Mükotoksiinide määramise meetodid. Laboratoorsed meetodid mükotoksikooside diagnoosimiseks. Mükotoksiinid ja nende määramise meetodid
Pärast kutsikate sündi algab emase ja tema omanike jaoks vastutusrikas periood, mil tuleb hoolitseda mitte ainult emase, vaid ka vastsündinud beebide toitmise ja tervise eest. Pärast kutsikate sündi võib emasel esimesel või kahel päeval olla halb isu, seedehäired, eriti kui ta sõi palju pärastsünnitust.
Pidage meeles, et sel perioodil ei tohiks te antibiootikume kasutada - see mõjutab imikute tervist negatiivselt. Proovige läbi saada ohutumate ravimitega (nt ravimtaimed, probiootikumid, maoloputus, aktiivsüsi ja eelistatavalt lignitiin). Väga häid tulemusi annab sel juhul Heeli absoluutselt kahjutute homöopaatiliste preparaatide kasutamine ja veterinaarseid pole vaja otsida, “inimlikud” ei tööta halvemini. Proovige ühte või kahte nahaalust Echinacea compositum'i, Nux vomica, Berebe-ris-hommacord'i süsti. Häid tulemusi annab ravimi kasutamine sama firma Diar-heel tablettidena. Ravimit manustatakse 3 korda päevas, 1 tablett. Tulemused on paremad, kui see eelnevalt lahustada 1,5 spl keedetud vees ja hoolikalt läbi segada.
Esimesel kolmel päeval pärast sünnitust tuleb toitmisel olla ettevaatlik, et võimalikku häiret mitte süvendada. Välismaised autorid soovitavad sel perioodil anda emasele keedetud väikesed kanad, mis on jahvatatud koos kontidega ja segatud keedetud riisiga.
Pärast esimesi sünnitusjärgseid päevi parandab emane isu märgatavalt ja see on üsna loomulik - tema keha vajadused suurenevad märgatavalt. Kõigepealt hakkab aktiivselt tootma ternespiima ja seejärel piima. Suurel määral ei sõltu piima kogus ja kvaliteet mitte ainult emase individuaalsetest omadustest, vaid ka tema toitumisest.
Esimesel nädalal ületab söödakogus tavapärast dieeti 1,5 korda. Kuid sel perioodil ei tohiks emasele liiga palju liha anda, et mitte põhjustada eklampsiat. Valgukomponendina võite sel ajal anda kala või kodujuustu. Emast tuleks toita sageli (iga 4-5 tunni järel), väikeste portsjonitena. Pärast mao normaalse funktsiooni taastamist on vaja jätkata mineraalsete toidulisandite ja karvkatte tugevdamise vahendite andmist.
- liha, kala ja rups - 45%,
- teravili - 30%,
- piim ja piimatooted - 10%,
- köögiviljad - 15%.
Et imetaval emasel emasel oleks rohkem piima, peaks ta oma toidulauale lisama laktatsiooni soodustavaid toite: toores porgand, liha, kala, puljong, kaerahelbed jne. Võimalusel pakkuge emasele emasele juua: piima (kui seda on ei tekita häireid), tee piimaga, nõrk kohv piimaga. Piima koguse suurendamiseks võite proovida järgmist:
- pune keetmine;
- melissi keetmine: valage üks teelusikatäis rohtu kahe tassi keeva veega, laske sellel tõmmata, lisage suhkur;
- asetage kaks teelusikatäit teed termosesse, valage kaks tassi keeva piima, laske 3-4 tundi tõmmata, seejärel lisage suhkur ja jahutage;
- aniisi keetmine.
Apilac, mida paljud omanikud annavad emastele laktatsiooni suurendamiseks, ei andnud minu praktikas soovitud tulemusi, kuigi proovisin seda anda erinevatele emastele.
Kui koer keeldub kindlalt joomast, võite muidugi proovida teda jooma sundida, kuid parem on kõigepealt proovida teda "petta", pannes veel piisavalt sooja joogi sisse väikese tüki võid. Väga hästi võib juhtuda, et võilõhn võrgutab teda.
Emase kurnatuse vältimiseks peaks tema toitmine sel perioodil olema täielik ning toit sisaldama piisavas koguses kaloreid, valke, vitamiine ja mineraalaineid.
Kuid kogu laktatsiooniperioodi jooksul ei ole toidukogus konstantne. Nagu juba mainitud, tuleks esimesel nädalal dieeti suurendada 1,5 korda. Emase piimakoguse suurenedes peaks suurenema ka ratsioon: teisel nädalal tuleks ratsiooni kahekordistada, kolmandast nädalast kuni laktatsiooni lõpuni kolmekordistada: Võrdlus on tehtud 2010. aasta toitumisega. koer normaalses olekus. Emane toidukogus sõltub tema pesakonna suurusest. Neli pesakonna kutsikat vajavad 2-kordset toitumist ja kaheksa kutsikat vähemalt kolm korda.
Tavaliselt toidab emane kutsikaid 4-6 nädalat. Emase piima kogus ei ole laktatsiooni ajal konstantne. Kuni 20-25 päevani piima kogus suureneb ja seejärel väheneb. Lääne eksperdid pakuvad sellel perioodil väga lihtsat viisi sööda kalorisisalduse arvutamiseks. See meetod seisneb kogu pesakonna kaalumises 3-4 päeva vanuses, iga kilogrammi kutsikate kohta 250 cal lisaenergia lisamises emase emase toidulauale ning vastavalt sellele suurendatakse toidu kogust ja kalorisisaldust.
Imetamise kestus sõltub koera individuaalsetest omadustest ja toitumisest. Igal juhul tuleks loomulikult arvestada koera individuaalseid iseärasusi. On emaseid, keda kutsikad sõna otseses mõttes “imevad välja”, nad toodavad pikka aega, suurtes kogustes piima ja toidavad kutsikaid kuni kaks kuud. Loomulikult peaks nende toit olema suurem ja täielikum kui emastel koertel, kellel on vähe piima isegi "piimatoodangu tipul", mis langeb kokku 14.-17. laktatsioonipäevaga ja kelle omanik lihtsalt unistab, et ta sööb. lapsed kuni kolm nädalat. Suurel määral mõjutab emase piima tootmist täisväärtuslik, asendamatute aminohapeterikas toit. Aminohapete puudus mõjutab eelkõige piima kvaliteeti ja ka selle kogust ning see põhjustab kutsikate kasvutempo langust ja pidurdab nende arengut.
Vitamiinidel on oluline roll ka imetavate emaste koerte toitumises. Neid pole vaja ainult emaste endi jaoks, vaid ka kutsikate arenguks. On vaja tagada, et emane saaks kogu laktatsiooniperioodi jooksul vajaliku koguse vitamiine. Näiteks A-vitamiini sisaldus piimas, mis on kutsikate kasvuks nii vajalik, sõltub ainult selle olemasolust emasöödas *. Seetõttu peaks omanik jälgima selle vitamiini pidevat olemasolu imetava emase koera toidus. See kehtib ka D-vitamiini ja B-vitamiinide kohta, mis erituvad suures koguses koerapiimaga.
Emane vajab piima tootmiseks sama palju lisaenergiat, kui see sisaldub eritunud piimas. Seetõttu sõltub dieedi energeetiline väärtus eelkõige emase piimavarust. Sööda kalorisisaldus sõltub ka laktatsiooniperioodist. Teatavasti toodab emane emane imetamise esimesel ja teisel nädalal vähem piima kui kolmandal ja neljandal nädalal. Seetõttu tuleks toitumine koostada selliselt, et laktatsiooniperioodi esimesel poolel suureneks sööda energiaintensiivsus 2 korda, teisel - 3 korda võrreldes emase vajadusega normaalses seisundis. Praktikas näeb see välja nii: piima moodustumiseks laktatsiooni esimesel poolel vajab 10 kg kaaluv lakteeriv emane lisaks põhitoitumisele 750 kcal kaloreid ja järgmised kaks nädalat - 1500 kcal päevas.
Vahetult pärast sünnitust eritavad naiste piimanäärmed ternespiima. On vaja tagada, et iga vastsündinud kutsikas peab saama spetsiifilisi antikehi sisaldavat ternespiima.
Piima moodustumisel on suur tähtsus mineraalainetel, mille puudumine põhjustab mitte ainult imetavatel koertel, vaid ka järglastel mitmesuguseid osteodüstroofilisi haigusi. Samal ajal on lakteerivate emaste selgroog mineraalainetest tühjenenud ja muutub poorseks, hapraks, ilmneb osteoporoos ja vastsündinud kutsikate rahhiit. Oluline on vältida mineraalivarude kogunemist tiinuse ajal ja noortel koertel - kasvuperioodil ja esimeseks laktatsiooniks valmistumisel. Imetavad emased emased vajavad rohkem soola kui mitteimetavad emased.
5 kg kaaluvate lakteerivate emaste koerte toitumise kvalitatiivne koostis ja päevane energiaintensiivsus esimesel-teisel ja kolmandal-neljandal laktatsiooninädalal
15 kg kaaluvate lakteerivate emaste koerte toitumise kvalitatiivne koostis ja päevane energiaintensiivsus esimesel-teisel ja kolmandal-neljandal laktatsiooninädalal
25 kg kaaluvate lakteerivate emaste koerte toitumise kvalitatiivne koostis ja päevane energiamahukus esimesel-teisel ja kolmandal-neljandal laktatsiooninädalal
Mükotoksiinide määramise meetodid
Kaasaegsed meetodid mükotoksiinide sisalduse tuvastamiseks ja määramiseks toidus ja söödas hõlmavad sõelumismeetodeid, kvantitatiivseid, analüütilisi ja bioloogilisi meetodeid. Mükotoksiinide metoodika areneb väga kiiresti. Väljatöötatud meetodite ja erinevate modifikatsioonide arv on jõudnud juba mitmesajani ja kasvab jätkuvalt.
Sõelumismeetodid, mida iseloomustab analüüsi lihtsus ja kiirus, võimaldavad kiiresti ja usaldusväärselt "välja sõeluda" saastamata proove. Nende hulka kuuluvad tavaliselt kasutatavad meetodid, nagu aflatoksiinide, ohratoksiin A ja zearalenooni minikolonnanalüüs; TLC meetodid kuni 30 erineva mükotoksiini samaaegseks määramiseks; fluorestsentsmeetod aflatoksiinidega saastumise tuvastamiseks jne.
