeasti. Kehitettyjen menetelmien ja erilaisten modifikaatioiden määrä on saavuttanut jo useita satoja ja jatkaa kasvuaan.

Seulontamenetelmillä, joille on ominaista yksinkertaisuus ja analyysin nopeus, voit nopeasti ja luotettavasti "seuloa" kontaminoitumattomat näytteet. Näitä ovat yleisesti käytetyt menetelmät, kuten minikolonnimääritys aflatoksiinien, okratoksiini A:n ja zearalenonin määrittämiseksi; TLC-menetelmät jopa 30 erilaisen mykotoksiinin samanaikaiseen määritykseen; fluoresoiva menetelmä aflatoksiinien aiheuttaman saastumisen havaitsemiseksi jne.

Kvantitatiiviset analyyttiset menetelmät mykotoksiinien määrittämiseksi voidaan jakaa kemiallisiin, radioimmunokemiallisiin ja entsyymi-immunomäärityksiin. Kemialliset menetelmät ovat tällä hetkellä yleisimpiä ja sisältävät mykotoksiinien peräkkäiset eristysvaiheet ja asianmukaisen kvantifioinnin. Eristysvaihe koostuu kahdesta vaiheesta: uutto - mykotoksiinin erottaminen substraatista ja puhdistus - mykotoksiinin erottaminen yhdisteistä, joilla on samanlaiset fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet. Mykotoksiinien lopullinen erotus suoritetaan käyttämällä yksi- tai kaksiulotteista ohutkerroskromatografiaa (TLC) silikageelilevyillä erilaisissa liuotinjärjestelmissä, kaasu- ja kaasu-nestekromatografialla, korkean erotuskyvyn nestekromatografialla ja massaspektrometrialla. Mykotoksiinien kvantitatiivinen määritys suoritetaan tavallisesti vertaamalla suoraan fluoresenssin intensiteettiä TLC:llä ultraviolettivalossa tunnetun pitoisuuden standardeihin sekä visuaalisesti että densitometrisesti. Menetelmien luotettavuuden parantamiseksi käytetään erilaisia ​​varmistustestejä, jotka perustuvat muiden kromatografisten, kolorimetristen tai fluorimetristen ominaisuuksien omaavien mykotoksiinijohdannaisten valmistukseen.

Viime vuosille on ollut ominaista lisääntynyt huomio erittäin herkkien ja erittäin spesifisten radioimmunokemiallisten ja entsyymi-immunomääritysmenetelmien kehittämiseen mykotoksiinien havaitsemiseen, tunnistamiseen ja kvantifiointiin. Nämä menetelmät perustuvat antiseerumien saamiseen mykotoksiinikonjuganteille naudan seerumin albumiinin kanssa. Niiden etuna on poikkeuksellinen herkkyys, joka mahdollistaa mykotoksiinien pikogrammien havaitsemisen ja kehittämisen määritysprosessin automatisoinnin suuntaan. Biologisia menetelmiä, jotka eivät yleensä ole kovin spesifisiä ja herkkiä, käytetään pääasiassa sellaisten mykotoksiinien havaitsemiseen, joille ei ole saatavilla kemiallisia analyysimenetelmiä, tai varmistustesteinä. Testikohteina toimivat erilaiset mikro-organismit, kanan alkiot, monet koe-eläimet, solu- ja kudosviljelmät.

Elintarvikkeiden koostumuksen mykotoksiinipitoisuuden määrittämiseksi näytteet valmistetaan kiinteän faasin uuttomenetelmällä konsentrointipatruunoilla "Diapak" (s. 3.2.3). Valmistettujen näytteiden mykotoksiinien erotus, tunnistaminen ja kvantitatiivinen määritys suoritetaan korkean erotuskyvyn nestekromatografialla Milichrome-5-sarjan mikrokolonnikromatografilla modulaarisessa rakenteessa (kuva 12).

Riisi. 12. Mikrokolonnikromatografi

Paperi käsittelee HPLC:n käänteisfaasiversiota patuliinin määrittämiseksi. Havaitseminen suoritetaan aallonpituudella 276 nm. Patuliinin tarkkaan tunnistamiseen käytetään myös moniaallonpituusdetektiota, joka mahdollistaa spektrisuhteiden käyttämisen lisätunnistusparametrina. Erotus suoritetaan gradienttieluointitilassa, mikä parantaa analyysin resoluutiota ja herkkyyttä.

Riisi. 13. Nestekromatografi:

1 - pumppu; 2 – näytteen injektioyksikkö; 3 – kromatografinen kolonni; 4 - ilmaisin;
5 - eluaatin viemäri tai fraktioiden kerääjä; 6 - rekisterinpitäjä (tallennin,
integraattori tai henkilökohtainen tietokone)

6
4

Näyteanalyysi nestekromatografia käyttäen (kuva 13) suoritetaan seuraavasti. Tietty tilavuus analysoitua näyteliuosta syötetään kromatografiakolonnin (3) yläosaan näytteen injektioyksiköllä (2). Analysoitu seos pumpataan pumpulla (1) eluentilla kromatografiakolonnin (3) läpi, jossa analysoitu seos erotetaan erillisiksi fraktioiksi (komponenteiksi). Pylväästä virtaava eluaatti, joka sisältää erotetut komponentit, analysoidaan detektorilla (4), jonka lukemat tallentaa tallennin (6).

1. 
   HPLC:n metodologiset perusteet

Patuliinin määrittämiseen käytetyn HPLC-menetelmän olemuksen ymmärtämiseksi on tarpeen tutkia joitain sen taustalla olevia metodologisia näkökohtia.

Eluotrooppinen sarja. Eluentin eluointikyky on eluentin (liuottimen tai liuottimien seoksen) kyky syrjäyttää adsorbaatti adsorbentin pinnalta. Tässä tapauksessa mitä vahvemmin eluenttimolekyylit adsorboituvat sorbentin aktiivisiin kohtiin, sitä suurempi on sen eluointikyky. Liuottimet, jotka on järjestetty riviin lisäämässä eluointivoimakkuutta, muodostavat eluotrooppisen sarjan.

Käänteisfaasikromatografian eluentteina käytetään liuotinseoksia, jotka sisältävät vettä ja orgaanisia yhdisteitä, jotka muuttavat eluointivoimakkuutta - n-alkoholeja, asetonitriiliä, tetrahydrofuraania ja muita, jotka muodostavat todellisia liuoksia veden kanssa. Normaalifaasikromatografiassa eluentteina käytetään polaarisia modifioijia - lineaarisia ja syklisiä hiilivetyjä (heksaani, sykloheksaani, heptaani jne.).

Nestekromatografien detektorit. Tällä hetkellä on kehitetty yli 20 HPLC-ilmaisinta. Viisi on eniten käytettyjä, joista kolme on optisia ja kaksi sähkökemiallisia. Näiden viiden ilmaisimen avulla voit analysoida kaikkia orgaanisten ja epäorgaanisten aineiden luokkia.

Optisiin ilmaisimiin kuuluu spektrofotometrinen ilmaisin (ultravioletti (UV), joka toimii aallonpituusalueella
200–360 nm ja näkyvät aallonpituusalueella 360–780 nm), fluorimetriset ja taitekerroinilmaisimet; sähkökemiallisiin - voltammetrisiin ja konduktometrisiin ilmaisimiin. Erityisen tärkeä on massaspektrometrinen detektori, jolla on ainutlaatuinen tietosisältö, koska se mahdollistaa kromatografisesti erotettujen komponenttien tunnistamisen aineiden massaspektritietokannoista.

Spektrofotometrinen ilmaisin on yleisin HPLC-detektori. Sen toimintaperiaate perustuu tunnettuun Bouguer-Lambert-Beerin valon absorptiolakiin. Spektrofotometrinen ilmaisin tallentaa aineen säteilyn selektiivisen absorption absorption spektrit. Absorptiospektrit riippuvat tutkittavan aineen rakenteesta. Tämän avulla voit tunnistaa aineen sen spektrin perusteella, jolla on spektrien tai standardien kirjasto. Bouguer-Lambert-Beer-lain mukaan spektrikaistojen intensiteetti riippuu aineen pitoisuudesta, joka on perusta kvantitatiiviselle analyysille eli aineen pitoisuuden määrittämiselle.

Anna yksivärinen valo lähteestä, jonka intensiteetti on minä 0 putoaa pituudeltaan ojaan l (optinen polku). Kyvetti on täytetty konsentroidun aineen liuoksella Kanssa. Aine pystyy absorboimaan monokromaattista säteilyä. Tietyn monokromaattisen säteilyn absorboimiskyvyn mitta on arvo ε on molaarinen absorptiokerroin tai ekstinktiokerroin. Heikentynyt valonsäde tulee ulos kyvetistä voimakkaalla tavalla minä. Valon absorption lain mukaan aallonpituudella λ= konst

minä= minä 0 ∙10 -ε Cl , (7)

missä minä on valovirran intensiteetti kyvetin läpi kulkemisen jälkeen;
minä 0 on tulevan valovirran intensiteetti; ε on ekstinktiokerroin; Kanssa on aineen moolipitoisuus kyvetissä; l on kyvetin pituus.

Asenne minä to minä Prosentteina ilmaistua arvoa 0 kutsutaan lähetykseksi T, ja arvo A=lg(I 0 / minä) - optinen tiheys.

