Mikotoksīnu noteikšanas metodes. Laboratorijas metodes mikotoksikozes diagnostikai. Mikotoksīni un to noteikšanas metodes

Pēc kucēnu piedzimšanas kucei un viņas saimniekiem sākas atbildīgs periods, kad jārūpējas ne tikai par kucēnas, bet arī jaundzimušo mazuļu barošanu un veselību. Pēc kucēnu piedzimšanas pirmajās divās dienās kucei var būt slikta apetīte, gremošanas traucējumi, īpaši, ja viņa ēda daudz pēcdzemdību.

Atcerieties, ka šajā periodā nevajadzētu ķerties pie antibiotikām - tas negatīvi ietekmēs mazuļa veselību. Mēģiniet iztikt ar drošākām zālēm (piemēram, augiem, probiotikām, kuņģa skalošanu, aktivēto ogli un vēlams lignitīnu). Ļoti labus rezultātus šajā gadījumā iegūst, lietojot absolūti nekaitīgus homeopātiskos preparātus no Heel, un nav jāmeklē veterinārie, “cilvēki” strādā ne sliktāk. Izmēģiniet vienu vai divas subkutānas Echinacea compositum, Nux vomica, Berebe-ris-hommacord injekcijas. Labus rezultātus iegūst, lietojot zāles viena un tā paša uzņēmuma Diar-heel tabletēs. Zāles lieto 3 reizes dienā, 1 tablete. Rezultāti ir labāki, ja to iepriekš izšķīdina 1,5 ēdamkarotes vārīta ūdens un rūpīgi samaisa.

Pirmajās trīs dienās pēc dzemdībām barojot ir jābūt uzmanīgiem, lai nepasliktinātu iespējamos traucējumus. Ārzemju autori šajā periodā iesaka kucei dot vārītas mazas vistas, kas samaltas kopā ar kauliem un sajauktas ar vārītiem rīsiem.

Jau pēc pirmajām dienām pēc dzemdībām kucei manāmi uzlabojas apetīte, un tas ir gluži dabiski – viņas organisma vajadzības manāmi pieaug. Vispirms sāk aktīvi ražot jaunpienu un pēc tam pienu. Lielā mērā piena daudzums un kvalitāte ir atkarīga ne tikai no kuces individuālajām īpašībām, bet arī no viņas barošanas.

Pirmajā nedēļā barības daudzums 1,5 reizes pārsniedz parasto diētu. Bet šajā periodā kucei nevajadzētu dot pārāk daudz gaļas, lai neizraisītu eklampsiju. Kā olbaltumvielu sastāvdaļu šajā laikā varat dot zivis vai biezpienu. Barojiet kuci bieži (ik pēc 4-5 stundām), mazās porcijās. Pēc tam, kad ir atjaunota normāla kuņģa darbība, jāatsāk dot minerālvielu piedevas un līdzekļus kažoka nostiprināšanai.

• gaļa, zivis un subprodukti - 45%,
• graudaugi - 30%,
• piens un piena produkti - 10%,
• dārzeņi - 15%.

Lai laktējošai kucei būtu vairāk piena, viņas uzturā jāiekļauj barība, kas veicina laktāciju: neapstrādāti burkāni, gaļa, zivis, buljons, auzu pārslas utt. Cik bieži vien iespējams, piedāvājiet kucei dzert: pienu (ja tas ir nerada traucējumus), tēja ar pienu, vāja kafija ar pienu. Lai palielinātu piena daudzumu, varat izmēģināt sekojošo:

• oregano novārījums;
• citronu balzama novārījums: vienu tējkaroti zāles aplej ar divām glāzēm verdoša ūdens, ļauj uzvārīties, pievieno cukuru;
• divas tējkarotes tējas ievieto termosā, ielej divas tases verdoša piena, ļauj ievilkties 3-4 stundas, tad pievieno cukuru un atdzesē;
• anīsa novārījums.

Apilac, ko daudzi saimnieki dod kucēm laktācijas palielināšanai, manā praksē nedeva vēlamos rezultātus, lai gan mēģināju dot dažādām kucēm.

Ja suns kategoriski atsakās dzert, jūs, protams, varat mēģināt viņu piespiest dzert, taču labāk vispirms mēģināt viņu “piemānīt”, ieliekot nelielu gabaliņu sviesta vēl pietiekami siltā dzērienā. Ļoti iespējams, ka sviesta smarža viņu savaldzinās.

Lai novērstu kuces spēku izsīkumu, viņas barošanai šajā periodā jābūt pilnīgai un barībai jāsatur pietiekams daudzums kaloriju, olbaltumvielu, vitamīnu un minerālvielu.

Tomēr visā laktācijas periodā barības daudzums nav nemainīgs. Kā jau minēts, pirmajā nedēļā diēta jāpalielina 1,5 reizes. Palielinoties piena daudzumam kucē, jāpalielina arī barības deva: otrajā nedēļā devu vajadzētu dubultot, bet no trešās nedēļas līdz laktācijas beigām - trīskāršot: Salīdzinājums tiek veikts ar uzturu. suns normālā stāvoklī. Kucei nepieciešamais barības daudzums ir atkarīgs no viņas metiena lieluma. Četriem kucēniem metienā barība jāpalielina 2 reizes, bet astoņiem kucēniem - vismaz trīs reizes.

Parasti kuce kucēnus baro 4-6 nedēļas. Kuces izdalītā piena daudzums nav nemainīgs visā laktācijas periodā. Līdz 20-25 dienai piena daudzums palielinās, un pēc tam samazinās. Rietumu eksperti piedāvā ļoti vienkāršu veidu, kā aprēķināt barības kaloriju saturu šajā periodā. Šī metode sastāv no visa metiena nosvēršanas 3-4 dienu vecumā, pievienojot kuces uzturam 250 cal papildu enerģijas uz katru kilogramu kucēnu un atbilstoši tam palielinot barības daudzumu un kaloriju saturu.