Kvantitatiivsed analüütilised meetodid mükotoksiinide määramiseks võib jagada keemiliseks, radioimmunokeemiliseks ja ensüümimmuunanalüüsiks. Keemilised meetodid on praegu kõige levinumad ja hõlmavad järjestikuseid eraldamisetappe ja mükotoksiinide nõuetekohast kvantifitseerimist. Isolatsioonietapp koosneb kahest etapist: ekstraheerimine – mükotoksiini eraldamine substraadist ja puhastamine – mükotoksiini eraldamine sarnaste füüsikaliste ja keemiliste omadustega ühenditest. Mükotoksiinide lõplik eraldamine viiakse läbi ühe- või kahemõõtmelise õhukese kihi kromatograafia (TLC) abil silikageeliplaatidel erinevates lahustisüsteemides, gaas- ja gaas-vedelikkromatograafias, kõrgsurvevedelikkromatograafias ja massispektromeetrias. Mükotoksiinide kvantitatiivne määramine toimub tavaliselt TLC fluorestsentsi intensiivsuse otsesel võrdlemisel ultraviolettvalguses teadaoleva kontsentratsiooni standarditega nii visuaalselt kui ka densitomeetriliselt. Meetodite usaldusväärsuse suurendamiseks kasutatakse erinevaid kinnitavaid teste, mis põhinevad muude kromatograafiliste, kolorimeetriliste või fluorimeetriliste omadustega mükotoksiini derivaatide valmistamisel.
Viimastel aastatel on suurenenud tähelepanu pööratud väga tundlike ja väga spetsiifiliste radioimmunokeemiliste ja ensüümimmunoanalüüsi meetodite väljatöötamisele mükotoksiinide tuvastamiseks, identifitseerimiseks ja kvantifitseerimiseks. Need meetodid põhinevad mükotoksiinide konjugantide antiseerumite saamisel veise seerumi albumiiniga. Nende eeliseks on erakordne tundlikkus, mis võimaldab tuvastada mükotoksiinide pikogramme ja viia läbi arendusi määramisprotsessi automatiseerimise suunas. Bioloogilisi meetodeid, mis tavaliselt ei ole väga spetsiifilised ja tundlikud, kasutatakse peamiselt mükotoksiinide tuvastamiseks, mille keemilised analüüsimeetodid pole kättesaadavad, või kinnitavate testidena. Katseobjektidena on erinevad mikroorganismid, kanaembrüod, paljud laboriloomad, raku- ja koekultuurid.
Mükotoksiinide sisalduse määramiseks toiduainete koostises valmistatakse proovid tahkefaasilise ekstraheerimise meetodil kontsentreerimispadrunil "Diapak" (lk 3.2.3). Mükotoksiinide eraldamine, identifitseerimine ja kvantitatiivne määramine ettevalmistatud proovides viiakse läbi kõrgsurvevedelikkromatograafia abil Milichrome-5 seeria mikrokolonnkromatograafil moodulkonstruktsiooniga (joonis 12).
Riis. 12. Mikrokolonnkromatograaf
Dokumendis käsitletakse patuliini määramiseks HPLC pöördfaasilist versiooni. Tuvastamine viiakse läbi lainepikkusel 276 nm. Patuliini täpseks tuvastamiseks kasutatakse ka mitme lainepikkuse tuvastamist, mis võimaldab kasutada täiendava identifitseerimisparameetrina spektraalsuhteid. Eraldamine toimub gradientelueerimise režiimis, mis parandab analüüsi eraldusvõimet ja tundlikkust.
Riis. 13. Vedelikkromatograaf:
1 - pump; 2 – proovi süstimisseade; 3 – kromatograafiline kolonn; 4 - detektor;
5 - eluaadi äravool või fraktsioonide kollektor; 6 - registripidaja (salvesti,
integraator või personaalarvuti)
6
4
Proovi analüüs vedelikkromatograafiga (joonis 13) viiakse läbi järgmiselt. Teatud kogus analüüsitud proovilahust sisestatakse kromatograafilise kolonni (3) ülemisse ossa, kasutades proovi süstimisseadet (2). Pumba (1) abil pumbatakse analüüsitav segu eluendiga läbi kromatograafilise kolonni (3), milles analüüsitav segu eraldatakse eraldi fraktsioonideks (komponentideks). Kolonnist voolavat eluaati, mis sisaldab eraldatud komponente, analüüsib detektor (4), mille näidud salvestab salvesti (6).
HPLC metoodilised alused
Eluotroopne seeria. Eluendi elueerimisvõime on eluendi (lahusti või lahustite segu) võime adsorbendi pinnalt adsorbaati välja tõrjuda. Sel juhul, mida tugevamalt on eluendi molekulid adsorbeerunud sorbendi aktiivsetele kohtadele, seda suurem on selle elueerimisvõime. Lahustid, mis on järjestatud järjest suurema elueerimistugevusega, moodustavad eluotroopse seeria.
Pöördfaasikromatograafia eluentidena kasutatakse vett ja elueerimistugevust muutvaid orgaanilisi ühendeid sisaldavate lahustite segusid - n-alkohole, atsetonitriili, tetrahüdrofuraani ja muid, mis moodustavad veega tõelisi lahuseid. Normaalfaasi kromatograafias kasutatakse eluentidena polaarseid modifikaatoreid – lineaarseid ja tsüklilisi süsivesinikke (heksaan, tsükloheksaan, heptaan jne).
Vedelikkromatograafide detektorid. Praegu on välja töötatud üle 20 HPLC detektori. Viis on kõige laialdasemalt kasutatavad, millest kolm on optilised ja kaks on elektrokeemilised. Need viis detektorit võimaldavad analüüsida kõiki orgaaniliste ja anorgaaniliste ainete klasse.
Optilised detektorid hõlmavad spektrofotomeetrilist detektorit (ultraviolett (UV), mis töötab lainepikkuse vahemikus
200–360 nm ja nähtavad lainepikkuste vahemikus 360–780 nm), fluorimeetrilised ja murdumisnäitaja detektorid; elektrokeemilistele – voltammeetrilistele ja konduktomeetrilistele detektoritele. Eriti oluline on massispektromeetriline detektor, millel on unikaalne teabesisu, kuna see võimaldab ainete massispektrite andmebaaside abil tuvastada kromatograafiliselt eraldatud komponente.
Spektrofotomeetriline detektor on kõige levinum HPLC detektor. Selle tööpõhimõte põhineb tuntud Bouguer-Lambert-Beeri valguse neeldumise seadusel. Spektrofotomeetriline detektor registreerib kiirguse selektiivse neeldumise spektrid aine poolt. Neeldumisspektrid sõltuvad uuritava aine struktuurist. See võimaldab teil identifitseerida ainet selle spektri või standardite raamatukogu abil. Bouguer-Lambert-Beeri seaduse järgi sõltub spektriribade intensiivsus aine kontsentratsioonist, mis on aluseks kvantitatiivsele analüüsile ehk aine kontsentratsiooni määramisele.
Laske monokromaatilist valgust intensiivsusega allikast ma 0 kukub pikkusega kraavi l (optiline tee). Küvett täidetakse kontsentratsiooniga aine lahusega FROM. Aine on võimeline neelama monokromaatilist kiirgust. Antud monokromaatilist kiirgust neelamise võime mõõt on väärtus ε on molaarne neeldumistegur või ekstinktsioonikoefitsient. Nõrgenenud valguskiir väljub küvetist intensiivsusega ma. Vastavalt valguse neeldumise seadusele lainepikkusel λ= konst
ma= ma 0 ∙10 -ε Cl , (7)
kus ma on valgusvoo intensiivsus pärast küveti läbimist;
ma 0 on langeva valgusvoo intensiivsus; ε
on ekstinktsioonikoefitsient; FROM on aine molaarne kontsentratsioon küvetis; l on küveti pikkus.
Suhtumine ma juurde ma 0 , väljendatuna protsentides, nimetatakse edastamiseks T ja väärtus A=lg(I 0 / ma) - optiline tihedus.
A=lg(I 0 /I)= ε С∙l. (8)
Aine optiline tihedus on otseselt võrdeline analüüdi kontsentratsiooniga. Spektrofotomeetrilistes detektorites on analüütiliseks suuruseks optiline tihedus AGA. Valem (8) on spektrofotomeetrilise detektori kasutamisel kvantitatiivse analüüsi aluseks, kuna optiline tihedus AGA Aine on otseselt võrdeline kromatograafilise piigi kõrguse või pindalaga.
Optilise tiheduse sõltuvus AGA Küvetile langeva valguse lainepikkusest koos ainega lainepikkuste vahemikus 190–360 nm nimetatakse ultraviolettkiirguse neeldumisspektriks (joonis 14).
200 230 260 290 320 350 λ , nm
AGA, f.r.p.
Riis. 14. Vesilahuse ultraviolettkiirguse neeldumisspekter
ained X
3.2.3. Proovi ettevalmistamine
Igal ainel on maksimaalne neeldumise lainepikkus(λ , nm). Selle lainepikkuse kasutamisel on detektoril aine tuvastamiseks madalaim lävi.
Spektrofotomeetrilise detektori (SPD) abil tuvastatakse suur hulk erinevatesse klassidesse kuuluvaid aineid, mis neelavad ultraviolettvalgust.
Spektrofotomeetrilise detektori kasutamine kromatograafias hõlbustab oluliselt tuvastamist. Mitme lainepikkusega detektor koos tarkvaraga võimaldab teil saada kromatogrammi mitmel lainepikkusel korraga ja arvutada komponentide tuvastamiseks täiendava parameetri - spektraalnesuhtumine (K) on kromatograafilise piigi kõrguste suhe erinevatel lainepikkustel
kus AGA 1 ja AGA 2 - optilise tiheduse koefitsiendid lainepikkustel 1 ja 2. Väärtus K iga aine puhul on konstantne omadus ja see ei sõltu selle kontsentratsioonist. Spektrisuhete täpsus sõltub aine optilise tiheduse väärtustest ja detektori konstruktsioonist.