A=lg(I 0 /I)= ε С∙l. (8)

Aineen optinen tiheys on suoraan verrannollinen analyytin pitoisuuteen. Spektrofotometrisissa ilmaisimissa analyyttinen suure on optinen tiheys MUTTA. Kaava (8) toimii kvantitatiivisen analyysin perustana käytettäessä spektrofotometristä ilmaisinta, koska optinen tiheys MUTTA aine on suoraan verrannollinen kromatografisen piikin korkeuteen tai pinta-alaan.

Optisen tiheyden riippuvuus MUTTA Kyvettiin tulevan valon aallonpituudesta aineen kanssa aallonpituusalueella 190-360 nm kutsutaan (kuva 14).

200 230 260 290 320 350 λ , nm

MUTTA, f.r.p.
Riisi. 14. Vesiliuoksen ultraviolettisäteilyn absorptiospektri
aineet X

3.2.3. näytteen valmistus

Kaikilla aineilla on maksimiabsorptioaallonpituus
(λ , nm). Tätä aallonpituutta käytettäessä ilmaisimella on alin kynnys aineen havaitsemiseksi.

Spektrofotometrisen ilmaisimen (SPD) avulla havaitaan suuri määrä eri luokkiin kuuluvia aineita, jotka absorboivat ultraviolettivaloa.

Spektrofotometrisen ilmaisimen käyttö kromatografiassa helpottaa suuresti tunnistamista. Moniaallonpituusilmaisin yhdessä ohjelmiston kanssa mahdollistaa kromatogrammin saamisen useilla aallonpituuksilla samanaikaisesti ja lisäparametrin laskemisen komponenttien tunnistamiseksi - spektrinenasenne (K) on kromatografisen huipun korkeuksien suhde eri aallonpituuksilla

missä MUTTA 1 ja MUTTA 2 - optisen tiheyden kertoimet aallonpituuksilla 1 ja 2. Arvo K jokaiselle aineelle on vakioominaisuus, eikä se riipu sen pitoisuudesta. Spektrisuhteiden tarkkuus riippuu aineen optisen tiheyden arvoista ja ilmaisimen suunnittelusta.

Näytteen valmistelu kiinteäfaasiuuttomenetelmällä konsentroivien patruunoiden avulla säästää aikaa ja työvoimakustannuksia. Kiinteän faasin uuton avulla voit väkevöidä näytteen ja puhdistaa sen mukana olevista epäpuhtauksista. Kiinteän faasin uuton monimutkainen järjestelmä mahdollistaa kahden patruunan peräkkäisen käytön:

– yleiskäyttöinen tiivistyspatruuna “DIAPAK P-Z” – uudelleenkäytettävä patruuna (jopa 50 näytettä), jossa on sarja ylä- ja alasuodattimia (10 kpl);

– yleiskasetti hienopuhdistukseen “DIAPAK S” – kertakäyttöinen patruuna.

varten väkevöintipatruunoiden valmistus sinun on suoritettava seuraavat toiminnot.

varten konsentraatiopatruunan "DIAPAK P-Z" valmistus:

- pumppaa 10 ml vesi-asetonitriili-seosta (58:42) patruunan läpi;

– Pumppaa patruunan läpi juuri ennen näytteen valmistusta 10 ml tislattua vettä.

varten väkevöintipatruunan valmistelu "DIAPAK S":

- pumppaa 5 ml bentseeniä patruunan läpi ja liitä patruuna molemmista päistä.

Elintarvikkeen valmistaminen keskittymistä varten

Laitetaan 10,0 g:n näyte dekantterilasiin, sekoitetaan pieneen määrään tislattua vettä ja siirretään kvantitatiivisesti 50 ml:n mittapulloon. Lisätään pulloon 6,0 ml Carrez I -liuosta ja Carrez II -liuosta. Kolvin sisältö lisätään merkkiin tislatulla vedellä, sekoitetaan huolellisesti ja suodatetaan mittasylinteriin paperilaskostetun suodattimen läpi. Mittaa kirkkaan suodoksen tilavuus P.

Kun valmistat kirkastettuja mehuja ja juomia, näyte suodatetaan tiiviin paperisuodattimen läpi, kunnes saadaan 20 ml kirkasta suodosta P.

Näytteen pitoisuus patruunassa "DIAPAK P-Z"

Levitä koko tilavuus suodosta P aiemmin valmistettuun patruunaan nopeudella 1–2 tippaa sekunnissa.

Huuhtele patruuna 5 ml:lla kaksi kertaa tislattua vettä ja hävitä kaikki pesut.

Eluoi patuliini 10 ml:n etyyliasetaattipatruunasta pulloon tai tulpalliseen mittaputkeen, joka sisältää 5 ml
1,5 % natriumkarbonaatin vesiliuos, tulppa, sekoita voimakkaasti ja anna kuoriutua.

Kokoa kuivauskolonni täyttämällä suodatinkotelo noin 2 g:lla vedetöntä natriumsulfaattia, tiivistä kuivausaine koputtamalla kolonnin seinämään ja kiinnitä vanupuikolla.

Ylempi etyyliasetaattikerros dekantoidaan pipetillä, suodatetaan kuivauskolonnin läpi ja kerätään suodos 50 ml:n sydämenmuotoiseen pulloon; uutetaan lisäksi natriumkarbonaatin vesiliuos ensin 10 ml:lla ja sitten 5 ml:lla etyyliasetaattia ja erotuksen jälkeen suodatetaan peräkkäin dekantoidut etyyliasetaatin tilavuudet kuivauskolonnin läpi samaan pulloon.

Haihduta etyyliasetaatti tyhjössä korkeintaan 40°C:n lämpötilassa noin 0,5 ml:n tilavuuteen (älä haihduta kuiviin!), Lisää 2,5 ml bentseeniä (tilavuussuhde 1:5).

Näytteen puhdistaminen patruunasta "DIAPAK S"

Poista valmistetun patruunan korkit ja anna bentseeni-etyyliasetaattinäyteliuos viedä läpi nopeudella 1-2 tippaa sekunnissa. Pese pullo toisella 0,5-1,0 ml:lla bentseeni-etyyliasetaattia (85:15) ja laita patruunaan huuhtelemalla pois pesuvedet.

Eluoi patuliini 6 ml:n patruunasta bentseeni:etyyliasetaatilla (7:3) ja kerää eluaatti ytimen poistopulloon.

Eluaatti haihdutetaan kuiviin kuivailmahauteessa, jonka lämpötila ei ylitä 40 °C.

Heti! Haihdutuksen jälkeen näyte liuotetaan uudelleen 0,2–0,25 ml:aan eluenttia A (kohta 3.2.4.2), joka on jäähdytetty 5–8 °C:seen.

3.2.4. Työmääräys

Tavoite– määritys elintarvikkeiden koostumuksesta korkean erotuskyvyn nestekromatografialla Milichrom-5-sarjan mikrokolonnikromatografilla.

3.2.4.1. Mittaustekniikka

Mittaukset sisältävät seuraavat päävaiheet:

- kromatografin kalibrointi liuosten mukaan, joiden patuliinin massapitoisuus tunnetaan;

- elintarvikenäytteen valmistus kiinteän faasin uuttomenetelmällä kappaleiden mukaisesti. 3.2.3;

– uutteen analyysi HPLC:llä ja signaalin rekisteröinti UV-detektorilla;

– patuliinin tunnistaminen retentioparametreilla ja spektrisuhteilla;

– näytteen patuliinin massapitoisuuden laskeminen rekisteröidyn analyysisignaalin (huipun korkeuden) ja kalibrointikäyrän perusteella;

- patuliinin massaosuuden laskeminen elintarviketuotteen koostumuksessa.

Instrumentit, reagenssit ja materiaalit, tarvitaan työn suorittamiseen:

– Milichrome-5-sarjan kromatografi tai mikä tahansa muu HPLC-kromatografi WinXrom- tai Multichrome-ohjelmistolla;

– HPLC-kromatografinen kolonni: Diasfer–110–С10СN (5 µm, 2 × 80 mm, TU 4215–001–05451931–94);

– vaihtelevan tilavuuden annostelija 1-100 µl:lle;

– vaihtelevan tilavuuden annostelija 100–1000 µl:lle;

- erlenmeyerpullo, jossa on tiiviisti hiottu ohut osa ja jonka tilavuus on enintään 10 ml;

– kalvosuodattimet;

- sarja patuliinin standardiliuoksia, joiden pitoisuus on 1, 2, 5 ja 10 mg/l;

- fosforihappoa 85 %;

– asetonitriili nestekromatografiaan (erityinen puhtausspesifikaatio TU 6–09–3513–86, UV-absorptio 200 nm asti);

– heksaani, kemiallisesti puhdas (puhdistettu);

- trifluorietikkahappo;

– Carrez-liuos I – liuotetaan 15,0 g kaliumheksasyanoferaattia II 100 ml:aan vettä.

- Carrez II -liuos - liuotetaan 30,0 g sinkkiasetaattia 100 ml:aan vettä;

- eluentit A, B ja C.

Eluenttien valmistus

Eluentti A. 20 ml asetonitriiliä ja 0,5 ml 10-prosenttista trifluorietikkahappoliuosta lisätään mittapulloon, jossa on tiiviisti hiottu lasiosa, jonka tilavuus on 100 ml. Liuos sekoitetaan perusteellisesti ja täytetään merkkiin asti tislatulla vedellä, joka on aiemmin suodatettu nailonkalvosuodattimen (0,2 um) läpi. Sitten eluentista poistetaan kaasut evakuoimalla 1 minuutin ajan 1 kg∙s/cm2:n päästöllä.

Eluentit B ja C Valmistettu samalla tavalla kuin eluentti A, vain 10 ml ja 0 ml asetonitriiliä otetaan 100 ml:aan liuosta, vastaavasti.