Laktācijas ilgums ir atkarīgs no suņa individuālajām īpašībām un barošanas. Katrā gadījumā, protams, jāņem vērā suņa individuālās īpašības. Ir kucēni, kuras kucēni burtiski “izsūc”, tās ilgstoši, lielos daudzumos ražo pienu un baro kucēnus līdz diviem mēnešiem. Protams, viņu barībai vajadzētu būt lielākai un pilnvērtīgākai nekā kucēm, kurām ir maz piena pat pašā “piena ražošanas maksimumā”, kas sakrīt ar 14.-17. laktācijas dienu un kuru saimniece vienkārši sapņo, ka pabaros. bērniem līdz trīs nedēļām. Lielā mērā kuces piena ražošanu ietekmē pilnvērtīga olbaltumvielu diēta, kas bagāta ar neaizstājamām aminoskābēm. Aminoskābju trūkums galvenokārt ietekmē piena kvalitāti, kā arī tā daudzumu, un tas izraisa kucēnu augšanas ātruma samazināšanos un palēnina to attīstību.

Vitamīniem ir liela nozīme arī kucēm laktācijas periodā. Tās vajadzīgas ne tikai pašām kucēm, bet arī kucēnu attīstībai. Ir jānodrošina, lai kuce saņemtu nepieciešamo vitamīnu daudzumu visā laktācijas periodā. Piemēram, kucēnu augšanai tik nepieciešamā A vitamīna saturs pienā ir atkarīgs tikai no tā klātbūtnes mātes barībā*. Tāpēc īpašniekam jāuzrauga pastāvīga šī vitamīna klātbūtne barojošas kuces uzturā. Tas attiecas arī uz D vitamīnu un B vitamīniem, kas lielos daudzumos izdalās ar suņa pienu.

Kucei piena ražošanai nepieciešams tāds pats papildu enerģijas daudzums, kāds ir izdalītajā pienā. Tāpēc uztura enerģētiskā vērtība galvenokārt būs atkarīga no kuces piena daudzuma. Barības kaloriju saturs ir atkarīgs arī no laktācijas perioda. Zināms, ka pirmajā un otrajā laktācijas nedēļā kuce ražo mazāk piena nekā trešajā un ceturtajā. Tāpēc uzturs jāveido tā, lai laktācijas perioda pirmajā pusē barības enerģētiskā intensitāte palielinātos 2 reizes, otrajā - 3 reizes, salīdzinot ar kuces vajadzību normālā stāvoklī. Praksē tas izskatās šādi: piena veidošanai laktācijas pirmajā pusē laktējošai kucei ar ķermeņa masu 10 kg papildus galvenajai ir nepieciešama papildu diēta ar kaloriju saturu 750 kcal, un nākamās divas nedēļas - 1500 kcal dienā.

Tūlīt pēc dzemdībām sievietes piena dziedzeri izdala jaunpienu. Ir jānodrošina, lai katrs jaundzimušais kucēns saņemtu jaunpienu, kas satur specifiskas antivielas.

Liela nozīme piena veidošanā ir minerālvielām, kuru trūkums izraisa dažāda veida osteodistrofiskas slimības ne tikai laktējošām kucēm, bet arī pēcnācējiem. Tajā pašā laikā mātīšu laktācijas periodā mugurkauls ir noplicināts ar minerālvielām un kļūst porains, trausls, parādās osteoporoze un rahīts jaundzimušajiem kucēniem. Svarīgi ir novērst minerālvielu rezervju uzkrāšanos grūsnības laikā, bet jaunām kucēm – augšanas periodā un sagatavošanās pirmajai laktācijai. Laktējošām kucēm ir nepieciešams vairāk sāls nekā nelaktējošām kucēm.

Barības kvalitatīvais sastāvs un dienas enerģētiskā intensitāte laktējošām kucēm, kuru svars ir 5 kg, pirmajā-otrajā un trešajā-ceturtajā laktācijas nedēļā

Barības kvalitatīvais sastāvs un ikdienas enerģētiskā intensitāte laktējošām kucēm, kuru svars ir 15 kg, pirmajā-otrajā un trešajā-ceturtajā laktācijas nedēļā

Barības kvalitatīvais sastāvs un ikdienas enerģētiskā intensitāte laktējošām kucēm, kuru svars ir 25 kg, pirmajā-otrajā un trešajā-ceturtajā laktācijas nedēļā

Mikotoksīnu noteikšanas metodes

Mūsdienu metodes mikotoksīnu satura noteikšanai un noteikšanai pārtikā un barībā ietver skrīninga metodes, kvantitatīvās, analītiskās un bioloģiskās metodes. Mikotoksīnu metodoloģija attīstās ļoti strauji. Izstrādāto metožu un dažādu modifikāciju skaits jau sasniedzis vairākus simtus un turpina pieaugt.

Skrīninga metodes, ko raksturo analīzes vienkāršība un ātrums, ļauj ātri un droši "izsijāt" nepiesārņotos paraugus. Tie ietver plaši izmantotas metodes, piemēram, aflatoksīnu, ohratoksīna A un zearalenona testu mini kolonnā; TLC metodes līdz 30 dažādu mikotoksīnu vienlaicīgai noteikšanai; fluorescējošā metode piesārņojuma noteikšanai ar aflatoksīniem utt.