Proovide ettevalmistamine kassettide kontsentreerimisel tahkefaasilise ekstraheerimise meetodil säästab aega ja tööjõukulusid. Tahkefaasiline ekstraheerimine võimaldab teil proovi kontsentreerida ja puhastada kaasnevatest lisanditest. Tahkefaasilise ekstraheerimise keeruline skeem näeb ette kahe kasseti järjestikuse kasutamise:
– universaalne kontsentreerimiskassett “DIAPAK P-Z” – korduvkasutatav kassett (kuni 50 proovi) koos ülemise ja alumise filtri komplektiga (10 tk);
– universaalne kassett peenpuhastuseks “DIAPAK S” – ühekordne kassett.
Sest kontsentreerivate padrunite ettevalmistamine peate tegema järgmised toimingud.
Sest kontsentreerimiskasseti "DIAPAK P-Z" ettevalmistamine:
- pumbata läbi kasseti 10 ml vee-atsetonitriili segu (58:42);
– vahetult enne proovi ettevalmistamist pumbake läbi kasseti 10 ml destilleeritud vett.
Sest kontsentreerimiskasseti ettevalmistamine "DIAPAK S":
- pumbake 5 ml benseeni läbi kasseti ja ühendage kassett mõlemast otsast.
Toiduaine ettevalmistamine kontsentreerimiseks
10,0 g kaaluv proov asetatakse keeduklaasi, segatakse väikese koguse destilleeritud veega ja kantakse kvantitatiivselt 50 ml mõõtekolbi. Lisage kolbi 6,0 ml Carrez I lahust ja Carrez II lahust. Kolvi sisu viiakse destilleeritud veega märgini, segatakse hoolikalt ja filtreeritakse läbi kurdpaberifiltri mõõtesilindrisse. Mõõtke selge filtraadi P maht.
Selitatud mahlade ja jookide valmistamisel filtreerige proov läbi tiheda paberfiltri, kuni saadakse 20 ml selget filtraati P.
Proovi kontsentratsioon kassetil "DIAPAK P-Z"
Kandke kogu filtraadi P kogus eelnevalt ettevalmistatud padrunile kiirusega 1–2 tilka sekundis.
Loputage kassett 5 ml bidestilleeritud veega, visates ära kõik pesud.
Elueerige patuliin 10 ml etüülatsetaadi kassetist kolbi või korgiga mõõtetorusse, mis sisaldab 5 ml
1,5% naatriumkarbonaadi vesilahus, sulgege korgiga, segage intensiivselt ja laske koorida.
Monteerige kuivatuskolonn, täites filtri korpuse ligikaudu 2 g veevaba naatriumsulfaadiga, tihendage kuivatusaine koputades kolonni seinale ja kinnitage vatitikuga.
Ülemine etüülatsetaadi kiht dekanteeritakse pipetiga, filtreeritakse läbi kuivatuskolonni, kogudes filtraat 50 ml südamekujulisse kolbi; Lisaks ekstraheerige naatriumkarbonaadi vesilahus esmalt 10 ml ja seejärel 5 ml etüülatsetaadiga ning pärast eraldamist filtreerige dekanteeritud etüülatsetaadi kogused järjestikku läbi kuivatuskolonni samasse kolbi.
Aurustage etüülatsetaat vaakumis temperatuuril mitte üle 40°C mahuni umbes 0,5 ml (ärge aurustage kuivaks!), Lisage 2,5 ml benseeni (jälgige mahusuhet 1:5).
Kassetil "DIAPAK S" oleva proovi puhastamine
Eemaldage ettevalmistatud kassetilt korgid ja lasege benseen-etüülatsetaadi proovilahus läbi kiirusega 1-2 tilka sekundis. Peske kolbi veel 0,5–1,0 ml benseen-etüülatsetaadiga (85:15) ja kandke kolbampulli, visates ära pesuveed.
Elueerige patuliin 6 ml padrunist benseen:etüülatsetaadiga (7:3), kogudes eluaadi südamiku eemaldamise kolbi.
Aurustage eluaat kuivaks õhuvannis temperatuuril mitte üle 40 °C.
Kohe! Pärast aurustamist lahustage proov uuesti 0,2–0,25 ml eluendis A (punkt 3.2.4.2), mis on jahutatud temperatuurini 5–8 °C.
3.2.4. Töökäsk
Eesmärk– mükotoksiini patuliini sisalduse määramine toiduainete koostises kõrgsurvevedelikkromatograafia abil Milichrome-5 seeria mikrokolonnkromatograafil.3.2.4.1. Mõõtmistehnika
Mõõtmised hõlmavad järgmisi põhietappe:- kromatograafi kalibreerimine teadaoleva patuliini massikontsentratsiooniga lahuste järgi;
- toiduproovi valmistamine tahkefaasilise ekstraheerimise meetodil vastavalt lõigetele. 3.2.3;
– ekstrakti analüüs HPLC abil signaali registreerimisega UV-detektoriga;
– patuliini tuvastamine retentsiooniparameetrite ja spektraalsuhete järgi;
– patuliini massikontsentratsiooni arvutamine proovis registreeritud analüütilise signaali (piigi kõrguse) ja kalibreerimisgraafiku põhjal;
- patuliini massiosa arvutamine toiduaine koostises.
Instrumendid, reaktiivid ja materjalid, töö tegemiseks vaja:
– Milichrome-5 seeria kromatograaf või mõni muu HPLC kromatograaf koos tarkvaraga WinXrom või Multichrome;
– HPLC kromatograafiline kolonn: Diasfer–110–С10СN (5 µm, 2 × 80 mm, TU 4215–001–05451931–94);
– muutuva mahuga dosaator 1-100 µl jaoks;
– muutuva mahuga dosaator 100–1000 µl jaoks;
- tihedalt jahvatatud õhukese osaga kooniline kolb mahuga kuni 10 ml;
– membraanfiltrid;
- patuliini standardlahuste komplekt kontsentratsiooniga 1, 2, 5 ja 10 mg/l;
- fosforhape 85%;
– atsetonitriil vedelikkromatograafiaks (eripuhtuse spetsifikatsioon TU 6–09–3513–86, UV-neeldumine kuni 200 nm);
– heksaan, keemiliselt puhas (rektifitseeritud);
- trifluoroäädikhape;
– Carrezi lahus I – lahustada 15,0 g kaaliumheksatsüanoferaati II 100 ml vees.
- Carrez II lahus – lahustage 30,0 g tsinkatsetaati 100 ml vees;
- eluendid A, B ja C.
Eluentide valmistamine
Eluent A. 100 ml mahuga tihedalt lihvitud klaasosaga mõõtekolbi lisatakse 20 ml atsetonitriili ja 0,5 ml 10% trifluoroäädikhappe lahust. Lahus segatakse põhjalikult ja viiakse märgini destilleeritud veega, mis on eelnevalt filtreeritud läbi nailonmembraanfiltri (0,2 µm). Seejärel degaseeritakse eluent evakueerimisega 1 minuti jooksul eraldusvõimega 1 kg∙s/cm2.
Eluendid B ja C valmistatakse samamoodi nagu eluent A, võetakse 100 ml lahuse kohta vastavalt ainult 10 ja 0 ml atsetonitriili.
3.2.4.2. Kromatograafiliste eraldusrežiimide seadistamine
ja tulemuste registreerimine
Mõõtmiste läbiviimiseks on vaja seadistada kromatograafi töörežiimid. Dosaatori režiimid:
– regenereerimine – 300 µl;
– proovi maht – 5 µl;
– eluendi kulu – 150 µl/min;
– gradiendi elueerimisrežiimid: 800 µl – eluent A,
500 ui - eluent B, 300 ui - eluent C;
- termostaadi temperatuur - 35 0 С.
Tuvastamisrežiimid:
– lainepikkuste arv – 3;
– lainepikkused – 250, 276, 290 nm;
– mõõtmisaeg – 0,04 s.
Kromatograafilise süsteemi konditsioneerimine viiakse läbi 30 minutit enne mõõtmist, tehes "pimeanalüüsi", milles patuliini sisaldav standardsegu asendatakse 5-10 µl eluendiga ja seejärel eraldatakse mükotoksiinide standardsegu.
1. harjutus. Uurida toiduainete proovide valmistamise meetodit patuliini sisalduse määramiseks. Näidised valmistatakse ette vastavalt punktile 3.2.3.
2. ülesanne. Kalibreerige kromatograaf. Kromatograaf kalibreeritakse, lisades järjestikku patuliini standardlahuseid kontsentratsiooniga 1, 2, 5 ja 10 mg/l.
Õpetaja juhendamisel tehakse ettepanek sisestada kromatograafilise eraldamise parameetrid (punkt 3.2.4.3) PC klaviatuurilt programmi (WinXrom) ja käivitada 2-4 kromatograafilist analüüsi automaatrežiimis. Tulemused esitatakse tabeli kujul. 6.
T a b l e 6
Koostage saadud kromatograafiliste profiilide põhjal kalibreerimisgraafik (kontsentratsioon on kantud piki ordinaattelge - mg / l, piki abstsisstelge on mükotoksiini optiline tihedus AGA– s.o.p.).
3. ülesanne. Tuvastage patuliin toiduaine analüüsitavas proovis ja määrake selle kontsentratsioon.
Õpetaja juhendamisel alustada automaatrežiimil valmistatud toidukauba proovi mõõtmist
(ülesandes 2 valitud kromatograafilise eraldamise parameetritega). Mõõtmise lõppedes tuvastage patuliini mükotoksiin vastavalt ülesandes 2 saadud standardfailile (“StandardDD–MM–YY.001”). Tehke ülesandes 2 ehitatud kalibreerimisgraafiku abil kindlaks patuliini kontsentratsioon toiduproovis.
Registreerige tulemused tabelisse. 7.
Tabel 7
Patuliini massikontsentratsioon toiduproovis arvutatakse valemiga
kus FROM– patuliini massikontsentratsioon proovis, mg/l (arvutatakse kalibreerimissõltuvuse järgi, lähtudes analüütilise piigi kõrgusest); V lk on proovi maht, ml; R - mükotoksiini ekstraheerimise aste proovi ettevalmistamise etapis (võrdne 60%); M pr on puhastamiseks ja järgnevaks kromatograafiliseks määramiseks kasutatud toiduaine proovi mass, g.