3.2.4.2. Kromatografisten erotustilojen asettaminen
ja tulosten rekisteröinti

Mittausten suorittamista varten on tarpeen asettaa kromatografin toimintatilat.

Annostelutilat:

– regenerointi – 300 µl;

– näytetilavuus – 5 µl;

– eluentin kulutus – 150 µl/min;

– gradienttieluointitilat: 800 µl – eluentti A,
500 ui - eluentti B, 300 ui - eluentti C;

- termostaatin lämpötila - 35 0 С.

Tunnistustilat:

– aallonpituuksien lukumäärä – 3;

– aallonpituudet – 250, 276, 290 nm;

– mittausaika – 0,04 s.

Kromatografiajärjestelmän vakauttaminen suoritetaan 30 minuuttia ennen mittauksia tekemällä "blanko"-analyysi, jossa patuliinia sisältävä standardiseos korvataan 5-10 µl:lla eluenttia ja sitten erotetaan mykotoksiinien standardiseos.

Harjoitus 1. Tutkia elintarviketuotteiden näytteenvalmistusmenetelmää patuliinipitoisuuden määrittämiseksi. Valmistetaan näytteet kohdan 3.2.3 mukaisesti.

Tehtävä 2. Kalibroi kromatografi. Kromatografi kalibroidaan lisäämällä peräkkäin patuliinin standardiliuoksia, joiden pitoisuudet ovat 1, 2, 5 ja 10 mg/l.

Opettajan ohjauksessa kromatografisen erotuksen parametrit (kohta 3.2.4.3) ehdotetaan syötettäväksi PC:n näppäimistöltä ohjelmaan (WinXrom) ja käynnistettävä 2-4 kromatografista analyysiä automaattitilassa. Tulokset esitetään taulukon muodossa. 6.

T a b l e 6

Rakenna saatujen kromatografisten profiilien perusteella kalibrointikäyrä (pitoisuus piirretään ordinaatta-akselia pitkin - mg / l, abskissa-akselia pitkin on mykotoksiinin optinen tiheys MUTTA– s.o.p.).

Tehtävä 3. Tunnista patuliini elintarviketuotteen testinäytteestä ja määritä sen pitoisuus.

Aloita valmiin elintarvikenäytteen mittaus automaattitilassa opettajan ohjauksessa
(tehtävässä 2 valitut kromatografiset erotusparametrit). Kun mittaus on suoritettu, tunnista patuliinimykotoksiini tehtävässä 2 saadun standarditiedoston ("StandardDD-MM-YY.001") mukaan. Määritä patuliinin pitoisuus elintarvikenäytteestä tehtävässä 2 rakennetun kalibrointikaavion avulla.

Kirjaa tulokset taulukkoon. 7.

Taulukko 7

Patuliinin massapitoisuus elintarvikenäytteessä lasketaan kaavalla

missä Kanssa– patuliinin massapitoisuus näytteessä, mg/l (laskettu kalibrointiriippuvuuden mukaan, perustuen analyyttisen piikin korkeuteen); V p on näytteen tilavuus, ml; R - mykotoksiinin uuttoaste näytteen valmistusvaiheessa (vastaa 60 prosenttia); M pr on puhdistukseen ja myöhempään kromatografiseen määritykseen käytetyn elintarvikenäytteen massa, g.

Määritettävän kohteen mykotoksiinin massaosuuden mittaustulos esitetään seuraavassa muodossa: X±  mg/kg; klo R\u003d 0,95 ja kirjataan pöytäkirjaan (Liite 1), jossa X i , on patuliinin massapitoisuus näytteessä, mg/kg; R- todennäköisyys;  on absoluuttinen virheraja, joka lasketaan kaavalla

Tuloksen vastaanottamisen jälkeen on tarpeen arvioida konvergenssin operatiivisen ohjauksen standardien arvot, jotka on annettu asianmukaisissa GOST:eissa ohjaus (analyysi) menetelmiä varten.

Tee johtopäätös tutkitun elintarviketuotteen patuliinipitoisuuden noudattamisesta (tai poikkeavuudesta) SanPiN 2.3.2.1078-01:n sallituilla tasoilla.

Kysymyksiä itsehillintää varten

1. Mitkä periaatteet ovat kromatografisten analyysimenetelmien luokittelun taustalla?

2. Mikä on kromatografisen erotuksen ydin? Miten laadullinen tunnistaminen ja kvantitatiivinen analyysi suoritetaan?

3. Mitkä elintarvikkeet sisältävät mykotoksiineja? Mitä mykotoksiineja määritetään elintarvikkeiden koostumuksessa SanPiN:n vaatimusten mukaisesti?

4. Mitä kromatografiamenetelmää käytetään elintarvikkeiden mykotoksiinipitoisuuden määrittämiseen?

5. Mihin spektrofotometrinen tunnistus perustuu? Mitä spektrisuhteet ovat ja mihin niitä käytetään?

6. Miten elintarvikenäytteiden valmistus suoritetaan patuliinipitoisuuden määrittämiseksi HPLC:llä?

7. Mitä operaatioita HPLC-menetelmä sisältää patuliinin määrittämiseksi?

8. Mikä on eluentti ja gradienttieluointi? Mitä eluentteja käytetään patuliinin määrittämisessä HPLC:llä?

9. Miten patuliini tunnistetaan ja määrätään?

10. Miten patuliinin HPLC-määrityksen tarkkuus varmistetaan?

Mykotoksiinien määritysmenetelmät

Nykyaikaisia ​​menetelmiä elintarvikkeiden ja rehujen mykotoksiinipitoisuuksien havaitsemiseksi ja määrittämiseksi ovat seulontamenetelmät, kvantitatiiviset analyyttiset ja biologiset menetelmät.

Seulontamenetelmät ovat nopeita ja käteviä sarjaanalyyseihin, joiden avulla voit nopeasti ja luotettavasti erottaa saastuneita ja kontaminoitumattomia näytteitä. Seulontamenetelmiä ovat ohutkerroskromatografia (TLC-menetelmät), fluoresoiva menetelmä aflatoksiinien saastuttamien jyvien määrittämiseksi.

Kvantitatiivisia analyyttisiä menetelmiä mykotoksiinien määrittämiseksi edustavat kemialliset, radioimmunologiset ja entsyymi-immunomääritysmenetelmät. Nykyään yleisimmät ovat kemialliset menetelmät, jotka sisältävät kaksi vaihetta: eristysvaiheen ja mykotoksiinien kvantitatiivisen määritysvaiheen. Eristysvaihe sisältää uuton (mykotoksiinin erottaminen substraatista) ja puhdistuksen (mykotoksiinin erottaminen yhdisteistä, joilla on samanlaiset fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet). Mykotoksiinien lopullinen erotus ja kvantifiointi suoritetaan käyttämällä erilaisia ​​kromatografisia menetelmiä. Universaali menetelmä kaikentyyppisten mykotoksiinien määrittämiseen on ohutkerroskromatografia (TLC).

Tuote-erästä näytteitä otettaessa päätavoitteena on saada keskimääräinen näyte tai keskimääräinen näyte, joka edustaa koko erää mykotoksiinipitoisuuden suhteen (otetut näytteet kuvaavat koko erän laatua). Tämän tehtävän suorittaminen riippuu mykotoksiinien luonteesta ja jakautumisesta, tuotteen ominaisuuksista (raaka, käsitelty, vapaasti valuva, nestemäinen, tahnamainen jne.), näytteen valmistusmenetelmästä. Esimerkiksi maapähkinöiden saastumisella aflatoksiineilla on selvä heterogeeninen luonne: yksittäisissä maapähkinän jyvissä niiden pitoisuus voi vaihdella milligramman tuhannesosista kymmeniin tai useampaan milligrammaan 1 kg:a kohti, eli eroa 5-6 suuruusluokkaa. Tästä syystä näytteenottovirheen osuus kokonaisanalyysivirheestä maapähkinöiden aflatoksiinien määrittämisessä on pääasiallinen, ja joissakin tapauksissa se voi olla yli 90 %.

Mykotoksiinikontaminaation tasaisuuden näkökulmasta kaikki tuotteet voidaan jakaa kahteen ryhmään: 1) tuotteet, joilla on korkea heterogeenisuus (kuoritut ja kuorimattomat maapähkinät, öljysiemenet, kokonaiset tai karkeat jyvät, pähkinät); 2) tuotteet, joiden saastuminen on tasalaatuista (nesteet: maito, kasviöljyt, mehut, soseet; jauhot, jauheet).

Edustavan keskimääräisen näytteen saamiseksi l:nnen ryhmän tuotteista tulee alkunäytteen olla mahdollisimman suuri (vähintään 2 kg), kun taas keskimääräinen laboratorionäyte on eristettävä jauhetusta (homogenoidusta) keskimääräisestä näytteestä .

Homogeenisista 2. ryhmän tuotteista (hillo, marmeladi, hedelmämehut pienissä tölkkisäiliöissä, kondensoitu maito, kuivat maitotuotteet jne.) näytteitä tulee ottaa keskimääräisen näytteen kokoa vastaava määrä pakkausyksikköjä (100 kpl). -200 g) edellyttäen, että tuote tulee samasta erästä.

Kemialliset menetelmät yksittäisten aflatoksiinien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi perustuvat niiden spesifiseen fluoresenssiin UV-valossa (noin 365 nm), liikkuvuuden eroihin ohutkerroskromatografiassa, niiden absorptio- ja fluoresenssispektrien spesifisyyteen.