Kvantitatīvās analītiskās metodes mikotoksīnu noteikšanai var iedalīt ķīmiskajā, radioimūnķīmiskajā un enzīmu imūntestā. Ķīmiskās metodes pašlaik ir visizplatītākās un ietver secīgus izolācijas posmus un pareizu mikotoksīnu kvantitatīvo noteikšanu. Izolācijas posms sastāv no diviem posmiem: ekstrakcija - mikotoksīna atdalīšana no substrāta un attīrīšana - mikotoksīna atdalīšana no savienojumiem ar līdzīgām fizikālajām un ķīmiskajām īpašībām. Galīgo mikotoksīnu atdalīšanu veic, izmantojot vienas vai divdimensiju plānslāņa hromatogrāfiju (TLC) uz silikagela plāksnēm dažādās šķīdinātāju sistēmās, gāzu un gāzu-šķidruma hromatogrāfijā, augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijā un masas spektrometrijā. Mikotoksīnu kvantitatīvo noteikšanu parasti veic, tieši salīdzinot fluorescences intensitāti TLC ultravioletajā gaismā ar zināmas koncentrācijas standartiem gan vizuāli, gan densitometriski. Lai uzlabotu metožu ticamību, tiek izmantoti dažādi apstiprinoši testi, kuru pamatā ir mikotoksīnu atvasinājumu sagatavošana ar citām hromatogrāfiskām, kolorimetriskām vai fluorimetriskām īpašībām.

Pēdējos gados ir raksturīga pastiprināta uzmanība ļoti jutīgu un ļoti specifisku radioimūnķīmisko un enzīmu imūntestu metožu izstrādei mikotoksīnu noteikšanai, identificēšanai un kvantitatīvai noteikšanai. Šo metožu pamatā ir antiserumu iegūšana pret mikotoksīnu konjugantiem ar liellopu seruma albumīnu. To priekšrocība ir to izcilā jutība, kas ļauj noteikt mikotoksīnu pikogrammas un veikt attīstību noteikšanas procesa automatizācijas virzienā. Bioloģiskās metodes, kas parasti nav īpaši specifiskas un jutīgas, galvenokārt tiek izmantotas, lai noteiktu mikotoksīnus, kuriem nav pieejamas ķīmiskās analīzes metodes, vai kā apstiprinošus testus. Kā testa objekti kalpo dažādi mikroorganismi, vistu embriji, daudzi laboratorijas dzīvnieki, šūnu un audu kultūras.

Lai noteiktu mikotoksīnu saturu pārtikas produktu sastāvā, paraugu sagatavošanu veic ar cietās fāzes ekstrakcijas metodi uz koncentrēšanas kārtridžiem "Diapak" (3.2.3. lpp.). Mikotoksīnu atdalīšana, identifikācija un kvantitatīvā noteikšana sagatavotajos paraugos tiek veikta ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju uz Milichrome-5 sērijas mikrokolonnu hromatogrāfa modulārā konstrukcijā (12. att.).

Rīsi. 12. Mikrokolonnu hromatogrāfs

Rakstā aplūkota HPLC apgrieztās fāzes versija patulīna noteikšanai. Noteikšanu veic pie viļņa garuma 276 nm. Precīzai patulīna identificēšanai tiek izmantota arī daudzviļņu garuma noteikšana, kas ļauj izmantot spektrālās attiecības kā papildu identifikācijas parametru. Atdalīšana tiek veikta gradienta eluēšanas režīmā, kas uzlabo analīzes izšķirtspēju un jutīgumu.

Rīsi. 13. Šķidruma hromatogrāfs:

1 - sūknis; 2 – parauga iesmidzināšanas vienība; 3 – hromatogrāfijas kolonna; 4 - detektors;
5 - notekcaurule eluātam vai kolektors frakcijām; 6 - reģistrators (reģistrators,
integrators vai personālais dators)

6
4

Parauga analīze, izmantojot šķidruma hromatogrāfu (13. attēls), tiek veikta šādi. Noteiktu daudzumu analizētā parauga šķīduma ievada hromatogrāfijas kolonnas (3) augšējā daļā, izmantojot parauga ievadīšanas ierīci (2). Izmantojot sūkni (1), analizēto maisījumu iesūknē ar eluentu caur hromatogrāfijas kolonnu (3), kurā analizējamo maisījumu sadala atsevišķās frakcijās (komponentos). No kolonnas plūstošo eluātu, kas satur atdalītās sastāvdaļas, analizē ar detektoru (4), kura rādījumus reģistrē reģistrators (6).

1. 
   HPLC metodiskie pamati

Lai saprastu patulīna noteikšanai izmantotās HPLC metodes būtību, ir jāizpēta daži metodoloģiskie aspekti, kas ir tās pamatā.

Eluotropiskā sērija. Eluenta eluēšanas spēja ir eluenta (šķīdinātāja vai šķīdinātāju maisījuma) spēja izspiest adsorbātu no adsorbenta virsmas. Šajā gadījumā, jo spēcīgāk eluenta molekulas tiek adsorbētas uz sorbenta aktīvajām vietām, jo ​​lielāka ir tā eluēšanas spēja. Šķīdinātāji, kas sakārtoti pēc kārtas, palielinot eluēšanas spēku, veido eluotropu sēriju.

Kā eluenti apgrieztās fāzes hromatogrāfijai tiek izmantoti šķīdinātāju maisījumi, kas satur ūdeni un organiskos savienojumus, kas modificē eluēšanas stiprumu - n-spirtus, acetonitrilu, tetrahidrofurānu un citus, kas veido īstus šķīdumus ar ūdeni. Normālās fāzes hromatogrāfijā kā eluenti tiek izmantoti polārie modifikatori - lineārie un cikliskie ogļūdeņraži (heksāns, cikloheksāns, heptāns utt.).

Šķidruma hromatogrāfu detektori. Šobrīd ir izstrādāti vairāk nekā 20 HPLC detektori. Pieci ir visplašāk izmantotie, no kuriem trīs ir optiski un divi ir elektroķīmiski. Šie pieci detektori ļauj analizēt visas organisko un neorganisko vielu klases.

Optiskie detektori ietver spektrofotometrisko detektoru (ultravioletais (UV), kas darbojas viļņu garuma diapazonā)
200–360 nm un redzami ar viļņu garuma diapazonu 360–780 nm), fluorimetriskie un refrakcijas indeksa detektori; uz elektroķīmiskiem – voltammetriskiem un konduktometriskiem detektoriem. Īpaši svarīgs ir masas spektrometriskais detektors, kuram ir unikāls informācijas saturs, jo tas ļauj identificēt hromatogrāfiski atdalītas sastāvdaļas, izmantojot vielu masas spektru datu bāzes.