Määratavas objektis mükotoksiini massiosa mõõtmise tulemus on esitatud järgmisel kujul: X± mg/kg; juures R\u003d 0,95 ja kantakse protokolli (lisa 1), kus X i , on patuliini massikontsentratsioon proovis, mg/kg; R- tõenäosus; on valemiga arvutatud absoluutne veapiir
Pärast tulemuse saamist on vaja hinnata lähenemise operatiivjuhtimise standardite väärtusi, mis on antud asjakohastes GOST-ides kontrolli (analüüsi) meetodite jaoks.
Tehke järeldus patuliini sisalduse vastavuse (või mittevastavuse) kohta uuritavas toiduaines SanPiN 2.3.2.1078-01 kehtestatud lubatud normidele.
Küsimused enesekontrolliks
1. Millised põhimõtted on kromatograafiliste analüüsimeetodite klassifitseerimise aluseks?
2. Mis on kromatograafilise eraldamise olemus? Kuidas toimub kvalitatiivne tuvastamine ja kvantitatiivne analüüs?
3. Millised toiduained sisaldavad mükotoksiine? Millised mükotoksiinid on SanPiNi nõuete kohaselt toiduainete koostises määratud?
4. Millist kromatograafilist meetodit kasutatakse mükotoksiinide sisalduse määramiseks toiduainetes?
5. Millel põhineb spektrofotomeetriline tuvastamine? Mis on spektrisuhted ja milleks neid kasutatakse?
6. Kuidas toimub toiduproovide ettevalmistamine patuliini sisalduse määramiseks HPLC abil?
7. Milliseid operatsioone hõlmab patuliini määramise HPLC meetod?
8. Mis on eluent ja gradientelueerimine? Milliseid eluente kasutatakse patuliini määramisel HPLC abil?
9. Kuidas patuliini identifitseeritakse ja kvantifitseeritakse?
10. Kuidas on tagatud patuliini HPLC määramise täpsus?
Mükotoksiinide määramise meetodid
Kaasaegsed meetodid mükotoksiinide sisalduse tuvastamiseks ja määramiseks toidus ja söödas hõlmavad sõelumismeetodeid, kvantitatiivseid analüütilisi ja bioloogilisi meetodeid.
Sõelumismeetodid on kiired ja mugavad seeriaanalüüsiks, võimaldavad kiiresti ja usaldusväärselt eraldada saastunud ja saastumata proove. Sõelumismeetodid hõlmavad õhukese kihi kromatograafiat (TLC meetodid), fluorestseeruvat meetodit aflatoksiinidega saastunud terade määramiseks.
Kvantitatiivsed analüütilised meetodid mükotoksiinide määramiseks on esindatud keemilise, radioimmunoloogilise ja ensüümimmunoanalüüsi meetoditega. Tänapäeval on levinumad keemilised meetodid, mis hõlmavad kahte etappi: isoleerimise etapp ja mükotoksiinide kvantitatiivse määramise etapp. Isolatsioonietapp hõlmab ekstraheerimist (mükotoksiini eraldamine substraadist) ja puhastamist (mükotoksiini eraldamine sarnaste füüsikaliste ja keemiliste omadustega ühenditest). Mükotoksiinide lõplik eraldamine ja kvantifitseerimine toimub erinevate kromatograafiliste meetodite abil. Universaalne meetod igat tüüpi mükotoksiinide määramiseks on õhukese kihi kromatograafia (TLC).
Tootepartiist proovide võtmisel on peamine eesmärk saada keskmine proov või keskmine proov, mis esindab mükotoksiinide kontsentratsiooni poolest kogu partii (võetud proovid peaksid iseloomustama kogu partii kvaliteeti). Selle ülesande täitmine oleneb mükotoksiinide olemusest ja levikust, toote omadustest (toores, töödeldud, vabalt voolav, vedel, pastane jne), proovi ettevalmistamise meetodist. Näiteks maapähklite saastumine aflatoksiinidega on selgelt heterogeenne: üksikutes maapähkliterades võib nende sisaldus varieeruda tuhandetest milligrammidest kümnete või enama milligrammini 1 kg kohta, st erineda 5–6 suurusjärku. Sel põhjusel on proovivõtuvea panus aflatoksiinide määramisel maapähklites kogu analüüsiveasse peamine ja mõnel juhul võib see olla üle 90%.
Mükotoksiinidega saastumise ühtluse seisukohalt võib kõik tooted jagada kahte rühma: 1) kõrge heterogeensusastmega tooted (kooritud ja kooreta maapähklid, õliseemned, täis- või jämedad terad, pähklid); 2) ühtlase saastatusega tooted (vedelikud: piim, taimeõlid, mahlad, püreed; jahu, jahu).
l-nda rühma toodete esindusliku keskmise proovi saamiseks peaks algproov olema võimalikult suur (vähemalt 2 kg), samas kui keskmine laboriproov tuleks eraldada jahvatatud (homogeniseeritud) keskmisest proovist. .
2. rühma homogeensetest toodetest (moos, marmelaad, puuviljamahlad väikestes plekknõudes, kondenspiim, piimakuivad tooted jne) tuleks proove võtta keskmise proovi suurusele vastavas koguses pakendiühikuid (100). -200 g), eeldusel, et toode pärineb samast partiist.
Üksikute aflatoksiinide tuvastamise ja identifitseerimise keemilised meetodid põhinevad nende spetsiifilisel fluorestsentsil UV-valguses (umbes 365 nm), liikuvuse erinevustel õhukese kihi kromatograafias, nende neeldumise ja fluorestsentsspektri spetsiifilisusel.
Erinevalt aflatoksiinidest ei ole trikotetseenidel spektri nähtavas osas neeldumine ega fluorestsents, mistõttu on nende tuvastamine õhukese kihi kromatograafiaga keeruline. Samal ajal saab trihhoteteene tuvastada TLC abil, kasutades meetodeid, mis põhinevad TLC plaatide töötlemisel spetsiaalsete reagentidega, mis moodustavad trihhoteteenidega värvilisi või fluorestseeruvaid derivaate. Näiteks T -2 toksiin plaatide töötlemisel; kontsentreeritud väävelhape moodustab UV-valguses sinise fluorestsentsiga laike;
Arbitraažimeetodid mükotoksiinide kvantitatiivseks määramiseks on järgmised:
‣‣‣ gaas-vedelikkromatograafia (T-2 toksiini jaoks);
‣‣‣ kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC), kasutades UV-fotomeetrilist detektorit (desoksünivalenooli ja patuliini jaoks);
‣‣‣ HPLC, kasutades fluorestsentsdetektorit (aflatoksiinide ja zearalenooni jaoks).
Joonisel fig. 2 kujutab moodsa vedelikkromatograafi seadet kõige lihtsamas disainis.
Liikuv faas mahutist 1 läbi sisendfiltri 9 suunatakse kõrgsurvepumba 2 abil proovisisendsüsteemi 3 - käsitsipihustisse või automaatsaamplerisse, kuhu proov ka süstitakse. Seejärel liigub liikuva faasi vooluga proov läbi filtri 8 läbi eelkolonni eralduskolonni 4. Seejärel liigub kolonnist väljuv liikuva faasi vool, mis sisaldab eraldatava segu komponente (eluaat) siseneb detektorisse 5 ja eemaldatakse ülevoolupaaki 7. Kui eluaat voolab läbi mõõtedetektori silmuse, registreeritakse kromatogramm ja andmed kantakse üle salvestusseadmesse 6 või arvutisse.
Vedelikkromatograaf (isokraatne süsteem):
1 - mahutavus; 2 - kõrgsurvesüsteem; 3 - käsitsi pihusti või automaatne proovivõttur; 4 - eralduskolonn; 5 - detektor; b - registripidaja või arvuti; 7 - tühjenduspaak; 8 - filter; 9 - sisendfilter
Joonisel fig. 2 on isokraatlik: liikuva faasi koostis kromatograafia käigus ei muutu. Kui kromatograafilise analüüsi käigus on äärmiselt oluline muuta liikuva faasi ühe või mitme komponendi kontsentratsiooni, siis kasutatakse nn gradientsüsteeme, mis koosnevad tavaliselt kahest või enamast pumbast. Gradientelueerimise korral juhitakse iga lahusti eraldi anumast spetsiaalsesse magnetsegistiga segamiskambrisse, kus need teatud programmi järgi segatakse etteantud mahusuhtega.
Mükotoksiinide analüüsiks kasutatakse sagedamini gradientsüsteeme, kus liikuva faasina kasutatakse atsetonitriili vees lahuseid, mille kontsentratsioon muutub ajas lineaarselt.
Kromatograafiakolonn on 150–250 mm läbimõõduga metalltoru, mille siseläbimõõt on 4,6 mm ja mis on täidetud spetsiaalse sorbendiga, mis põhineb silikageelil ja millele on lisatud poogitud süsivesinikradikaale. Kaitsekolonni eesmärk on kaitsta kromatograafilist kolonni saastumise eest.
UV-fotomeetriline detektor on kõige levinum HPLC-detektori tüüp. Detektori tööpõhimõte on sarnane tavalise spektrofotomeetri omaga: see registreerib lahuse optilise tiheduse. Erinevus seisneb selles, et UV-detektor on vooluandur, lahusega küveti asemel kasutatakse fotomeetrilist elementi. Eluendi vool voolab läbi töökambri ja puhas liikuv faas läbi võrdluselemendi. Valgusallikaks on elavhõbedalamp, mis toodab intensiivset UV-kiirgust. Soovitud lainepikkusega valgus valitakse sobivate optiliste filtrite abil, läbib rakke, neeldub osaliselt liikuva faasi molekulides ja eraldatavates komponentides ning püüab kinni fotodetektoriga. Eluaadi valguse neeldumine (optiline tihedus) salvestatakse pidevalt diagrammi salvestaja või arvuti abil, salvestades kromatogrammi. Segu eraldatud komponendid (näiteks mükotoksiinid) on kromatogrammil esitatud piikidena. Aine identifitseerimiseks kasutatakse piigi asukohta kromatogrammil ja piigi pindala kasutatakse kvantitatiivseks määramiseks.