Toisin kuin aflatoksiineilla, trikotekeenit eivät imeydy tai fluoresoi spektrin näkyvässä osassa, mikä vaikeuttaa niiden havaitsemista ohutkerroskromatografialla. Samanaikaisesti trikotekeenit voidaan havaita TLC:llä käyttämällä menetelmiä, jotka perustuvat TLC-levyjen käsittelyyn erityisillä reagensseilla, jotka muodostavat värillisiä tai fluoresoivia johdannaisia ​​trikotekeenien kanssa. Esimerkiksi T-2-toksiini levyjä käsiteltäessä; väkevä rikkihappo muodostaa sinistä fluoresoivaa pilkkua UV-valossa.

Välimiesmenettelyt mykotoksiinien kvantitatiivisessa määrittämisessä ovat seuraavat:

‣‣‣ kaasu-nestekromatografia (T-2-toksiinille);

‣‣‣ korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC), jossa käytetään UV-fotometristä ilmaisinta (deoksinivalenolille ja patuliinille);

‣‣‣ HPLC käyttäen fluoresenssidetektoria (aflatoksiineille ja zearalenonille).

Kuvassa Kuvassa 2 on esitetty nykyaikaisen nestekromatografin laite yksinkertaisimmalla tavalla.

Liikkuva faasi säiliöstä 1 syöttösuodattimen 9 kautta syötetään korkeapainepumpulla 2 näytteensyöttöjärjestelmään 3 - manuaaliseen injektoriin tai automaattiseen näytteenottimeen, johon myös näyte ruiskutetaan. Sitten näyte liikkuvan faasin virralla suodattimen 8 kautta tulee esikolonnin kautta erotuskolonniin 4. Sitten kolonnista lähtevän liikkuvan faasin virtaus, joka sisältää erotettavan seoksen komponentit (eluaatti) tulee ilmaisimeen 5 ja poistetaan ylivuotosäiliöön 7. Kun eluaatti virtaa mittaussilmukan läpi, kromatogrammi rekisteröidään ja tiedot siirretään tallentimeen 6 tai tietokoneelle.

Nestekromatografilaite (isokraattinen järjestelmä):

1 - kapasiteetti; 2 - korkeapainejärjestelmä; 3 - manuaalinen injektori tai automaattinen näytteenottolaite; 4 - erotuskolonni; 5 - ilmaisin; b - rekisterinpitäjä tai tietokone; 7 - tyhjennyssäiliö; 8 - suodatin; 9 - tulosuodatin

Kuvassa näkyvä järjestelmä 2 on isokraattinen: liikkuvan faasin koostumus ei muutu kromatografian aikana. Jos kromatografisen analyysin aikana on erittäin tärkeää muuttaa liikkuvan faasin yhden tai useamman komponentin konsentraatiota, käytetään ns. gradienttijärjestelmiä, jotka koostuvat yleensä kahdesta tai useammasta pumpusta. Gradienttieluutiossa kukin liuotin syötetään erillisestä astiasta erityiseen sekoituskammioon magneettisekoittimella, jossa ne sekoitetaan tietyn ohjelman mukaan tietyllä tilavuussuhteella.

Mykotoksiinien analysointiin käytetään useammin gradienttijärjestelmiä, joissa liikkuvana faasina käytetään asetonitriilin vesiliuoksia, joiden pitoisuus muuttuu lineaarisesti ajan myötä.

Kromatografiapylväs on metalliputki, jonka halkaisija on 150-250 mm ja sisähalkaisija 4,6 mm ja joka on täytetty erityisellä silikageelipohjaisella sorbentilla, jossa on oksastettuja hiilivetyradikaaleja. Suojakolonni suojaa kromatografiakolonnia kontaminaatiolta.

UV-fotometrinen ilmaisin on yleisin HPLC-detektorityyppi. Ilmaisimen toimintaperiaate on samanlainen kuin tavanomaisen spektrofotometrin: se rekisteröi liuoksen optisen tiheyden. Erona on, että UV-ilmaisin on virtausanturi, liuoksen sisältävän kyvetin sijaan se käyttää fotometristä kennoa. Eluenttivirta virtaa työkennon läpi, kun taas puhdas liikkuva faasi virtaa vertailukennon läpi. Valonlähde on elohopealamppu, joka tuottaa voimakasta UV-säteilyä. Halutun aallonpituuden omaava valo valitaan sopivilla optisilla suodattimilla, kulkee solujen läpi, absorboituu osittain liikkuvan faasin molekyyleihin ja erotettaviin komponentteihin ja vangitaan fotodetektorilla. Eluaatin valon absorptio (optinen tiheys) tallennetaan jatkuvasti karttatallentimella tai tietokoneella, joka tallentaa kromatogrammin. Seoksen erotetut komponentit (esimerkiksi mykotoksiinit) esitetään kromatogrammissa piikkinä. Piikin sijaintia kromatogrammissa käytetään aineen tunnistamiseen ja piikin pinta-alaa kvantitatiiviseen määritykseen.

Monimutkaisempi laite on fluoresoiva (fluorimetrinen) ilmaisin.
Isännöi osoitteessa ref.rf
Tällainen ilmaisin hyödyntää orgaanisten yhdisteiden, erityisesti aflatoksiinien ja zearalenonin kykyä fluoresoida, kun ne altistetaan UV- tai näkyvälle säteilylle. Fluoresoivassa tunnistimessa on virtauskenno, jossa on kaksi keskenään kohtisuoraa optista kanavaa. Toinen niistä tuottaa jännittävää säteilyä, toinen mahdollistaa fluoresenssin intensiteetin mittaamisen. Aflatoksiinien B 1 ja M 1 analyysin tapauksessa viritysaallonpituus on 360 nm ja emittoidun säteilyn aallonpituus 420 nm.

On huomioitava, että UV-detektoria voidaan käyttää myös aflatoksiinien analysointiin, mutta sen herkkyys on suuruusluokkaa pienempi kuin fluorimetrisen ilmaisimen, joten fluoresenssin havaitseminen on parempi, kun analysoidaan pieniä aflatoksiinipitoisuuksia (MPC:ssä). taso ja alle).

Mykotoksiinien määritysmenetelmät - käsite ja tyypit. Luokan "Mykotoksiinien määritysmenetelmät" luokitus ja ominaisuudet 2017, 2018.

GOST 32835-2014

VÄLINEN STANDARDI

MEHUTUOTTEET

Mykotoksiinien määritys korkean suorituskyvyn nestekromatografia-massaspektrometrialla (HPLC-MS/MS)

Mehutuotteet. Mykotoksiinien määritys korkean suorituskyvyn tandem-nestemassaspektrometrialla (HPLC-MS/MS)

MKS 67.080.01

Esittelypäivä 2016-01-01

Esipuhe

Valtioiden välisen standardoinnin tavoitteet, perusperiaatteet ja perusmenettely on määritelty GOST 1.0-92 "Valtioiden välinen standardointijärjestelmä. Perussäännökset" ja GOST 1.2-2009 "Valtioiden välinen standardointijärjestelmä. Osavaltioiden väliset standardit, säännöt ja suositukset valtioiden välistä standardointia varten. Säännöt kehittämistä, hyväksymistä, hakemista, uusimista ja peruuttamista varten

Tietoja standardista

1 KEHITTÄMÄ liittovaltion osavaltion korkea-asteen koulutuslaitos "Moskovan osavaltion elintarviketuotannon yliopisto" (FGBOU VPO "MGUPP")

2 Teknisten määräysten ja metrologian liittovaltion viraston KÄYTTÖÖNOTTO

3 HYVÄKSYNYT Interstate Council for Standardization, Metrology and Certification (Pöytäkirja 25.6.2014 N 45-2014)

Hyväksyttiin äänesti:

Maan lyhyt nimi MK (ISO 3166) 004-97 mukaan		Kansallisen standardointielimen lyhennetty nimi
Armenia		Armenian tasavallan talousministeriö
Valko-Venäjä		Valko-Venäjän tasavallan valtion standardi
Kirgisia		Kirgisia
Venäjä		Rosstandart

4 Liittovaltion teknisen määräyksen ja metrologian viraston 19. elokuuta 2014 antamalla määräyksellä N 896-st GOST 32835-2014 otettiin käyttöön Venäjän federaation kansallisena standardina 1. tammikuuta 2016 alkaen.

5 Tämä standardi on kehitetty ottaen huomioon seuraavien kansainvälisten asiakirjojen määräykset:

- CODEX STAN 247-2005* Codex Alimentarius Commissionin hedelmämehujen ja -nektareiden yleinen Codex-standardi;
________________
* Pääset jäljempänä tekstissä mainittuihin kansainvälisiin ja ulkomaisiin asiakirjoihin napsauttamalla linkkiä sivustolle http://shop.cntd.ru. - Tietokannan valmistajan huomautus.


- Euroopan unionin komission asetus, 23.2.2006 r. ei. 406/2006/EY näytteenottomenetelmistä ja analyysimenetelmistä elintarvikkeiden mykotoksiinipitoisuuksien virallista valvontaa varten elintarvikkeiden mykotoksiinipitoisuuksien virallista valvontaa varten");

- European Fruit Juice Associationin hedelmä- ja vihannesmehujen laadun ja aitouden arvioinnin AIJN-käytännöt.