Spektrofotometriskais detektors ir visizplatītākais HPLC detektors. Tās darbības princips ir balstīts uz labi zināmo Bouguer-Lambert-Beer gaismas absorbcijas likumu. Spektrofotometriskais detektors reģistrē vielas starojuma selektīvās absorbcijas spektrus. Absorbcijas spektri ir atkarīgi no pētāmās vielas struktūras. Tas ļauj identificēt vielu pēc tās spektra, kam ir spektru vai standartu bibliotēka. Saskaņā ar Bouguer-Lambert-Beer likumu spektrālo joslu intensitāte ir atkarīga no vielas koncentrācijas, kas ir kvantitatīvās analīzes pamatā, t.i., vielas koncentrācijas noteikšanai.

Ļaujiet monohromatiskajai gaismai no avota ar intensitāti es 0 krīt uz grāvja ar garumu l (optiskais ceļš). Kivete ir piepildīta ar vielas šķīdumu ar koncentrāciju NO. Viela spēj absorbēt monohromatisko starojumu. Konkrētā monohromatiskā starojuma absorbcijas spējas mērs ir vērtība ε ir molārās absorbcijas koeficients vai ekstinkcijas koeficients. No kivetes ar intensitāti izplūst novājināts gaismas stars es. Saskaņā ar likumu par gaismas absorbciju viļņa garumā λ= konst

es= es 0 ∙10 -ε Cl , (7)

kur es ir gaismas plūsmas intensitāte pēc izlaišanas cauri kivetei;
es 0 ir krītošās gaismas plūsmas intensitāte; ε ir ekstinkcijas koeficients; NO ir vielas molārā koncentrācija kivetē; l ir kivetes garums.

Attieksme es uz es 0, kas izteikts procentos, sauc par pārraidi T un vērtību A=lg(I 0 / es) - optiskais blīvums.

A=lg(I 0 /I)= ε С∙l. (8)

Vielas optiskais blīvums ir tieši proporcionāls analizējamās vielas koncentrācijai. Spektrofotometriskajos detektoros analītiskais lielums ir optiskais blīvums BET. Formula (8) kalpo par pamatu kvantitatīvās analīzes veikšanai, izmantojot spektrofotometrisko detektoru, jo optiskais blīvums BET viela ir tieši proporcionāla hromatogrāfiskās pīķa augstumam vai laukumam.

Optiskā blīvuma atkarība BET no gaismas viļņa garuma, kas krīt uz kiveti ar vielu viļņu garuma diapazonā no 190 līdz 360 nm, sauc par ultravioletās absorbcijas spektru (14. att.).

200 230 260 290 320 350 λ , nm

BET, f.r.p.
Rīsi. 14. Ūdens šķīduma ultravioletās absorbcijas spektrs
vielas X

3.2.3. Parauga sagatavošana

Jebkurai vielai ir maksimālās absorbcijas viļņa garums
(λ , nm). Izmantojot šo viļņa garumu, detektoram ir zemākais slieksnis vielas noteikšanai.

Izmantojot spektrofotometrisko detektoru (SPD), tiek atklāts liels skaits dažādu klašu vielu, kas absorbē ultravioleto gaismu.

Spektrofotometriskā detektora izmantošana hromatogrāfijā ievērojami atvieglo identifikāciju. Vairāku viļņu garumu detektors apvienojumā ar programmatūru ļauj iegūt hromatogrammu vairākos viļņu garumos vienlaikus un aprēķināt papildu parametru komponentu identificēšanai - spektrālsattieksme (J) ir hromatogrāfiskās pīķa augstumu attiecība dažādos viļņu garumos

kur BET 1 un BET 2 - optiskā blīvuma koeficienti pie viļņa garuma 1 un 2. Vērtība J katrai vielai ir nemainīgs raksturlielums un nav atkarīgs no tās koncentrācijas. Spektrālo attiecību precizitāte ir atkarīga no vielas optiskā blīvuma vērtībām un detektora konstrukcijas.

Paraugu sagatavošana, izmantojot cietās fāzes ekstrakcijas metodi uz koncentrēšanas kasetnēm, ietaupa laiku un darbaspēka izmaksas. Cietās fāzes ekstrakcija ļauj koncentrēt paraugu un attīrīt to no pavadošajiem piemaisījumiem. Sarežģītā cietās fāzes ekstrakcijas shēma paredz divu kasetņu secīgu izmantošanu:

– universālā koncentrējošā kasetne “DIAPAK P-Z” – atkārtoti lietojama kārtridžs (līdz 50 paraugiem) ar augšējo un apakšējo filtru komplektu (10 gab.);

– universāla kārtridžs smalkai tīrīšanai “DIAPAK S” – vienreizējās lietošanas kārtridžs.

Priekš koncentrēšanas kārtridžu sagatavošana jums jāveic šādas darbības.

Priekš koncentrējošās kasetnes "DIAPAK P-Z" sagatavošana:

- caur kārtridžu izsūknējiet 10 ml ūdens-acetonitrila maisījuma (58:42);

– tieši pirms parauga sagatavošanas caur kārtridžu iesūknējiet 10 ml destilēta ūdens.

Priekš koncentrējošās kasetnes sagatavošana "DIAPAK S":

- izsūknējiet 5 ml benzola caur kārtridžu un pievienojiet kārtridžu abos galos.

Pārtikas produkta sagatavošana koncentrēšanai

Paraugu, kas sver 10,0 g, ievieto stikla vārglāzē, sajauc ar nelielu daudzumu destilēta ūdens un kvantitatīvi pārnes 50 ml mērkolbā. Kolbā pievieno 6,0 ml Karesa I šķīduma un Karesa II šķīduma. Kolbas saturu uzpilda līdz atzīmei ar destilētu ūdeni, rūpīgi samaisa un filtrē mērcilindrā caur papīra kroku filtru. Izmēra tīrā filtrāta P tilpumu.