Keerulisem seade on fluorestseeruv (fluorimeetriline) detektor.
Majutatud aadressil ref.rf
Selline detektor kasutab orgaaniliste ühendite, eelkõige aflatoksiinide ja zearalenooni võimet UV- või nähtava kiirgusega kokkupuutel fluorestseeruda. Fluorestsentsdetektoril on kahe vastastikku risti asetseva optilise kanaliga vooluelement. Üks neist pakub põnevat kiirgust, teine võimaldab mõõta fluorestsentsi intensiivsust. Aflatoksiinide B 1 ja M 1 analüüsi puhul on ergastuslainepikkuseks 360 nm ja emiteeritud lainepikkuseks 420 nm.
Tuleb märkida, et aflatoksiinide analüüsiks saab kasutada ka UV-detektorit, kuid selle tundlikkus on suurusjärgu võrra madalam kui fluorimeetrilisel detektoril, mistõttu on madalate aflatoksiinide kontsentratsioonide analüüsimisel eelistatav fluorestsentsi tuvastamine (MPC-s). tase ja alla selle).
Mükotoksiinide määramise meetodid - mõiste ja liigid. Kategooria "Mükotoksiinide määramise meetodid" klassifikatsioon ja tunnused 2017, 2018.
GOST 32835-2014
RIIKIDEVAHELINE STANDARD
MAHLATOOTED
Mükotoksiinide määramine tandem kõrgefektiivse vedelikkromatograafia-massispektromeetria (HPLC-MS/MS) abil
Mahlatooted. Mükotoksiinide määramine tandem kõrgefektiivse vedeliku massispektromeetria (HPLC-MS/MS) abil
MKS 67.080.01
Tutvustuse kuupäev 2016-01-01
Eessõna
Riikidevahelise standardimise eesmärgid, aluspõhimõtted ja põhiprotseduur on kehtestatud GOST 1.0-92 "Riikidevaheline standardimissüsteem. Põhisätted" ja GOST 1.2-2009 "Riikidevaheline standardimissüsteem. Riikidevahelise standardimise standardid, reeglid ja soovitused". Väljatöötamise, vastuvõtmise, kohaldamise, uuendamise ja tühistamise reeglid
Standardi kohta
1 VÄLJATÖÖTAJA Föderaalne riiklik kõrgharidusasutus "Moskva Riiklik Toiduainete Tootmise Ülikool" (FGBOU VPO "MGUPP")
2 TUTVUSTAS Föderaalne Tehniliste eeskirjade ja Metroloogia Agentuur
3 VASTU VÕTNUD Osariikidevahelise standardimis-, metroloogia- ja sertifitseerimisnõukogu poolt (25. juuni 2014 protokoll N 45-2014)
Hääletas vastuvõtmise poolt:
Riigi lühinimetus MK (ISO 3166) 004-97 järgi | Riikliku standardiorganisatsiooni lühendatud nimi |
|
Armeenia | Armeenia Vabariigi majandusministeerium |
|
Valgevene | Valgevene Vabariigi riiklik standard |
|
Kõrgõzstan | Kõrgõzstandart |
|
Venemaa | Rosstandart |
4 Tehnilise reguleerimise ja metroloogia föderaalse ameti 19. augusti 2014 korraldusega N 896-st GOST 32835-2014 jõustus Vene Föderatsiooni riikliku standardina alates 1. jaanuarist 2016.
5 See standard on välja töötatud, võttes arvesse järgmiste rahvusvaheliste dokumentide sätteid:
- CODEX STAN 247-2005* Codex Alimentariuse komisjoni puuviljamahlade ja -nektarite üldstandard;
________________
* Juurdepääs edaspidi tekstis mainitud rahvusvahelistele ja välismaistele dokumentidele on saadaval, klõpsates saidi http://shop.cntd.ru lingil. - Andmebaasi tootja märkus.
- Euroopa Liidu Komisjoni 23.02.2006 määrus r. ei. 406/2006/EÜ, millega kehtestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid toiduainete mükotoksiinide sisalduse ametlikuks kontrolliks toiduainete mükotoksiinide sisalduse ametlikuks kontrolliks“);
- Euroopa Puuviljamahla Assotsiatsiooni AIJNi puu- ja köögiviljamahlade kvaliteedi ja autentsuse hindamise tegevusjuhend.
6 ESIMEST KORDA TUTVUSTATUD
Teave selle standardi muudatuste kohta avaldatakse iga-aastases teabeindeksis "Riiklikud standardid" ning muudatuste ja muudatuste tekst - igakuises teabeindeksis "Riiklikud standardid". Käesoleva standardi läbivaatamise (asendamise) või tühistamise korral avaldatakse vastav teade igakuises teaberegistris "Riiklikud standardid". Asjakohane teave, teatised ja tekstid postitatakse ka avalikku infosüsteemi - föderaalse tehniliste eeskirjade ja metroloogiaameti ametlikule veebisaidile Internetis
1 kasutusala
1 kasutusala
See standard kehtib puu- ja köögiviljamahlade ja muude mahlatoodete kohta, välja arvatud tsitrusviljade rakud, ning kehtestab meetodi mükotoksiinide – patuliini ja ohratoksiin A – määramiseks, kasutades kõrgjõudlusega vedelikkromatomassi tandemspektromeetriat mõõtmisvahemikus. patuliini massikontsentratsioon 0,1 kuni 100,0 µg/dm ja ohratoksiin A 0,1 kuni 20,0 µg/dm.
MÄRKUS Seda rahvusvahelist standardit soovitatakse rakendada selle rakendamisega seotud täiendava teabe kinnitamiseks ja kogumiseks.
2 Normatiivviited
See standard kasutab normatiivseid viiteid järgmistele riikidevahelistele standarditele:
GOST 12.1.004-91 Tööohutusstandardite süsteem. Tuleohutus. Üldnõuded
GOST 12.1.007-76 Tööohutusstandardite süsteem. Klassifikatsioon ja üldised ohutusnõuded
GOST 12.1.010-76 Tööohutusstandardite süsteem. Plahvatusohutus. Üldnõuded
GOST 12.1.019-79 Tööohutusstandardite süsteem. Elektriohutus. Üldnõuded ja kaitseliikide nomenklatuur
GOST 61-75 reaktiivid. Äädikhape. Tehnilised andmed
GOST OIML R 76-1-2011 Riiklik süsteem mõõtmiste ühtsuse tagamiseks. Mitteautomaatsed kaalud. Osa 1. Metroloogilised ja tehnilised nõuded. Testid
GOST 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) Laboriklaasi mõõtmine. Silindrid, keeduklaasid, kolvid, katseklaasid. Üldised spetsifikatsioonid
GOST ISO 3696-2013 Vesi laborianalüüsiks. Tehnilised nõuded ja kontrollimeetodid
GOST ISO 5725-1-2003 Mõõtmismeetodite ja -tulemuste täpsus (õigsus ja täpsus). 1. osa. Põhisätted ja mõisted
GOST ISO 5725-2-2003 Mõõtmismeetodite ja -tulemuste täpsus (õigsus ja täpsus). Osa 2: Põhimeetod standardse mõõtmismeetodi korratavuse ja reprodutseeritavuse määramiseks
GOST 5789-78 Reaktiivid. Tolueen. Tehnilised andmed
GOST 16317-87 Kodumajapidamises kasutatavad elektrilised külmutusseadmed. Üldised spetsifikatsioonid
GOST 20015-88 Kloroform. Tehnilised andmed
GOST 25336-82 Klaasnõud ja laboriseadmed. Tüübid. Peamised parameetrid ja mõõtmed
GOST 26313-84 Töödeldud puu- ja köögiviljatooted. Vastuvõtmise reeglid, proovivõtumeetodid
GOST 26671-85 Töödeldud puu- ja köögiviljatooted, lihakonservid ning liha ja köögiviljad. Proovi ettevalmistamine laboratoorseks analüüsiks
GOST 29030-91 Puu- ja köögiviljade töötlemise tooted. Püknomeetriline meetod lahustuvate tahkete ainete suhtelise tiheduse ja sisalduse määramiseks
GOST 29227-91 (ISO 835/1-81) Labori klaasnõud. Pipetid lõpetasid. Osa 1. Üldnõuded
GOST ISO/IEC 17025-2009 Testimis- ja kalibreerimislaborite pädevuse üldnõuded
GOST 32689.1-2014 Taimset päritolu toiduained. Multimeetodid pestitsiidide jääkide gaasikromatograafiliseks määramiseks. 1. osa. Üldsätted
GOST 32689.2-2014 Taimset päritolu toiduained. Multimeetodid pestitsiidide jääkide gaasikromatograafiliseks määramiseks. 2. osa: Ekstraheerimis- ja puhastamismeetodid
GOST 32689.3-2014 Taimset päritolu toiduained. Multimeetodid pestitsiidide jääkide gaasikromatograafiliseks määramiseks. Osa 3. Tulemuste kindlaksmääramine ja kinnitamine
Märkus - selle standardi kasutamisel on soovitatav kontrollida võrdlusstandardite kehtivust avalikus infosüsteemis - föderaalse tehniliste eeskirjade ja metroloogiaameti ametlikul veebisaidil Internetis või iga-aastase teabeindeksi "Riiklikud standardid" järgi. , mis ilmus jooksva aasta 1. jaanuari seisuga, ja jooksva aasta igakuise teabeindeksi "Riiklikud standardid" numbrites. Kui võrdlusstandard asendatakse (muudetud), peaksite selle standardi kasutamisel juhinduma asendavast (muudetud) standardist. Kui viidatud standard tühistatakse ilma asendamiseta, kohaldatakse sätet, milles sellele viidatakse, niivõrd, kuivõrd seda viidet ei mõjutata.
3 Lühendid
HPLC-MS/MS - tandem kõrgjõudlusega vedelikkromatograafia-massispektromeetria;
OTA, ohratoksiin A;
PAT - patuliin;
ESI- pihustusionisatsioon elektriväljas ( Elektropihustus-ionisatsioon);
IARC- Rahvusvaheline Vähiuuringute Agentuur;
LOD- avastamispiir;
LOQ- kvantitatiivse määramise piir;
SRM- komponentide tuvastamine selektiivsete reaktsioonide juhtimise režiimis ( Valitud reaktsiooni jälgimine).