6 ENSIMMÄISTÄ ​​KERTAA


Tiedot tämän standardin muutoksista julkaistaan ​​vuosittaisessa tietohakemistossa "Kansalliset standardit" ja muutosten ja muutosten tekstit - kuukausittaisessa tietohakemistossa "Kansalliset standardit". Jos tätä standardia tarkistetaan (korvataan) tai peruutetaan, vastaava ilmoitus julkaistaan ​​kuukausittaisessa tietohakemistossa "Kansalliset standardit". Asiaankuuluvat tiedot, ilmoitukset ja tekstit julkaistaan ​​myös julkisessa tietojärjestelmässä - liittovaltion teknisen määräyksen ja metrologian viraston virallisella verkkosivustolla Internetissä

1 käyttöalue

1 käyttöalue

Tämä standardi koskee mehuja ja muita hedelmistä ja vihanneksista valmistettuja mehutuotteita, sitrushedelmäsoluja lukuun ottamatta, ja siinä vahvistetaan menetelmä mykotoksiinien - patuliinin ja okratoksiini A - määrittämiseksi käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatomassan tandemspektrometriaa mittausalueella patuliinin massapitoisuus 0,1 - 100,0 ug/dm ja okratoksiini A:n 0,1 - 20,0 ug/dm.

Huomautus - Tätä standardia suositellaan käytettäväksi sen soveltamista koskevien lisätietojen hyväksymisen ja keräämisen vuoksi.

2 Normatiiviset viittaukset

Tässä standardissa käytetään normatiivisia viittauksia seuraaviin osavaltioiden välisiin standardeihin:

GOST 12.1.004-91 Työturvallisuusstandardijärjestelmä. Paloturvallisuus. Yleiset vaatimukset

GOST 12.1.007-76 Työturvallisuusstandardijärjestelmä. Luokitus ja yleiset turvallisuusvaatimukset

GOST 12.1.010-76 Työturvallisuusstandardijärjestelmä. Räjähdysturvallisuus. Yleiset vaatimukset

GOST 12.1.019-79 Työturvallisuusstandardijärjestelmä. Sähköturvallisuus. Yleiset vaatimukset ja suojatyyppien nimikkeistö

GOST 61-75 reagenssit. Etikkahappo. Tekniset tiedot

GOST OIML R 76-1-2011 Valtion järjestelmä mittausten yhtenäisyyden varmistamiseksi. Ei-automaattiset vaa'at. Osa 1. Metrologiset ja tekniset vaatimukset. Testit

GOST 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) Laboratoriolasien mittaus. Sylinterit, dekantterilasit, pullot, koeputket. Yleiset tiedot

GOST ISO 3696-2013 Vesi laboratorioanalyysiin. Tekniset vaatimukset ja valvontamenetelmät

GOST ISO 5725-1-2003 Mittausmenetelmien ja -tulosten tarkkuus (oikeus ja tarkkuus). Osa 1. Perussäännökset ja määritelmät

GOST ISO 5725-2-2003 Mittausmenetelmien ja -tulosten tarkkuus (oikeus ja tarkkuus). Osa 2: Perusmenetelmä standardimittausmenetelmän toistettavuuden ja toistettavuuden määrittämiseksi

GOST 5789-78 Reagenssit. Tolueeni. Tekniset tiedot

GOST 16317-87 Kotitalouksien sähköiset kylmälaitteet. Yleiset tiedot

GOST 20015-88 Kloroformi. Tekniset tiedot

GOST 25336-82 Lasitavarat ja laboratoriolaitteet. Tyypit. Pääparametrit ja mitat

GOST 26313-84 Jalostetut hedelmä- ja vihannestuotteet. Hyväksymissäännöt, näytteenottomenetelmät

GOST 26671-85 Jalostetut tuotteet hedelmistä ja vihanneksista, säilykelihasta ja lihasta ja vihanneksista. Näytteen valmistelu laboratorioanalyysiä varten

GOST 29030-91 Hedelmien ja vihannesten jalostustuotteet. Pyknometrinen menetelmä liukoisten kiintoaineiden suhteellisen tiheyden ja pitoisuuden määrittämiseksi

GOST 29227-91 (ISO 835/1-81) Laboratoriolasiesineet. Pipetit valmistuivat. Osa 1. Yleiset vaatimukset

GOST ISO/IEC 17025-2009 Testaus- ja kalibrointilaboratorioiden pätevyyden yleiset vaatimukset

GOST 32689.1-2014 Kasviperäiset elintarvikkeet. Monimenetelmät torjunta-ainejäämien kaasukromatografiseen määritykseen. Osa 1. Yleiset määräykset

GOST 32689.2-2014 Kasviperäiset elintarvikkeet. Monimenetelmät torjunta-ainejäämien kaasukromatografiseen määritykseen. Osa 2: Uutto- ja puhdistusmenetelmät

GOST 32689.3-2014 Kasviperäiset elintarvikkeet. Monimenetelmät torjunta-ainejäämien kaasukromatografiseen määritykseen. Osa 3. Tulosten määrittäminen ja validointi

Huomautus - Tätä standardia käytettäessä on suositeltavaa tarkistaa vertailustandardien pätevyys julkisessa tietojärjestelmässä - liittovaltion teknisten määräysten ja metrologian viraston virallisella verkkosivustolla Internetissä tai vuosittaisen tietohakemiston "Kansalliset standardit" mukaan. , joka julkaistiin kuluvan vuoden tammikuun 1. päivästä, ja kuluvan vuoden kuukausittaisen "Kansalliset standardit" -tietoindeksin numeroista. Jos viitestandardi korvataan (muokattu), tätä standardia käytettäessä sinun tulee ohjata korvaava (muokattu) standardi. Jos viitattu standardi peruutetaan ilman korvausta, säännöstä, jossa siihen viitataan, sovelletaan siltä osin kuin se ei vaikuta tähän viittaukseen.

3 Lyhenteet

HPLC-MS/MS - korkean suorituskyvyn tandem-nestekromatografia-massaspektrometria;

OTA, okratoksiini A;

PAT - patuliini;

ESI- sputterionisaatio sähkökentässä ( Sähkösumutusionisaatio);

IARC- Kansainvälinen syöväntutkimuslaitos;

LOD- havaitsemisraja;

LOQ- määrällisen määritysrajan;

SRM- komponenttien tunnistaminen selektiivisten reaktioiden ohjauksessa ( Valitun reaktion valvonta).

4 Menetelmän ydin

Menetelmän ydin on PAT- ja OTA-mykotoksiinien esiuutto asetonitriilillä vedettömän magnesiumsulfaatin läsnä ollessa, konsentraatio, uudelleenliuotus asetonitriiliin ja mykotoksiinien massapitoisuuden kvantitatiivinen määrittäminen käyttäen HPLC-MS/MS-suihkutusionisaatiota. sähkökentässä ja komponenttien tunnistaminen selektiivisten reaktioiden ohjaustilassa.

5 Mittauslaitteet, apulaitteet, vertailumateriaalit, reagenssit ja lasitavarat

Analyyttinen HPLC-MS/MS*-järjestelmä, jossa on kolmen kvadrupolin massadetektori mittauksiin massa-alueella 10-3000 atomimassayksikköä (a.m.u.), massamittaustarkkuus vähintään 0,1 a.m.u, ionisaatiosputterointi sähkökentässä, kyky työskennellä valittujen reaktioiden ohjauksessa ja lapsi- ja vanhempi-ionien skannauksessa, signaali-kohinasuhde vähintään 1000:1. Analyysijärjestelmään tulisi kuulua HPLC-moduuli, joka koostuu binääripumpusta sekoittimella, kromatografiakolonnin termostaatista, joka tarjoaa jopa 50 °C:n lämmityslämpötilan, ja kromatografiakolonnista, jossa on käänteisfaasisorbentti, jonka raekoko on 5 μm C. , 150 mm pitkä ja 3 mm sisähalkaisija. Käytettävän järjestelmän on varmistettava mykotoksiinien havaitseminen alueella 0,1-100,0 µg/dm.
________________
* Katso liite A saadaksesi lisätietoja suositelluista LC/MS/MS-järjestelmistä.


Spektrofotometri, jonka mittausalue mahdollistaa testauksen aallonpituudella 250-400 nm, jonka optisen tiheyden mittauksissa sallitaan enintään 0,1 %:n absoluuttinen virhe.

GOST OIML R 76-1:n mukaiset vaa'at, jotka tarjoavat punnitustarkkuuden yhden punnituksen sallitun absoluuttisen virheen rajalla, joka on enintään ±0,01 mg.

Kylpy ultraääni.

Sentrifugoi roottorin nopeudella 4000-5000 rpm koeputkille, joiden kapasiteetti on 50 ml.

Sentrifugoi roottorin nopeudella 10000-12000 rpm Eppendorf-tyyppisille koeputkille, joiden tilavuus on 1,5-2,0 ml.

Kuivauskaappi ylläpitää lämpötilaa jopa 200°С.

Kotitalouksien jääkaappi GOST 16317:n mukaan.

Shaker sekoittamista varten.

Nestenäytteiden annostelulaitteet, joiden kapasiteetti on vakio tai muuttuva 20-1000 mm ja suhteellinen virhe annostettaessa todellista tilavuutta enintään 2,5%.

Mikrosuodatin - ruiskussa oleva suutin (regeneroitua selluloosaa, halkaisija 13 mm, huokoskoko 0,2-0,4 mikronia).

Kvartsikyvetit, joiden työpituus on 1 cm.

Vertailunäytteinä käytettävät PAT- ja OTA-mykotoksiinit, joiden pääaineen pitoisuus on vähintään 98 %.

GOST 61:n mukainen jääetikkahappo, analyyttinen laatu.

Asetonitriili gradientti-HPLC:lle.