Gatavojot dzidrinātas sulas un dzērienus, paraugu filtrē caur blīvu papīra filtru, līdz iegūst 20 ml dzidra filtrāta P.

Parauga koncentrācija uz kasetnes "DIAPAK P-Z"

Uzklājiet visu filtrāta P tilpumu iepriekš sagatavotajā kārtridžā ar ātrumu 1–2 pilieni sekundē.

Izskalojiet kārtridžu ar 5 ml divreiz destilēta ūdens, izmetot visas mazgāšanas reizes.

Elutē patulīnu no 10 ml etilacetāta kārtridža kolbā vai mērinstrumentā ar aizbāzni, kas satur 5 ml
1,5% nātrija karbonāta ūdens šķīdums, aizbāzni, enerģiski samaisa un ļauj nolobīties.

Samontējiet žāvēšanas kolonnu, piepildot filtra korpusu ar aptuveni 2 g bezūdens nātrija sulfāta, sablīvējiet žāvēšanas līdzekli, piesitot pie kolonnas sienas, un nostipriniet ar vates tamponu.

Augšējo etilacetāta slāni dekantē ar pipeti, filtrē caur žāvēšanas kolonnu, savācot filtrātu 50 ml sirds formas kolbā; papildus ekstrahē nātrija karbonāta ūdens šķīdumu vispirms ar 10 ml un pēc tam ar 5 ml etilacetāta un pēc atdalīšanas secīgi filtrē dekantētos etilacetāta daudzumus caur žāvēšanas kolonnu tajā pašā kolbā.

Etilacetātu iztvaicē vakuumā temperatūrā, kas nepārsniedz 40°C, līdz apmēram 0,5 ml tilpumam (neiztvaicē līdz sausumam!), Pievieno 2,5 ml benzola (ievēro tilpuma attiecību 1:5).

Parauga tīrīšana uz kasetnes "DIAPAK S"

Noņemiet vāciņus no sagatavotās kasetnes un izlaidiet benzola-etilacetāta parauga šķīdumu ar ātrumu 1-2 pilieni sekundē. Nomazgājiet kolbu ar vēl 0,5–1,0 ml benzola-etilacetāta (85:15) un uzklājiet uz kasetnes, izmetot mazgāšanas līdzekli.

Eluējiet patulīnu no 6 ml kārtridža ar benzolu:etilacetātu (7:3), savācot eluātu serdes noņemšanas kolbā.

Iztvaicē eluātu sausā gaisa vannā temperatūrā, kas nepārsniedz 40°C.

Tūlīt! Pēc iztvaicēšanas paraugu atkārtoti izšķīdina 0,2–0,25 ml eluenta A (3.2.4.2. sadaļa), kas atdzesēts līdz 5–8 °C.

3.2.4. Darba kārtība

Mērķis– mikotoksīna patulīna satura noteikšana pārtikas produktu sastāvā ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju uz Milichrom-5 sērijas mikrokolonnu hromatogrāfa.

3.2.4.1. Mērīšanas tehnika

Mērījumi ietver šādas galvenās darbības:

- hromatogrāfa kalibrēšana pēc šķīdumiem ar zināmu patulīna masas koncentrāciju;

- pārtikas parauga sagatavošana ar cietās fāzes ekstrakcijas metodi saskaņā ar punktiem. 3.2.3.;

– ekstrakta analīze ar HPLC ar signāla reģistrāciju ar UV detektoru;

– patulīna identificēšana pēc aiztures parametriem un spektrālajām attiecībām;

– patulīna masas koncentrācijas aprēķins paraugā, pamatojoties uz reģistrēto analītisko signālu (pīķa augstumu) un kalibrēšanas grafiku;

- patulīna masas daļas aprēķins pārtikas produkta sastāvā.

Instrumenti, reaģenti un materiāli, nepieciešams, lai veiktu darbu:

– Milichrome-5 sērijas hromatogrāfs vai jebkurš cits HPLC hromatogrāfs ar WinXrom vai Multichrome programmatūru;

– HPLC hromatogrāfijas kolonna: Diasfer–110–С10СN (5 µm, 2×80 mm, TU 4215–001–05451931–94);

– mainīga tilpuma dozators 1-100 µl;

– mainīga tilpuma dozators 100–1000 µl;

- koniskā kolba ar cieši slīpētu plānu sekciju ar ietilpību līdz 10 ml;

– membrānas filtri;

- patulīna standartšķīdumu komplekts ar koncentrāciju 1, 2, 5 un 10 mg/l;

- fosforskābe 85%;

– acetonitrils šķidrumu hromatogrāfijai (īpašas tīrības specifikācija TU 6–09–3513–86, UV absorbcija līdz 200 nm);

– heksāns, ķīmiski tīrs (rektificēts);

- trifluoretiķskābe;

– Karesa I šķīdums – 100 ml ūdens izšķīdina 15,0 g kālija heksacianoferāta II.

- Carrez II šķīdums - izšķīdina 30,0 g cinka acetāta 100 ml ūdens;

- eluenti A, B un C.

Eluentu sagatavošana

Eluents A. Mērkolbā ar cieši slīpētu stikla sekciju ar ietilpību 100 ml pievieno 20 ml acetonitrila un 0,5 ml 10% trifluoretiķskābes šķīduma. Šķīdumu rūpīgi sajauc un uzpilda līdz atzīmei ar destilētu ūdeni, kas iepriekš filtrēts caur neilona membrānas filtru (0,2 µm). Pēc tam eluentu degazē, evakuējot 1 minūti ar retināšanu 1 kg∙s/cm 2 .

Eluents B un C pagatavo tāpat kā eluentu A, uz 100 ml šķīduma ņem attiecīgi tikai 10 un 0 ml acetonitrila.

3.2.4.2. Hromatogrāfiskās atdalīšanas režīmu iestatīšana
un rezultātu reģistrācija

Lai veiktu mērījumus, ir jāiestata hromatogrāfa darbības režīmi.