4 Meetodi olemus
Meetodi olemus seisneb PAT ja OTA mükotoksiinide esialgses ekstraheerimises atsetonitriiliga veevaba magneesiumsulfaadi juuresolekul, kontsentreerimises, uuesti lahustamises atsetonitriilis ja mükotoksiinide massikontsentratsiooni kvantitatiivses määramises HPLC-MS/MS abil pihustusionisatsiooniga. elektriväljas ja komponentide tuvastamine selektiivsete reaktsioonide juhtimise režiimis.
5 Mõõteriistad, abiseadmed, etalonmaterjalid, reaktiivid ja klaasnõud
Analüütiline HPLC-MS/MS* süsteem kolmekvadrupoolilise massidetektoriga mõõtmiseks massivahemikus 10 kuni 3000 aatommassi ühikut (amm.u), massi mõõtmise täpsusega vähemalt 0,1 a.m.u, ionisatsiooniga pihustamisega elektriväljas, võime töötada valitud reaktsioonide juhtimise režiimis ning lapse ja vanemate ioonide skaneerimisel, minimaalne signaali-müra suhe 1000:1. Analüütiline süsteem peaks sisaldama HPLC moodulit, mis koosneb segistiga binaarpumbast, kromatograafilise kolonni termostaadist, mis tagab kuni 50 °C kuumutamistemperatuuri, ja kromatograafilisest kolonnist pöördfaasilise sorbendiga, mille tera suurus on 5 μm C. , 150 mm pikk ja 3 mm siseläbimõõt. Kasutatav süsteem peab tagama mükotoksiinide tuvastamise vahemikus 0,1–100,0 µg/dm.
________________
* Soovitatavate LC/MS/MS süsteemide kohta lisateabe saamiseks vaadake lisa A.
Spektrofotomeeter mõõtepiirkonnaga, mis võimaldab testida lainepikkusel 250–400 nm, optilise tiheduse mõõtmise absoluutne viga ei ületa 0,1%.
Kaalud vastavalt standardile GOST OIML R 76-1, mis tagavad kaalumise täpsuse ühe kaalumise lubatud absoluutvea piiriga mitte üle ±0,01 mg.
Vanni ultraheli.
Tsentrifuug rootori kiirusega 4000-5000 p/min katseklaasidele mahuga 50 ml.
Tsentrifuug rootori kiirusega 10000-12000 p/min Eppendorfi tüüpi katseklaasidele mahuga 1,5-2,0 ml.
Kuivatuskapp hoiab temperatuuri kuni 200°С.
Majapidamiskülmik vastavalt standardile GOST 16317.
Shaker segamiseks.
Seadmed vedelikuproovide doseerimiseks konstantse või muutuva mahuga 20–1000 mm, mille suhteline viga doseerimisel ei ületa 2,5%.
Mikrofilter - otsik süstlal (regenereeritud tselluloos, läbimõõt 13 mm, pooride suurus 0,2-0,4 mikronit).
Kvartsküvetid tööpikkusega 1 cm.
Võrdlusproovidena kasutamiseks PAT ja OTA mükotoksiinid, mille põhiaine sisaldus on vähemalt 98%.
Jää-äädikhape vastavalt GOST 61, analüütiline klass.
Atsetonitriil gradient-HPLC jaoks.
Metanool gradient-HPLC jaoks.
Veevaba magneesiumsulfaat, keemiliselt puhas
Veevaba kaltsiumkloriid, granuleeritud, keemiliselt puhas
Kloroform vastavalt GOST 20015, keemiliselt puhas
Tolueen vastavalt GOST 5789, keemiliselt puhas
Etüülalkohol, absoluutne.
Vesi laboratoorseks analüüsiks, puhtusaste 1 vastavalt standardile GOST ISO 3696.
2. täpsusklassi gradueeritud pipetid mahuga 1, 2, 5, 10 cm 2 2. täpsusklassist vastavalt standardile GOST 29227.
2. täpsusklassi mõõtkolvid mahuga 5, 10, 25, 50, 100 ja 1000 cm 2 või 2a vastavalt standardile GOST 1770.
Terava põhjaga kolvid mahutavusega 10,25 cm3.
Eppendorfi tüüpi tsentrifuugitoru mahuga 1,5-2,0 ml.
Mikrokatseklaas mahuga 100-400 mm.
2. täpsusklassi mõõtesilindrid mahuga 25, 50, 250 cm3 mis tahes konstruktsiooniga vastavalt standardile GOST 1770.
Keeratava korgiga tsentrifuugitoru, 50 cm
Portselanist tass läbimõõduga 125-150 mm.
Laborieksikaator mahuga 3 dm.
Lehtrilabor vastavalt standardile GOST 25336.
Lamedapõhjalised kolvid mahutavusega 50, 100, 250 cm3 vastavalt standardile GOST 25336.
Keemilised klaasid mahuga 10, 20, 50, 100 ja 200 cm3 vastavalt standardile GOST 25336.
Lubatud on kasutada muid mõõteriistu, abiseadmeid, riistu, mis ei ole metroloogiliste ja tehniliste näitajate poolest ülaltoodust halvemad ja tagavad vajaliku mõõtetäpsuse, samuti standardproove, reaktiive ja materjale, mille kvaliteet ei ole halvem kui ülaltoodud. .
6 Proovide võtmine
Proovide võtmine - vastavalt standardile GOST 26313. Proovide ettevalmistamine ja säilitamine - vastavalt standarditele GOST 26671, GOST 32689.1, GOST 32689.2 ja GOST 32689.3.
7 Katse ettevalmistamine
7.1 Üldnõuded
Enne katsetamist viiakse läbi laboratoorsete klaasnõude esialgne ettevalmistamine, samuti reaktiivide ja abimaterjalide kvaliteedikontroll vastavalt standardite GOST 32689.1, GOST 32689.2 ja GOST 32689.3 nõuetele.
7.2 Abilahuste valmistamine
7.2.1 Mobiilse faasi A ettevalmistamine
1000 ml mahutavusega mõõtekolbi, mis on tihedalt suletud lihvkorgiga või fluoroplastist korgiga, pipetitakse 1 ml jää-äädikhapet, 100 ml metanooli ja täidetakse bidestilleeritud veega märgini. Segu segatakse põhjalikult.
Mobiilse faasi A kõlblikkusaeg toatemperatuuril - mitte rohkem kui üks kuu.
7.2.2 Liikuva faasi B ettevalmistamine
1000 ml mahuga mõõtekolbi, mis on tihedalt suletud lihv- või fluoroplastist korgiga, asetatakse pipetiga 1 ml jää-äädikhapet ja viiakse metanooliga märgini. Segu segatakse põhjalikult.
Mobiilse faasi B kõlblikkusaeg toatemperatuuril - mitte rohkem kui üks kuu.
MÄRKUS Liikuv faas ei tohi kokku puutuda kummi ja polümeersete materjalidega [välja arvatud polütetrafluoroetüleen (PTFE)].
7.2.3 Lahusti valmistamine 1
Segage sobivas anumas 99 mahuosa tolueeni ja üks mahuosa jää-äädikhapet. Segu segatakse põhjalikult.
Lahusti 1 kõlblikkusaeg toatemperatuuril ei ületa 6 kuud.
7.3 Magneesiumsulfaadi valmistamine
Ekstraheerimisel sorbendina kasutatav veevaba magneesiumsulfaat tuleb kuivatada isegi säilivusaja jooksul, et eemaldada imendunud õhuniiskus. Sorbenti kaltsineeritakse temperatuuril 180–200 °C 6–10 tundi ja hoitakse eksikaatoris veevaba kaltsiumkloriidi kohal. Reaktiivi sobivuse kriteeriumiks on täiendava vesikihi puudumine lahuse kuumutamisel, ekstraheerimisetapp viiakse läbi temperatuurini 30°C - 40°C ja 2-3 minuti pärast reaktsioonimass on. segati.
7.4 Mükotoksiini põhilahuste valmistamine
7.4.1 PAT lahuste valmistamine
7.4.1.1 PAT põhilahuse valmistamine, massikontsentratsioon 200 µg/cm
Võtke 2,0 mg puhast kristallilist PAT-d, mis on kaalutud 0,01 mg täpsusega, lahustage 10 ml mõõtekolvis väikeses koguses kloroformis ja viige seejärel lahuse maht kloroformiga märgini.
PAT esialgse lahuse säilivusaeg temperatuuril 0°C tihedalt alumiiniumfooliumisse mähitud jahvatatud korgiga klaasmõõtekolvis ei ole pikem kui 1 kuu.
7.4.1.2 PAT lahuse valmistamine, massikontsentratsioon 20 µg/cm
1 ml saadud PAT põhilahust (vt 7.4.1.1) kantakse 10 ml mõõtekolbi ja lahjendatakse kloroformiga märgini. PAT täpse massikontsentratsiooni määramiseks lahuses võetakse 5,0 ml saadud PAT standardlahust ja kantakse umbes 15 cm mahuga mahutisse, seejärel eemaldatakse kloroform lämmastikuga läbipuhumisega kuni kuivaine saamiseni. Kohe pärast kuivaine saamist lisatakse anumasse 5,0 ml absoluutset etanooli. Lahustage PAT täielikult. Saadud PAT-lahus viiakse kvartsküvetti optilise tee pikkusega 1 cm, seejärel registreeritakse lahuse spekter spektrofotomeetril lainepikkuste vahemikus 250–350 nm, kasutades kontrollküvetis absoluutset etanooli. .
PAT massikontsentratsioon lahuses, µg/cm, arvutatakse valemiga
kus on spektri optilise tiheduse maksimaalne väärtus (lainepikkus umbes 275 nm), ühikud. OP;
- PAT molekulmass, võrdne 153,1 g/mol;
- ümberarvestuskoefitsient;
- optilise neeldumise (ekstinktsiooni) molaarne koefitsient, võrdne 14600, m/mol.