Metanoli gradientti-HPLC:lle.

Magnesiumsulfaatti vedetön, kemiallisesti puhdas

Kalsiumkloridi vedetön, rakeinen, kemiallisesti puhdas

Kloroformi GOST 20015:n mukaan, kemiallisesti puhdas

Tolueeni standardin GOST 5789 mukaan, kemiallisesti puhdas

Etyylialkoholi, absoluuttinen.

Vesi laboratorioanalyysiin, puhtaus 1 GOST ISO 3696 mukaan.

Toisen tarkkuusluokan asteikolla valmistetut pipetit, joiden kapasiteetti on 1, 2, 5, 10 cm 2 2. tarkkuusluokan GOST 29227 mukaan.

2. tarkkuusluokan mittapullot, joiden tilavuus on 5, 10, 25, 50, 100 ja 1000 cm 2 tai 2a GOST 1770:n mukaan.

Teräväpohjaiset pullot, joiden tilavuus on 10,25 cm3.

Eppendorf-tyyppinen sentrifugiputki, jonka tilavuus on 1,5-2,0 ml.

Mikrokoeputki, jonka kapasiteetti on 100-400 mm.

2. tarkkuusluokan mittasylinterit, joiden tilavuus on 25, 50, 250 cm3, minkä tahansa mallin GOST 1770:n mukaisesti.

Sentrifugiputki kierrekorkilla, 50 cm

Posliinikuppi, jonka halkaisija on 125-150 mm.

Laboratorioeksikkaattori, jonka kapasiteetti on 3 dm.

Suppilolaboratorio GOST 25336:n mukaisesti.

Tasapohjaiset pullot, joiden tilavuus on 50, 100, 250 cm3 GOST 25336:n mukaan.

Kemialliset lasit, joiden tilavuus on 10, 20, 50, 100 ja 200 cm3 GOST 25336:n mukaisesti.

On sallittua käyttää muita mittauslaitteita, apulaitteita, välineitä, jotka eivät ole metrologisilta ja teknisiltä ominaisuuksiltaan huonompia kuin edellä ja jotka tarjoavat tarvittavan mittaustarkkuuden, sekä standardinäytteitä, reagensseja ja materiaaleja, joiden laatu ei ole huonompi kuin edellä .

6 Näytteenotto

Näytteenotto - GOST 26313:n mukaan. Näytteiden valmistelu ja varastointi - GOST 26671, GOST 32689.1, GOST 32689.2 ja GOST 32689.3 mukaan.

7 Valmistautuminen testaukseen

7.1 Yleiset vaatimukset

Ennen testausta suoritetaan laboratoriolasien alustava valmistelu sekä reagenssien ja apumateriaalien laadunvalvonta GOST 32689.1, GOST 32689.2 ja GOST 32689.3 vaatimusten mukaisesti.

7.2 Apuliuosten valmistus

7.2.1 Liikkuvan vaiheen A valmistelu

Pipetoidaan 1 ml jääetikkaa, 100 ml metanolia 1000 ml:n mittapulloon, jossa on tiiviisti suljettu lasihios tai fluoroplastinen tulppa, ja täytetään kaksi kertaa tislatulla vedellä merkkiin asti. Seos sekoitetaan perusteellisesti.

Liikkuvan vaiheen A säilyvyys huoneenlämmössä - enintään yksi kuukausi.

7.2.2 Liikkuvan faasin B valmistelu

1000 ml:n mittapulloon, jossa on tiiviisti suljettu lasihios tai fluoroplastinen tulppa, pipetillä laitetaan 1 ml jääetikkaa ja lisätään merkkiin metanolilla. Seos sekoitetaan perusteellisesti.

Liikkuvan faasin B säilyvyys huoneenlämmössä - enintään yksi kuukausi.

HUOMAA Liikkuva faasi ei saa joutua kosketuksiin kumi- ja polymeerimateriaalien kanssa [lukuun ottamatta polytetrafluorieteeniä (PTFE)].

7.2.3 Liuottimen valmistus 1

Sekoita sopivassa astiassa 99 tilavuusosaa tolueenia ja yksi tilavuusosa jääetikkaa. Seos sekoitetaan perusteellisesti.

Liuottimen 1 säilyvyys huoneenlämmössä on enintään 6 kuukautta.

7.3 Magnesiumsulfaatin valmistus

Uutossa sorbenttina käytetty vedetön magnesiumsulfaatti on kuivattava jopa viimeisen käyttöpäivän sisällä imeytyneen kosteuden poistamiseksi ilmasta. Sorbenttia kalsinoidaan lämpötilassa 180-200 °C 6-10 tuntia ja säilytetään eksikkaattorissa vedettömän kalsiumkloridin päällä. Reagenssin soveltuvuuden kriteerinä on se, ettei liuosta lämmitetä ylimääräistä vesikerrosta, uuttovaihe suoritetaan 30°C - 40°C lämpötilaan ja 2-3 minuutin kuluttua reaktiomassa on sekoitettiin.

7.4 Mykotoksiinin kantaliuosten valmistus

7.4.1 PAT-liuosten valmistus

7.4.1.1 PAT-kantaliuoksen valmistus, massapitoisuus 200 µg/cm

Otetaan 2,0 mg puhdasta kiteistä PAT:ta, joka on punnittu 0,01 mg:n tarkkuudella, liuotetaan 10 ml:n mittapullossa pieneen määrään kloroformia ja lisätään sitten liuoksen tilavuus merkkiin kloroformilla.

Alkuperäisen PAT-liuoksen säilyvyys 0°C:n lämpötilassa lasimittapullossa, jossa on hiottu tulppa tiukasti alumiinifolioon käärittynä, on enintään 1 kuukausi.

7.4.1.2 PAT-liuoksen valmistus, massapitoisuus 20 µg/cm

Siirretään 1 ml saatua PAT-kantaliuosta (ks. 7.4.1.1) 10 ml:n mittapulloon ja laimennetaan merkkiin kloroformilla. PAT:n tarkan massapitoisuuden määrittämiseksi liuoksessa otetaan 5,0 ml saatua PAT-standardiliuosta ja siirretään säiliöön, jonka tilavuus on noin 15 cm, minkä jälkeen kloroformi poistetaan typpihuuhtelulla, kunnes saadaan kuivaa ainetta. Välittömästi kuiva-aineen saamisen jälkeen säiliöön lisätään 5,0 ml absoluuttista etanolia. Liuota PAT kokonaan. Saatu PAT-liuos syötetään kvartsikyvettiin, jonka optisen polun pituus on 1 cm, minkä jälkeen liuoksen spektri tallennetaan spektrofotometrillä aallonpituusalueella 250-350 nm käyttäen vertailukyvetissä olevaa absoluuttista etanolia kontrollina. .

PAT:n massapitoisuus liuoksessa, µg/cm, lasketaan kaavalla

missä on spektrin optisen tiheyden maksimiarvo (aallonpituus noin 275 nm), yksikköä. OP;

- PAT:n molekyylipaino, joka on 153,1 g/mol;

- muuntokerroin;


- optisen absorption (ekstinktio) moolikerroin, joka on 14600, m/mol.

7.4.1.3 100 µg/cm PAT-liuoksen valmistaminen

5 ml PAT:n alkuliuosta kloroformissa, jonka massapitoisuus on 200 µg/ml (ks. 7.4.1.1), siirretään 10 ml:n mittapulloon ja konsentroidaan kuivaksi jäännökseksi huoneenlämpötilassa typellä ja liuotetaan välittömästi uudelleen asetonitriiliin, jolloin se saatetaan pullossa olevaan tilavuuteen etiketeiksi.

7.4.1.4 Kohtien 7.4.1.2 ja 7.4.1.3 mukaisten PAT-liuosten säilyvyys 0°C:ssa hiotulla tulpalla varustetussa lasimittapullossa, joka on tiiviisti kääritty alumiinifolioon, on enintään 24 tuntia.

Ennen käyttöä liuosten lämpötila saatetaan huoneenlämpöön (alumiinifoliota ei saa poistaa mittapullosta ennen kuin sisältö on huoneenlämpöinen). PAT:n tuhoutumisen vuoksi vertailunäytteitä ei saa säilyttää ohuen kuiva-ainekalvon muodossa, joka on saatu liuottimen poistamisen jälkeen.

7.4.2 OTA-kantaliuoksen valmistus

7.4.2.1 20 µg/ml OTA-varastoliuoksen valmistaminen

Liuotetaan 2,0 mg puhdasta kiteistä OTA:ta, joka on punnittu 0,01 mg:n tarkkuudella, 25 ml:n dekantterilasiin liuottimen 1 kanssa (katso 7.2.3) ja siirretään kvantitatiivisesti 100 ml:n mittapulloon ja laimennetaan liuottimella 1 merkkiin.

OTA:n tarkan massapitoisuuden määrittämiseksi liuoksessa saatu OTA-alkuliuos laitetaan kvartsikyvettiin, jonka optisen polun pituus on 1 cm, minkä jälkeen liuoksen spektri tallennetaan spektrofotometriin aallonpituusalueella 300 - 370 nm käyttäen liuotinta 1 vertailukyvettinä.

OTA:n massapitoisuus alkuperäisessä liuoksessa, μg/cm, lasketaan kaavalla

missä on spektrin optisen tiheyden maksimiarvo (aallonpituus noin 333 nm), yksikköä. OP;

- OTA:n molekyylipaino, joka on 402,7 g/mol;

- muuntokerroin;

- lisäyksen A mukaisesti määritetty korjauskerroin;

- optisen absorption (ekstinktio) moolikerroin, joka on 544, m/mol.