Dozatoru režīmi:

– reģenerācija – 300 µl;

– parauga tilpums – 5 µl;

– eluenta patēriņš – 150 µl/min;

– gradienta eluēšanas režīmi: 800 µl – eluents A,
500 µl - eluents B, 300 µl - eluents C;

- termostata temperatūra - 35 0 С.

Atklāšanas režīmi:

– viļņu garumu skaits – 3;

– viļņu garumi – 250, 276, 290 nm;

– mērīšanas laiks – 0,04 s.

Hromatogrāfiskās sistēmas kondicionēšana tiek veikta 30 minūtes pirms mērījumiem, veicot “tukšo” analīzi, kurā patulīnu saturošo standartmaisījumu aizstāj ar 5–10 µl eluenta un pēc tam atdala mikotoksīnu standarta maisījumu.

1. vingrinājums. Izpētīt pārtikas produktu paraugu sagatavošanas metodi patulīna satura noteikšanai. Sagatavo paraugus saskaņā ar 3.2.3. punktu.

2. uzdevums. Kalibrējiet hromatogrāfu. Hromatogrāfu kalibrē, secīgi ievadot patulīna standartšķīdumus ar koncentrāciju 1, 2, 5 un 10 mg/l.

Skolotāja vadībā tiek piedāvāts programmā (WinXrom) ievadīt hromatogrāfiskās atdalīšanas parametrus (3.2.4.3. punkts) no datora tastatūras un sākt 2-4 hromatogrāfiskās analīzes automātiskajā režīmā. Rezultāti tiek parādīti tabulas veidā. 6.

T a b l e 6

Pamatojoties uz iegūtajiem hromatogrāfiskajiem profiliem, izveidojiet kalibrēšanas grafiku (koncentrāciju attēlo pa ordinātu asi - mg / l, pa abscisu asi ir mikotoksīna optiskais blīvums BET– s.o.p.).

3. uzdevums. Identificējiet patulīnu pārtikas produkta testa paraugā un nosakiet tā koncentrāciju.

Skolotājas vadībā uzsākt gatavā pārtikas produkta parauga mērīšanu automātiskajā režīmā
(ar 2. uzdevumā atlasītajiem hromatogrāfiskās atdalīšanas parametriem). Pabeidzot mērījumu, identificējiet patulīna mikotoksīnu saskaņā ar 2. uzdevumā iegūto standarta failu (“Standarta DD–MM–GG.001”). Izmantojot 2. uzdevumā iebūvēto kalibrēšanas grafiku, nosakiet patulīna koncentrāciju pārtikas paraugā.

Ierakstiet rezultātus tabulā. 7.

7. tabula

Patulīna masas koncentrāciju pārtikas paraugā aprēķina pēc formulas

kur NO– patulīna masas koncentrācija paraugā, mg/l (aprēķināts pēc kalibrēšanas atkarības, pamatojoties uz analītiskā pīķa augstumu); V lpp ir parauga tilpums, ml; R - mikotoksīna ekstrakcijas pakāpe parauga sagatavošanas stadijā (vienāds ar 60%); M pr ir attīrīšanai un tai sekojošai hromatogrāfiskai noteikšanai izmantotā pārtikas produkta parauga masa, g.

Mikotoksīna masas daļas mērīšanas rezultāts nosakāmajā objektā ir parādīts šādā formā: X±  mg/kg; plkst R\u003d 0,95 un ierakstīts protokolā (1.pielikums), kur X i , ir patulīna masas koncentrācija paraugā, mg/kg; R- varbūtība;  ir absolūtās kļūdas robeža, kas aprēķināta pēc formulas

Pēc rezultāta saņemšanas ir jānovērtē konverģences operatīvās kontroles standartu vērtības, kas norādītas attiecīgajos GOST kontroles (analīzes) metodēm.

Izdarīt secinājumu par patulīna satura atbilstību (vai neatbilstību) pētāmajā pārtikas produktā SanPiN 2.3.2.1078–01 noteiktajiem pieļaujamajiem līmeņiem.

Jautājumi paškontrolei

1. Kādi principi ir pamatā hromatogrāfisko analīzes metožu klasifikācijai?

2. Kāda ir hromatogrāfiskās atdalīšanas būtība? Kā tiek veikta kvalitatīvā identifikācija un kvantitatīvā analīze?

3. Kādi pārtikas produkti satur mikotoksīnus? Kādi mikotoksīni ir noteikti pārtikas produktu sastāvā saskaņā ar SanPiN prasībām?

4. Ar kādu hromatogrāfijas metodi nosaka mikotoksīnu saturu pārtikas produktos?

5. Uz ko balstās spektrofotometriskā noteikšana? Kas ir spektrālās attiecības un kam tās tiek izmantotas?

6. Kā notiek pārtikas paraugu sagatavošana, lai ar HPLC noteiktu patulīna saturu?

7. Kādas darbības ir iekļautas HPLC metodē patulīna noteikšanai?

8. Kas ir eluents un gradienta eluēšana? Kādus eluentus izmanto patulīna noteikšanai ar HPLC?

9. Kā tiek identificēts un kvantitatīvs patulīns?

10. Kā tiek nodrošināta patulīna HPLC noteikšanas precizitāte?

Mikotoksīnu noteikšanas metodes

Mūsdienu metodes mikotoksīnu satura noteikšanai un noteikšanai pārtikā un barībā ietver skrīninga metodes, kvantitatīvās analītiskās un bioloģiskās metodes.

Skrīninga metodes ir ātri un ērti sērijveida analīzēm, ļauj ātri un droši atdalīt piesārņotos un nepiesārņotos paraugus. Skrīninga metodes ietver plānslāņa hromatogrāfiju (TLC metodes), kas ir fluorescējoša metode ar aflatoksīniem piesārņotu graudu noteikšanai.