7.4.1.3 100 µg/cm PAT lahuse valmistamine
5 ml PAT alglahust kloroformis massikontsentratsiooniga 200 µg/ml (vt punkt 7.4.1.1) viiakse 10 ml mahuga mõõtekolbi, kontsentreeritakse toatemperatuuril kuivaks jäägiks. lämmastikuga ja lahustatakse kohe uuesti atsetonitriilis, viies selle kolvis oleva mahuni märgistuseni.
7.4.1.4 PAT-lahuste kõlblikkusaeg vastavalt punktidele 7.4.1.2 ja 7.4.1.3 temperatuuril 0 °C jahvatatud korgiga klaasmõõtekolvis, mis on tihedalt alumiiniumfooliumi mähitud, ei ületa 24 tundi.
Enne kasutamist viiakse lahuste temperatuur toatemperatuurini (alumiiniumfooliumit mõõtekolvist eemaldada ei tohi enne, kui sisu on jõudnud toatemperatuurini). PAT hävitamise tõttu ei ole lubatud säilitada võrdlusproove õhukese kuivainekihina, mis on saadud pärast lahusti eemaldamist -.
7.4.2 OTA põhilahuse valmistamine
7.4.2.1 20 µg/ml OTA põhilahuse valmistamine
2,0 mg puhast kristalset OTA-d, kaalutud 0,01 mg täpsusega, lahustatakse 25 ml keeduklaasis koos lahustiga 1 (vt punkt 7.2.3) ja kantakse kvantitatiivselt üle 100 ml mõõtekolbi ja lahjendatakse lahustiga 1 kuni märgini.
OTA täpse massikontsentratsiooni määramiseks lahuses viiakse saadud OTA alglahus kvartsküvetti optilise tee pikkusega 1 cm, seejärel registreeritakse spektrofotomeetril lahuse spekter lainepikkuste vahemikus 300 kuni 370 nm, kasutades võrdlusküvetina lahustit 1.
OTA massikontsentratsioon alglahuses, μg/cm, arvutatakse valemiga
kus on spektri optilise tiheduse maksimaalne väärtus (lainepikkus on umbes 333 nm), ühikud. OP;
- OTA molekulmass, võrdne 402,7 g/mol;
- ümberarvestuskoefitsient;
- parandustegur, mis määratakse vastavalt A liitele;
- optilise neeldumise (ekstinktsiooni) molaarne koefitsient, võrdne 544, m/mol.
Originaalse OTA lahuse kõlblikkusaeg temperatuuril miinus 18°C jahvatatud korgiga klaasmõõtekolvis, mis on tihedalt alumiiniumfooliumi mähitud, ei ületa nelja aastat.
7.4.2.2 5 µg/ml OTA lahuse valmistamine
Tõmmatakse välja 2,5 ml OTA põhilahust (7.4.2.1), kantakse 10 ml mõõtekolbi ja lahjendatakse lahustiga 1 (7.2.3) märgini.
Tihedalt alumiiniumfooliumisse mähitud lihvitud korgiga klaasmõõtekolvis temperatuuril 4°C oleva OTA lahuse kõlblikkusaeg ei ületa 24 tundi.
Enne kasutamist viiakse lahuse temperatuur toatemperatuurini (alumiiniumfooliumit ei tohi mõõtekolvist eemaldada enne, kui sisu jõuab toatemperatuurini) -.
7.5 PAT ja OTA kalibreerimislahuste valmistamine
PAT ja OTA kalibreerimislahused valmistatakse nende põhilahuste (vt 7.4.1.1 ja 7.4.2.1) teatud koguses segamisel selitatud õunamahlaga, mis ei sisalda määratavaid analüüte.
7.5.1 PAT kalibreerimislahuste valmistamine
7.5.1.1 PAT-i massikontsentratsiooniga 1000 ng/cm vahelahuse valmistamine (lahus n-1)
1 ml PAT lahust (vt 7.4.1.3) või 1 ml PAT kompositsiooni standardproovi PAT massikontsentratsiooniga 100 µg/cm kantakse 100 ml mahuga mõõtekolbi. lahus reguleeritakse atsetonitriiliga märgini.
7.5.1.2 PAT-i massikontsentratsiooniga 10 ng/cm vahelahuse valmistamine (lahus n-2)
1 ml lahust -1 (vt punkt 7.5.1.1) kantakse 100 ml mõõtekolbi ja lahjendatakse atsetonitriiliga märgini.
7.5.1.3 PAT kalibreerimislahuste valmistamine
Valitud vastavalt tabelile 1 teatud kogused vahelahuseid n-1 ja n-2 (vt 7.5.1.1 ja 7.5.1.2) ja jaotada 10 ml mõõtekolbidesse.
Tabel 1 – Lahuste mahud n-1 ja n-2 PAT kalibreerimislahuste valmistamiseks
Indikaatori nimi | Kalibreerimislahendused |
||||||
Lahuse maht n-2 cm | |||||||
Lahuse maht n-1 cm | |||||||
Süstitud PAT kogus, ng | |||||||
PAT massikontsentratsioon lahuses, ng/cm | |||||||
7.5.2 OTA kalibreerimislahuste valmistamine
7.5.2.1 200 ng/ml OTA vahelahuse (lahus) valmistamine A-1)
1 ml 5 µg/ml OTA lahust (vt punkt 7.4.2.2) kontsentreeritakse toatemperatuuril lämmastikuvoolu all kuivaks ja kantakse kohe koos atsetonitriiliga 25 ml mõõtekolbi.
7.5.2.2 10 ng/ml OTA vahelahuse (lahus) valmistamine AGA-2)
0,5 ml OTA vahelahust AGA-1 (vt 7.5.2.1) kantakse 10 ml mõõtekolbi ja lahjendatakse atsetonitriiliga märgini.
7.5.2.3 OTA kalibreerimislahuste valmistamine
Valitud vastavalt tabelile 2 teatud kogused vahelahuseid AGA-1 ja AGA-2 (vt 7.5.2.1 ja 7.5.2.2) ja jaotada 10 ml mõõtekolbidesse.
Tabel 2 – Lahuste mahud AGA-1 ja AGA-2 OTA kalibreerimislahuste valmistamiseks
Indikaatori nimi | Kalibreerimislahendused |
||||||
Lahuse maht AGA-2 cm | |||||||
Lahuse maht AGA-1 cm | |||||||
Manustatud OTA kogus, ng | |||||||
OTA massikontsentratsioon lahuses, ng/cm | |||||||
Viige kolbides oleva lahuse maht selitatud õunamahla (või muu filtreeritud) mahlaga märgini.
Testimiseks HPLC-MS/MS-s süstitakse süsteemi 10 mm PAT ja OTA kalibreerimislahuseid, mis on valmistatud vastavalt punktidele 7.5.1.3 ja 7.5.2.3 ja kalibreeritud vastavalt punktile 7.7, võttes arvesse punkti 8.3.1 tingimusi.
Kalibreerimislahuse säilivusaeg lihvkorgiga klaasmõõtekolvis temperatuuril 0°C - 4°C ei ületa 24 tundi.
7.6 LC/MS/MS süsteemi ettevalmistamine
HPLC-MS/MS süsteemi ettevalmistamine mõõtmisteks toimub vastavalt kasutusjuhendile (juhendile) ja lisas B toodud teabele.
Massispektromeetri töörežiimide seadistamisel on soovitatav kasutada lisas B toodud mükotoksiinide määramise MS/MS parameetreid.
Sel juhul peavad olema täidetud järgmised tingimused:
- välisõhu temperatuur 20°С kuni 25°С;
- atmosfäärirõhk 84 kuni 106 kPa;
- pinge võrgus (220±10) V;
- voolu sagedus võrgus 49 kuni 51 Hz;
- suhteline õhuniiskus 40% kuni 80%.
7.7 HPLC-MS/MS süsteemi kalibreerimine
Süsteemi kalibreerimine mükotoksiinide lahustega mahlades vastavalt punktile 7.5 toimub vastavalt HPLC-MS/MS süsteemi kasutusjuhendile (juhendile) ja arvestades punkti 8.3.1 tingimusi üks kord kuus. PAT ja OTA piikide pindalad määratakse kromatogrammidel ja kalibreerimissõltuvus tehakse kindlaks piigi pindala põhjal kontsentratsioonivahemikus vastavalt punktile 7.5. Arvutage korrelatsioonikoefitsient ja mükotoksiinide massikontsentratsiooni arvutatud väärtuste kõrvalekalle igas kalibreerimispunktis tegelikust väärtusest vastavalt kalibreerimislahuste valmistamise protseduurile (vt 7.5). Kalibreerimine loetakse vastuvõetavaks, kui korrelatsioonikoefitsient on vähemalt 0,999 (PAT puhul) ja 0,965 (OTA puhul) ning massikontsentratsiooni arvutatud väärtuse suhteline hälve tegelikust väärtusest ei ole suurem kui ±10%.
Suhtelise hälbe asemel saab kalibreerimiskarakteristiku vastuvõetavust hinnata suhtelise standardhälbega, mis ei tohiks ületada 5%.
8 Testimine
8.1 Ekstraheerimine
10 ml () eelnevalt põhjalikult segatud mahlatooteid asetatakse keeratava korgiga tsentrifuugitorusse mahuga 50 ml. Katseklaasi lisatakse 20 ml atsetonitriili ja 15 g veevaba magneesiumsulfaati. Segu segatakse intensiivselt kolm kuni viis minutit käsitsi või loksuti abil. Pärast segamist tsentrifuugitakse saadud ekstrakti 10 minutit kiirusel 4000-5000 p/min toatemperatuuril või 5 minutit tsentrifuugi juuresolekul, jahutades temperatuuril 5 °C. Mõõtke ekstrakti kogumaht pärast tsentrifuugimist (). 18-19 cm () ekstrakti, mis on võetud pipeti või doseerimisseadmega, viiakse teravapõhjalisse kolbi mahuga 25 cm 1 cm () atsetonitriili.
Kui anuma seintel on lahustumatu karamellkile, hävitatakse see ultrahelivannis kolme kuni viie minuti jooksul. Lahus viiakse Eppendorf-tüüpi katsutisse mahuga 1,5-2,0 cm3 ja tsentrifuugitakse kiirusel 10 000-12 000 p/min 3-5 minutit. Ülemine kiht võetakse ja filtreeritakse läbi 0,2-0,4 µm poorisuurusega mikrofiltri otse 100-400 mm mahuga mikrotorusse. HPLC-MS/MS testi jaoks süstitakse süsteemi 10 mm ettevalmistatud proovi.