Alkuperäisen OTA-liuoksen säilyvyys miinus 18°C:n lämpötilassa lasimittapullossa, jossa on hiottu tulppa tiukasti alumiinifolioon käärittynä, on enintään neljä vuotta.

7.4.2.2 5 µg/ml OTA-liuoksen valmistaminen

Poistetaan 2,5 ml OTA-kantaliuosta (7.4.2.1), siirretään 10 ml:n mittapulloon ja laimennetaan liuottimella 1 (7.2.3) merkkiin asti.

OTA-liuoksen säilyvyys 4°C:n lämpötilassa lasimittapullossa, jossa on hiottu tulppa tiukasti alumiinifolioon käärittynä, on enintään 24 tuntia.

Ennen käyttöä liuoksen lämpötila saatetaan huoneenlämpötilaan (alumiinifoliota ei saa poistaa mittapullosta ennen kuin sisältö saavuttaa huoneenlämpötilan) -.

7.5 PAT- ja OTA-kalibrointiliuosten valmistus

PAT- ja OTA-kalibrointiliuokset valmistetaan sekoittamalla tiettyjä tilavuuksia niiden kantaliuoksia (ks. 7.4.1.1 ja 7.4.2.1) kirkastetun omenamehun kanssa, joka ei sisällä määritettäviä analyyttejä.

7.5.1 PAT-kalibrointiliuosten valmistus

7.5.1.1 PAT-massakonsentraatiolla 1000 ng/cm olevan väliliuoksen valmistaminen (liuos n-1)

1 ml PAT-liuosta (katso 7.4.1.3) tai 1 ml PAT-koostumuksen standardinäytettä, jonka PAT:n massapitoisuus on 100 µg/cm, siirretään mittapulloon, jonka tilavuus on 100 ml ja tilavuus liuos säädetään merkkiin asetonitriilillä.

7.5.1.2 PAT-massakonsentraatiolla 10 ng/cm olevan väliliuoksen valmistaminen (liuos n-2)

Siirretään 1 ml liuosta -1 (ks. 7.5.1.1) 100 ml:n mittapulloon ja laimennetaan merkkiin asetonitriilillä.

7.5.1.3 PAT-kalibrointiliuosten valmistus

Valitaan taulukon 1 mukaisesti tietyt määrät väliliuoksia n-1 ja n-2 (katso 7.5.1.1 ja 7.5.1.2) ja annostele 10 ml:n mittapulloihin.


Taulukko 1 - Liuosten määrät n-1 ja n-2 PAT-kalibrointiliuosten valmistukseen

Indikaattorin nimi	Kalibrointiratkaisut
Liuoksen tilavuus n-2 cm
Liuoksen tilavuus n-1 cm
Injektoidun PAT:n määrä, ng
PAT:n massapitoisuus liuoksessa, ng/cm

7.5.2 OTA-kalibrointiliuosten valmistus

7.5.2.1 200 ng/ml OTA-väliliuoksen (liuos) valmistaminen A-1)

Konsentroidaan 1 ml 5 µg/ml OTA-liuosta (katso 7.4.2.2) kuivaksi typpivirtauksen alla huoneenlämpötilassa ja siirretään välittömästi asetonitriilillä 25 ml:n mittapulloon.

7.5.2.2 10 ng/ml OTA-väliliuoksen (liuos) valmistaminen MUTTA-2)

0,5 ml OTA-väliliuosta MUTTA-1 (katso 7.5.2.1) siirretään 10 ml:n mittapulloon ja laimennetaan merkkiin asti asetonitriilillä.

7.5.2.3 OTA-kalibrointiliuosten valmistus

Valitaan taulukon 2 mukaisesti tietyt määrät väliliuoksia MUTTA-1 ja MUTTA-2 (katso 7.5.2.1 ja 7.5.2.2) ja annostele 10 ml:n mittapulloihin.


Taulukko 2 - Liuosten määrät MUTTA-1 ja MUTTA-2 OTA-kalibrointiliuosten valmistukseen

Indikaattorin nimi	Kalibrointiratkaisut
Liuoksen tilavuus MUTTA-2 cm
Liuoksen tilavuus MUTTA-1 cm
Annetun OTA:n määrä, ng
OTA:n massapitoisuus liuoksessa, ng/cm

Lisää pulloissa olevan liuoksen tilavuus merkkiin kirkastetulla omenamehulla (tai muulla suodatetulla mehulla).

HPLC-MS/MS-testausta varten järjestelmään ruiskutetaan 10 mm PAT- ja OTA-kalibrointiliuoksia, jotka on valmistettu kohtien 7.5.1.3 ja 7.5.2.3 mukaisesti ja kalibroitu kohdan 7.7 mukaisesti ottaen huomioon kohdan 8.3.1 olosuhteet.

Kalibrointiliuoksen säilyvyys 0°C - 4°C lämpötilassa hiotulla tulpalla varustetussa mittapullossa on enintään 24 tuntia.

7.6 LC/MS/MS-järjestelmän valmistelu

HPLC-MS/MS-järjestelmän valmistelu mittauksia varten suoritetaan käyttöohjeen (ohjeen) ja liitteessä B olevien tietojen mukaisesti.

Massaspektrometrin toimintatiloja määritettäessä on suositeltavaa käyttää liitteessä B olevia mykotoksiinien määrittämiseen MS/MS-parametreja.

Tässä tapauksessa seuraavat ehdot on täytettävä:

- ympäristön lämpötila 20°С - 25°С;

- ilmanpaine 84 - 106 kPa;

- verkkojännite (220±10) V;

- verkkovirran taajuus 49 - 51 Hz;

- ilman suhteellinen kosteus 40 % - 80 %.

7.7 HPLC-MS/MS-järjestelmän kalibrointi

Järjestelmän kalibrointi mehuissa olevien mykotoksiiniliuoksilla kohdan 7.5 mukaisesti suoritetaan HPLC-MS/MS-järjestelmän käyttöohjeen (ohjeen) mukaisesti ja ottaen huomioon kohdan 8.3.1 mukaiset olosuhteet kerran kuukaudessa. PAT- ja OTA-huippujen pinta-alat määritetään kromatogrammeilla ja kalibrointiriippuvuus määritetään piikkien pinta-alasta 7.5:n mukaisella pitoisuusalueella. Laske korrelaatiokerroin ja mykotoksiinien massapitoisuuden laskettujen arvojen poikkeama kussakin kalibrointipisteessä todellisesta arvosta kalibrointiliuosten valmistusmenettelyn mukaisesti (katso 7.5). Kalibrointi katsotaan hyväksyttäväksi, jos korrelaatiokerroin on vähintään 0,999 (PAT) ja 0,965 (OTA) ja massapitoisuuden lasketun arvon suhteellinen poikkeama todellisesta arvosta on enintään ±10 %.

Suhteellisen poikkeaman sijasta kalibrointiominaisuuden hyväksyttävyyttä voidaan arvioida suhteellisella standardipoikkeamalla, joka ei saa ylittää 5 %.

8 Testaus

8.1 Poisto

10 ml () alustavasti huolellisesti sekoitettuja mehutuotteita laitetaan kierrekorkiseen sentrifugointiputkeen, jonka tilavuus on 50 ml. Koeputkeen lisätään 20 ml asetonitriiliä ja 15 g vedetöntä magnesiumsulfaattia. Seosta sekoitetaan intensiivisesti kolmesta viiteen minuuttia käsin tai ravistimella. Sekoituksen jälkeen saatua uutetta sentrifugoidaan 10 minuuttia nopeudella 4000-5000 rpm huoneenlämpötilassa tai 5 minuuttia sentrifugin läsnä ollessa jäähdyttämällä 5 °C:n lämpötilassa. Mittaa uutteen kokonaistilavuus sentrifugoinnin jälkeen (). 18-19 cm () uutteesta otettuna pipetillä tai annostelulaitteella siirretään teräväpohjaiseen pulloon, jonka tilavuus on 25 cm. 1 cm () asetonitriiliä.

Jos astian seinillä on liukenematon karamellikalvo, se tuhoutuu ultraäänihauteessa 3–5 minuutin ajan. Liuos siirretään Eppendorf-tyyppiseen koeputkeen, jonka tilavuus on 1,5-2,0 cm3, ja sentrifugoidaan nopeudella 10 000-12 000 rpm 3-5 minuuttia. Ylempi kerros otetaan ja suodatetaan mikrosuodattimen läpi, jonka huokoskoko on 0,2-0,4 µm, suoraan mikroputkeen, jonka kapasiteetti on 100-400 mm. HPLC-MS/MS-testiä varten järjestelmään ruiskutetaan 10 mm valmistettua näytettä.

8.2 Näytteen valmistelu tiivistetyistä tuotteista

Tiivistetyt mehut (sose) liuotetaan vedellä liukenevien kiintoaineiden vähimmäismäärään, joka on määrätty tietyntyyppisille mehutuotteille. Tiivistetyt mehutuotteet, joille ei ole säädetty liukoisten kiintoaineiden vähimmäistasoja, palautetaan kaksi kertaa tislatulla vedellä 11,2 %:n liukoisen kiintoaineen pitoisuuteen. Liukoisten kiintoaineiden pitoisuutta valvotaan GOST 29030:n mukaisesti.

Rekonstituoitujen näytteiden uuttaminen suoritetaan kohdan 8.1 mukaisesti.