Kvantitatīvās analītiskās metodes mikotoksīnu noteikšanai attēlo ķīmiskās, radioimunoloģiskās un enzīmu imunoloģiskās metodes. Mūsdienās visizplatītākās ir ķīmiskās metodes, kas ietver divus posmus: izolēšanas stadiju un mikotoksīnu kvantitatīvās noteikšanas stadiju. Izolācijas stadijā ietilpst ekstrakcija (mikotoksīna atdalīšana no substrāta) un attīrīšana (mikotoksīna atdalīšana no savienojumiem ar līdzīgām fizikālajām un ķīmiskajām īpašībām). Galīgo mikotoksīnu atdalīšanu un kvantitatīvo noteikšanu veic, izmantojot dažādas hromatogrāfijas metodes. Universāla metode visu veidu mikotoksīnu noteikšanai ir plānslāņa hromatogrāfija (TLC).

Ņemot paraugus no produktu partijas, galvenais mērķis ir iegūt vidējo paraugu vai vidējo paraugu, kas ir reprezentatīvs visai partijai mikotoksīnu koncentrācijas ziņā (ņemtajiem paraugiem jāraksturo visas partijas kvalitāte). Šī uzdevuma izpilde ir atkarīga no mikotoksīnu rakstura un izplatības, produkta īpašībām (neapstrādāts, apstrādāts, brīvi plūstošs, šķidrs, pastveida u.c.), parauga sagatavošanas metodes. Piemēram, zemesriekstu piesārņojumam ar aflatoksīniem ir izteikts neviendabīgs raksturs: atsevišķos zemesriekstu graudos to saturs var svārstīties no miligrama tūkstošdaļām līdz desmitiem vai vairāk miligramu uz 1 kg, t.i., atšķirties par 5-6 lieluma kārtām. Šī iemesla dēļ paraugu ņemšanas kļūdas ieguldījums kopējā analīzes kļūdā aflatoksīnu noteikšanā zemesriekstos ir galvenais, un dažos gadījumos tas var pārsniegt 90%.

No mikotoksīnu piesārņojuma viendabīguma viedokļa visus produktus var iedalīt divās grupās: 1) produkti ar augstu neviendabīguma pakāpi (lobīti un nelobīti zemesrieksti, eļļas augu sēklas, veseli vai rupji graudi, rieksti); 2) produkti ar viendabīgu piesārņojuma raksturu (šķidrumi: piens, augu eļļas, sulas, biezeņi; milti, malti milti).

Lai iegūtu reprezentatīvu vidējo l-tās grupas produktu paraugu, sākotnējā parauga izmēram jābūt pēc iespējas lielākam (vismaz 2 kg), savukārt vidējais laboratorijas paraugs ir jāizolē no maltā (homogenizētā) vidējā parauga. .

Viendabīgiem 2.grupas produktiem (ievārījums, marmelāde, augļu sulas mazos skārda traukos, kondensētais piens, sausie piena produkti u.c.) paraugi jāņem tādā iepakojuma vienību skaitā, kas atbilst vidējā parauga lielumam (100). -200 g), ja produkts ir no vienas un tās pašas partijas.

Ķīmiskās metodes atsevišķu aflatoksīnu noteikšanai un identificēšanai ir balstītas uz to specifisko fluorescenci UV gaismā (apmēram 365 nm), uz mobilitātes atšķirībām plānslāņa hromatogrāfijā, uz to absorbcijas un fluorescences spektru specifiku.

Atšķirībā no aflatoksīniem, trihotecēniem nav absorbcijas vai fluorescences redzamajā spektra daļā, kas apgrūtina to noteikšanu ar plānslāņa hromatogrāfiju. Tajā pašā laikā trihotecēnus var noteikt ar TLC, izmantojot metodes, kuru pamatā ir TLC plākšņu apstrāde ar īpašiem reaģentiem, kas ar trihotecēniem veido krāsainus vai fluorescējošus atvasinājumus. Piemēram, T -2 toksīns, apstrādājot plāksnes; koncentrēta sērskābe veido plankumus ar zilu fluorescenci;) UV gaismā.

Šķīrējtiesas metodes mikotoksīnu kvantitatīvai noteikšanai ir šādas:

‣‣‣ gāzes-šķidruma hromatogrāfija (T-2 toksīnam);

‣‣‣ augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija (HPLC), izmantojot UV fotometrisko detektoru (dezoksinivalenolam un patulīnam);

‣‣‣ HPLC, izmantojot fluorescējošu detektoru (aflatoksīniem un zearalenonam).

Uz att. 2 parādīta moderna šķidruma hromatogrāfa ierīce vienkāršākajā dizainā.

Mobilā fāze no tvertnes 1 caur ieplūdes filtru 9 ar augstspiediena sūkni 2 tiek piegādāta parauga ievades sistēmai 3 - manuālajam inžektoram vai autosampleram, kur tiek ievadīts arī paraugs. Pēc tam caur filtru 8 paraugs ar kustīgās fāzes strāvu caur priekškolonnu nonāk separācijas kolonnā 4. Pēc tam kustīgās fāzes plūsma, kas atstāj kolonnu un satur atdalāmā maisījuma sastāvdaļas (eluāts) iekļūst detektorā 5 un tiek izņemts pārplūdes tvertnē 7. Kad eluāts plūst cauri mērīšanas detektora cilpai, hromatogramma tiek reģistrēta un dati tiek pārsūtīti uz reģistratoru 6 vai datoru.

Šķidruma hromatogrāfa ierīce (izokratiskā sistēma):

1 - ietilpība; 2 - augstspiediena sistēma; 3 - manuālais inžektors vai automātiskais paraugs; 4 - atdalošā kolonna; 5 - detektors; b - reģistrators vai dators; 7 - drenāžas tvertne; 8 - filtrs; 9 - ievades filtrs

Sistēma, kas parādīta attēlā. 2 ir izokrātisks: kustīgās fāzes sastāvs hromatogrāfijas laikā nemainās. Ja hromatogrāfiskās analīzes laikā ir ārkārtīgi svarīgi mainīt vienas vai vairāku kustīgās fāzes komponentu koncentrāciju, tad tiek izmantotas tā sauktās gradienta sistēmas, kas parasti sastāv no diviem vai vairākiem sūkņiem. Gradienta eluēšanas gadījumā katrs šķīdinātājs no atsevišķa trauka tiek ievadīts speciālā maisīšanas kamerā ar magnētisko maisītāju, kur pēc noteiktas programmas tos sajauc ar noteiktu tilpuma attiecību.