8.2 Proovide ettevalmistamine kontsentreeritud toodetest
Kontsentreeritud mahlad (püree) lahustatakse veega kuni lahustuvate kuivainete minimaalse tasemeni, mis on sätestatud regulatiivsetes dokumentides teatud tüüpi mahlatoote puhul. Kontsentreeritud mahlatooted, mille puhul ei ole ette nähtud lahustuva kuivainete miinimumtaset, taastatakse bidestilleeritud veega 11,2% lahustuvate kuivainete sisalduseni. Lahustuvate kuivainete sisaldust kontrollitakse vastavalt standardile GOST 29030.
Taastatud proovide ekstraheerimine toimub vastavalt punktile 8.1.
8.3 Mõõtmiste tegemine
8.3.1 Üldtingimused
Vastavalt punktile 8.1 valmistatud proovid ja kalibreerimislahused süstitakse valitud järjekorras. Kõige tavalisem meetod on see, kui kalibreerimislahuste süstimisega alustatakse ja lõpetatakse proovisüstide seeria.
HPLC-MS/MS süsteem peab olema seadistatud SRMüleminekutega, mis tagavad analüüsitud mükotoksiinide selektiivse tuvastamise. Retentsiooniajad ja piikide pindalad määratakse analüüsi tulemuste salvestamiseks ja arvutamiseks mõeldud analüüsitarkvara abil, mis on ühendatud HPLC-MS/MS süsteemiga. HPLC/MS/MS süsteemide, eraldustingimuste ja massispektromeetrilise tuvastamise näited on toodud lisas B.
Proove testitakse korratavuse tingimustes kahe paralleelse määramise jaoks vastavalt standarditele GOST ISO 5725-1 (alajaotis 3.14) ja GOST ISO 5725-2.
8.3.2 Mükotoksiinide tuvastamine
Mükotoksiinide tuvastamiseks võrreldakse proovilahustest saadud retentsiooniaegu vastavate mükotoksiinide peetumisaegadega kalibreerimislahustest. Mükotoksiinide olemasolu kinnitamiseks võrreldakse esimese ja teise signaali intensiivsuse suhet. m/z-üleminek kalibreerimislahuste mükotoksiini signaalide intensiivsuse suhtega.
Ühe mükotoksiini piikide suhe ei tohiks erineda signaali intensiivsuse eeldatavast suhtest rohkem kui 20%.
9 Testitulemuste töötlemine ja esitamine
9.1 Kvantifikatsioon
Mükotoksiinide kvantifitseerimine valmistatud ekstrakti süstitud mahus (vt punkt 8.1) viiakse läbi mükotoksiini piigi pindala (või kõrguse) võrdlemisel selle mükotoksiini vastava kalibreerimiskarakteristikuga.
Mükotoksiinide massikontsentratsioon testitud toodetes, µg/dm, arvutatakse valemiga
kus on ümberarvestuskoefitsient kuupsentimeetritest kuupdetsimeetriteks;
- mükotoksiini kontsentratsioon ekstrakti mahus 10 mm, mis on süstitud HPLC-MS/MS süsteemi, määratakse kalibreerimise sõltuvuse järgi, ng;
on atsetonitriili maht, milles ekstrakt pärast kontsentreerimist uuesti lahustati, cm;
- ekstrakti kogumaht, millest kontsentreerimiseks ruumala võetakse, cm;
- kromatograafi sisestatud proovi maht (=10 mm), mm;
- testimiseks võetud mahlatoodete proovi maht, cm;
on kontsentreerimiseks valitud ekstrakti maht, vt
Mükotoksiinide koguse arvutamisel kontsentreeritud mahlatoodetes võetakse arvesse veega lahjendusastet vastavalt punktile 8.2.
Mõõtmistulemus võetakse kolme paralleelse määramise tulemuste aritmeetiliseks keskmiseks, kui aktsepteerimise tingimus on täidetud
kus , on kolme paralleelse määramise tulemuse maksimum- ja miinimumväärtused, µg/dm;
, , - kolme paralleelse määramise tulemused, µg/dm;
- kriitilise vahemiku väärtus, %.
Samas laboris tehtud kolme paralleelse määramise lahknevus (protsendina keskmisest väärtusest) ei tohiks ületada korratavuse (konvergentsi) piiri, mis on võrdne 3,6· tõenäosusega = 0,95. Kui see tingimus on täidetud, võetakse lõplikuks mõõtmistulemuseks kolme paralleelse määramise aritmeetiline keskmine, ümardatuna ülespoole kolmanda kümnendkohani.
Mõõtmistulemused registreeritakse protokollis vastavalt standardile GOST ISO / IEC 17025.
9.2 Kui saadud tulemus näitab, et mükotoksiinide sisaldus ületab kalibreerimissõltuvuse vahemiku ülemise piiri, valmistada ette uus proov, suurendades selle lahjendamist veega, ja mõõta uuesti.
10 Metroloogilised omadused
PAT ja OTA meetodi metroloogilised omadused vastavad tabelis 3 toodud tingimustele.
Tabel 3 – HPLC-MS/MS meetodi täpsus
Mõõtevahemik, µg/dm | Korratavuse suhteline standardhälve, % | Reprodutseeritavuse suhteline standardhälve, % |
PAT määramisel (mitte enam) |
||
OTA määramisel (mitte enam) |
||
PAT ja OTA tuvastamise piirid mahlatoodete proovides on järgmised: LOD- 0,03 mcg/dm, LOQ- 0,1 mcg / dm.
11 Mõõtmistulemuste kvaliteedikontroll
Mõõtmistulemuste kvaliteedikontroll laboris hõlmab mõõtetulemuste stabiilsuse jälgimist, kasutades vahetäpsuse standardhälbe stabiilsuskontrolli. Stabiilsustestid viiakse läbi Shewharti kontrollkaartide abil. Teostatud mõõtmiste tulemuste stabiilsuse jälgimise sagedus on reguleeritud kvaliteedisüsteemi sisedokumentides. Mitterahuldavate kontrollitulemuste korral, näiteks tegevuspiiri ületamisel või hoiatuslimiidi regulaarsel ületamisel, selgitatakse välja nende kõrvalekallete põhjused, sh vahetatakse reaktiive, kontrollitakse operaatori tööd.
GOST 12.1.007.
TÄHELEPANU! Mükotoksiinidega töötamisel tuleb arvestada, et PAT ja OTA on tugevate toksiliste omadustega, millel on väljendunud nefrotoksiline, immunotoksiline, teratogeenne ja genotoksiline toime. Vastavalt klassifikatsioonile IARC OTA viitab inimesele potentsiaalselt ohtlikele kantserogeenidele (rühm 2B). Mükotoksiinidega töötamisel tuleb järgida suuremaid ettevaatusabinõusid. Laboritöötajad peaksid kandma kaitseriietust, sealhulgas näokaitset, kindaid ja kaitseprille. Kõik toimingud mükotoksiinidega tehakse tõmbekapis. Pärast töö lõpetamist desinfitseeritakse kasutatud laboriklaasid ja jäätmed.
Lisa A (kohustuslik). Spektrofotomeetri kontrollimine ja parandusteguri CF määramine mükotoksiinide massikontsentratsioonide arvutamiseks standardlahustes
Lisa A
(kohustuslik)
Spektrofotomeetri kontrollimine ja parandusteguri määramine mükotoksiinide massikontsentratsioonide arvutamiseks standardlahustes
A.1 Mükotoksiinide massikontsentratsioonide määramiseks põhilahustes (vt punktid 7.4.1.1 ja 7.4.2.1) kasutage spektrofotomeetrit, mis sobib lahuste optilise tiheduse mõõtmiseks kvartsküvetis, mille optilise tee pikkus on lainepikkuste vahemikus 1 cm. 200 nm kuni 400 nm.
Spektrofotomeetri kalibreerimine toimub järgmiselt.
Mõõtke kaaliumdikromaadi (KCrO) kolme lahuse optiline tihedus väävelhappes (HSO) - 0,25; 0,125 ja 0,0625 mmol / dm maksimaalsel neeldumispunktil (lainepikkus umbes 350 nm), kasutades kontrollina väävelhappe (HSO) lahust kontsentratsiooniga 0,009 mmol / dm.
Seejärel arvutatakse iga kaaliumdikromaadi kontsentratsiooni kohta optilise tiheduse molaarkoefitsient m/mol vastavalt valemile
kus on väävelhappes oleva kaaliumdikromaadi lahuse optilise tiheduse mõõdetud väärtus vastava kontsentratsiooni korral ühikutes. OP;
- kaaliumdikromaadi lahuse kontsentratsioon väävelhappes, mmol/dm.
Kui erinevus kolme mõõdetud väärtuse vahel on väljaspool optilise tiheduse mõõtmise täpsuse garanteeritud vahemikku, tuleks kontrollida kalibreerimisprotseduuri või -seadmeid. Arvutage aritmeetiline keskmine.
Määrake konkreetse varustuse (spektrofotomeeter ja küvett) parandustegur (mõõtmeteta väärtus) valemi järgi
kus on kaaliumdikromaadi (KCrO) lahuste optilise molaarse tiheduse koefitsiendi iseloomulik väärtus, m/mol;
- optilise tiheduse molaarkoefitsient, arvutatud valemi (A.1) järgi, m/mol.
Kui saadud parandusteguri väärtus on väiksem kui 0,95 või suurem kui 1,05, siis tuleb kõrvalekallete kõrvaldamiseks kontrollida kalibreerimisprotseduuri või seadmeid (kalibreerimiseks ja puhtuseks kasutatakse sama küvettide komplekti) -.
Lisa B (informatiivne). Näited HPLC-MS/MS süsteemide kohta mükotoksiinide määramiseks mahlades ja muudes mahlatoodetes*
Lisa B
(viide)
________________
* Need näited on soovitatavad ja esitatud selle rahvusvahelise standardi kasutajate mugavuse huvides.
B.1 HPLC-MS/MS süsteem nr 1
Riistvaraplatvorm: Varian 320-MS LC/MS/MS.
Iooniline