8.3 Mittausten ottaminen

8.3.1 Yleiset ehdot

Kohdan 8.1 mukaisesti valmistetut näytteet ja kalibrointiliuokset ruiskutetaan valitussa järjestyksessä. Yleisin menetelmä on, kun kalibrointiliuosten injektio alkaa ja lopettaa näyteinjektioiden sarjan.

HPLC-MS/MS-järjestelmän on oltava asetettuna SRM siirtymillä, jotka mahdollistavat analysoitujen mykotoksiinien selektiivisen havaitsemisen. Retentioajat ja piikkien pinta-alat määritetään käyttämällä HPLC-MS/MS-järjestelmään liitettyä analyysiohjelmistoa analyysin tulosten tallentamiseen ja laskemiseen. Esimerkkejä HPLC/MS/MS-järjestelmistä, erotusolosuhteista ja massaspektrometrisestä detektiosta on lisäyksessä B.

Näytteet testataan toistettavuusolosuhteissa kahdella rinnakkaismäärityksellä standardien GOST ISO 5725-1 (alakohta 3.14) ja GOST ISO 5725-2 mukaisesti.

8.3.2 Mykotoksiinien tunnistaminen

Mykotoksiinien tunnistamiseksi näyteliuoksista saatuja retentioaikoja verrataan vastaavien kalibrointiliuosten mykotoksiinien retentioaikoihin. Mykotoksiinien läsnäolon varmistamiseksi verrataan ensimmäisen ja toisen signaalin voimakkuuksien suhdetta. m/z-siirtymä kalibrointiliuosten mykotoksiinisignaalien voimakkuuksien suhteen.

Yhden mykotoksiinin huippujen suhde ei saisi poiketa enempää kuin 20 % odotetusta signaalin intensiteettien suhteesta.

9 Testitulosten käsittely ja esittäminen

9.1 Kvantifiointi

Mykotoksiinien kvantifiointi valmistetun uutteen injektoidussa tilavuudessa (katso 8.1) suoritetaan vertaamalla mykotoksiinipiikin pinta-alaa (tai korkeutta) tämän mykotoksiinin vastaavaan kalibrointiominaisuuteen.

Mykotoksiinien massapitoisuus testatuissa tuotteissa, µg/dm, lasketaan kaavalla

missä on muuntokerroin kuutiosenttimetreistä kuutiosenttimetreiksi;

- mykotoksiinin pitoisuus uutteen tilavuudessa 10 mm, injektoituna HPLC-MS/MS-järjestelmään, määritettynä kalibrointiriippuvuudella, ng;

on asetonitriilin tilavuus, johon uute liuotettiin uudelleen väkevöinnin jälkeen, cm;

- uutteen kokonaistilavuus, josta tilavuus otetaan konsentrointia varten, cm;

- kromatografiin syötetty näytetilavuus (=10 mm), mm;

- testattavaksi otetun mehutuotteen näytteen tilavuus, cm;

on väkevöintiin valitun uutteen tilavuus, katso

Tiivistettyjen mehutuotteiden mykotoksiinien määrää laskettaessa otetaan huomioon vedellä laimennusaste kohdan 8.2 mukaisesti.

Mittaustulos otetaan kolmen rinnakkaisen määrityksen tulosten aritmeettiseksi keskiarvoksi, jos hyväksymisehto täyttyy

missä , ovat maksimi- ja vähimmäisarvot saaduista kolmesta rinnakkaismäärityksen tuloksesta, µg/dm;

, , - kolmen rinnakkaisen määrityksen tulokset, µg/dm;

- kriittisen alueen arvo, %.

Samassa laboratoriossa suoritetun kolmen rinnakkaisen määrityksen (prosenttiosuutena keskiarvosta) välinen ero ei saa ylittää toistettavuuden (konvergenssi) rajaa, joka on 3,6· todennäköisyydellä = 0,95. Jos tämä ehto täyttyy, lopullinen mittaustulos on kolmen rinnakkaisen määrityksen aritmeettinen keskiarvo pyöristettynä ylöspäin kolmanteen desimaaliin.

Mittaustulokset kirjataan GOST ISO / IEC 17025 -standardin mukaiseen protokollaan.

9.2 Jos saatu tulos osoittaa, että mykotoksiinipitoisuus ylittää kalibrointiriippuvuusalueen ylärajan, valmistetaan uusi näyte lisäämällä sen laimennusta vedellä ja mitataan uudelleen.

10 Metrologiset ominaisuudet

PAT:n ja OTA:n menetelmän metrologiset ominaisuudet vastaavat taulukossa 3 annettuja ehtoja.


Taulukko 3 - HPLC-MS/MS-menetelmän tarkkuudet

Mittausalue, µg/dm	Toistettavuuden suhteellinen keskihajonta, %	Toistettavuuden suhteellinen keskihajonta, %
määritettäessä PAT (ei enää)
määritettäessä OTA (ei enää)

PAT:n ja OTA:n havaitsemisrajat mehutuotteiden näytteistä ovat: LOD- 0,03 mcg/dm, LOQ- 0,1 mcg / dm.

11 Mittaustulosten laadunvalvonta

Mittaustulosten laadunvalvonta laboratoriossa käsittää mittaustulosten pysyvyyden tarkkailun käyttämällä välitarkkuuden keskihajonnan stabiilisuustarkistusta. Vakavuustesti suoritetaan Shewhartin kontrollikorteilla. Tehtyjen mittausten tulosten pysyvyyden seurannan tiheys on säädetty laatujärjestelmän sisäisissä asiakirjoissa. Epätyydyttävissä valvontatuloksissa, esimerkiksi toimintarajan ylittyessä tai varoitusraja ylittäessä säännöllisesti, selvitetään näiden poikkeamien syyt, mukaan lukien reagenssien vaihtaminen, käyttäjän työn tarkastaminen.
GOST 12.1.007.

HUOMIO! Mykotoksiinien kanssa työskennellessä tulee ottaa huomioon, että PAT:lla ja OTA:lla on vahvoja toksisia ominaisuuksia, joilla on selkeitä nefrotoksisia, immunotoksisia, teratogeenisiä ja genotoksisia vaikutuksia. Luokituksen mukaan IARC OTA viittaa ihmisille mahdollisesti vaarallisiin syöpää aiheuttaviin aineisiin (ryhmä 2B). Mykotoksiinien kanssa työskenneltäessä on noudatettava suurempia turvatoimia. Laboratoriohenkilöstön tulee käyttää suojavaatetusta, mukaan lukien kasvosuojus, käsineet ja suojalasit. Kaikki mykotoksiinien käsittelyt suoritetaan vetokaapissa. Työn päätyttyä käytetyt laboratoriolasit ja -jätteet dekontaminoidaan.

Liite A (pakollinen). Spektrofotometrin tarkastus ja korjauskertoimen CF määritys standardiliuosten mykotoksiinien massapitoisuuksien laskemiseksi

Liite A
(pakollinen)

Spektrofotometrin tarkastus ja korjauskertoimen määrittäminen standardiliuosten mykotoksiinien massapitoisuuksien laskemiseksi

A.1 Mykotoksiinien massapitoisuuksien määrittämiseksi kantaliuoksissa (katso 7.4.1.1 ja 7.4.2.1) käytä spektrofotometriä, joka soveltuu liuosten optisen tiheyden mittaamiseen kvartsikyvetissä, jonka optisen reitin pituus on 1 cm aallonpituusalueella. 200 nm - 400 nm.

Spektrofotometrin kalibrointi suoritetaan seuraavasti.

Mittaa kolmen kaliumdikromaatin (KCrO) liuoksen optinen tiheys rikkihapossa (HSO) - 0,25; 0,125 ja 0,0625 mmol / dm maksimiabsorptiopisteessä (aallonpituus noin 350 nm), käyttämällä kontrollina rikkihappoliuosta (HSO), jonka pitoisuus on 0,009 mmol / dm.

Sitten lasketaan optisen tiheyden moolikertoimen arvo, m/mol, kullekin kaliumdikromaattipitoisuudelle kaavan mukaisesti

missä on rikkihapossa olevan kaliumdikromaattiliuoksen optisen tiheyden mitattu arvo vastaavalle pitoisuudelle, yksikköä. OP;

- kaliumdikromaattiliuoksen pitoisuus rikkihapossa, mmol/dm.

Jos kolmen mitatun arvon välinen ero on optisen tiheyden mittaustarkkuuden taatun alueen ulkopuolella, kalibrointimenettely tai laitteisto tulee tarkistaa. Laske aritmeettinen keskiarvo.

Määritä korjauskerroin (mitaton arvo) tietylle laitteelle (spektrofotometri ja kyvetti) kaavan mukaan

missä on kaliumdikromaattiliuosten (KCrO) molaarisen optisen tiheyskertoimen tunnusarvo, m/mol;

- optisen tiheyden moolikerroin, laskettuna kaavan (A.1) mukaisesti, m/mol.

Jos tuloksena saatu korjauskertoimen arvo on alle 0,95 tai suurempi kuin 1,05, kalibrointimenettely tai laitteisto on tarkistettava poikkeamien poistamiseksi (samaa kyvettisarjaa käytetään kalibroinnissa ja puhtaudessa) -.

Liite B (informatiivinen). Esimerkkejä HPLC-MS/MS-järjestelmistä mehujen ja muiden mehutuotteiden mykotoksiinien määrittämiseen*

Liite B
(viite)

________________
* Nämä esimerkit ovat suositeltavia, ja ne on annettu tämän kansainvälisen standardin käyttäjien avuksi.

B.1 HPLC-MS/MS-järjestelmä nro 1

Laitteistoalusta: Varian 320-MS LC/MS/MS.

Ioninen