Mikotoksīnu analīzei biežāk tiek izmantotas gradientu sistēmas, kur kā kustīgā fāze tiek izmantoti acetonitrila šķīdumi ūdenī ar koncentrāciju, kas laika gaitā mainās lineāri.

Hromatogrāfijas kolonna ir metāla caurule ar diametru 150 līdz 250 mm ar iekšējo diametru 4,6 mm, kas pildīta ar īpašu sorbentu uz silikagēla bāzes ar potētiem ogļūdeņraža radikāļiem. Aizsargkolonna kalpo, lai aizsargātu hromatogrāfijas kolonnu no piesārņojuma.

UV fotometriskais detektors ir visizplatītākais HPLC detektora veids. Detektora darbības princips ir līdzīgs parastajam spektrofotometram: tas reģistrē šķīduma optisko blīvumu. Atšķirība ir tāda, ka UV detektors ir plūsmas detektors, nevis kivetes ar šķīdumu, bet izmanto fotometrisko šūnu. Eluenta plūsma plūst caur darba šūnu, un tīrā kustīgā fāze plūst caur atsauces šūnu. Gaismas avots ir dzīvsudraba lampa, kas rada intensīvu UV starojumu. Gaisma ar vēlamo viļņa garumu tiek izvēlēta, izmantojot piemērotus optiskos filtrus, iziet cauri šūnām, daļēji absorbē kustīgās fāzes molekulas un atdalāmās sastāvdaļas un uztver ar fotodetektoru. Eluāta gaismas absorbciju (optisko blīvumu) nepārtraukti reģistrē diagrammas ierakstītājs vai dators, ierakstot hromatogrammu. Atdalītās maisījuma sastāvdaļas (piemēram, mikotoksīni) hromatogrammā ir parādītas kā pīķi. Pīķa pozīciju hromatogrammā izmanto, lai identificētu vielu, un pīķa laukumu izmanto kvantitatīvai noteikšanai.

Sarežģītāka ierīce ir fluorescējošais (fluorimetriskais) detektors.
Izmitināts vietnē ref.rf
Šāds detektors izmanto organisko savienojumu, jo īpaši aflatoksīnu un zearalenona, spēju fluorescēt, pakļaujot to UV vai redzamā starojuma iedarbībai. Fluorescējošajam detektoram ir plūsmas šūna ar diviem savstarpēji perpendikulāriem optiskajiem kanāliem. Viens no tiem kalpo aizraujoša starojuma padevei, otrs ļauj izmērīt fluorescences intensitāti. Aflatoksīnu B 1 un M 1 analīzes gadījumā ierosmes viļņa garums ir 360 nm un izstarotais viļņa garums ir 420 nm.

Jāņem vērā, ka aflatoksīnu analīzei var izmantot arī UV detektoru, taču tā jutība ir par kārtu mazāka nekā fluorimetriskajam detektoram, tāpēc, analizējot zemas aflatoksīnu koncentrācijas (MPC) ir vēlams fluorescences noteikšana. līmenī un zemāk).

Mikotoksīnu noteikšanas metodes - jēdziens un veidi. Kategorijas "Mikotoksīnu noteikšanas metodes" klasifikācija un pazīmes 2017., 2018.g.

GOST 32835-2014

STARPVALSTU STANDARTS

SULAS PRODUKTI

Mikotoksīnu noteikšana ar tandēma augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas masas spektrometriju (HPLC-MS/MS)

Sulu produkti. Mikotoksīnu noteikšana ar tandēma augstas veiktspējas šķidruma masas spektrometriju (HPLC-MS/MS)

MKS 67.080.01

Iepazīšanās datums 2016-01-01

Priekšvārds

Starpvalstu standartizācijas darba veikšanas mērķi, pamatprincipi un pamatprocedūra ir noteikta GOST 1.0-92 "Starpvalstu standartizācijas sistēma. Pamatnoteikumi" un GOST 1.2-2009 "Starpvalstu standartizācijas sistēma. Starpvalstu standarti, noteikumi un ieteikumi starpvalstu standartizācijai. Izstrādes, pieņemšanas, piemērošanas, atjaunošanas un atcelšanas noteikumi

Par standartu

1 IZSTRĀDĀJA Federālā valsts augstākās profesionālās izglītības iestāde "Maskavas Valsts pārtikas ražošanas universitāte" (FGBOU VPO "MGUPP")

2 IEVĒROJA Federālā tehnisko noteikumu un metroloģijas aģentūra

3 PIEŅEMTA Starpvalstu standartizācijas, metroloģijas un sertifikācijas padome (2014. gada 25. jūnija protokols N 45-2014).

Balsoja par pieņemšanu:

Valsts īsais nosaukums saskaņā ar MK (ISO 3166) 004-97		Valsts standartu iestādes saīsinātais nosaukums
Armēnija		Armēnijas Republikas Ekonomikas ministrija
Baltkrievija		Baltkrievijas Republikas valsts standarts
Kirgizstāna		Kirgizstāna
Krievija		Rosstandart

4 Ar Federālās tehnisko noteikumu un metroloģijas aģentūras 2014. gada 19. augusta rīkojumu N 896-st GOST 32835-2014 kā Krievijas Federācijas nacionālais standarts tika stājies spēkā no 2016. gada 1. janvāra.

5 Šis standarts ir izstrādāts, ņemot vērā šādu starptautisko dokumentu noteikumus:

- CODEX STAN 247-2005* Codex Alimentarius komisijas Augļu sulu un nektāru vispārējais standarts;
________________
* Piekļuvi starptautiskajiem un ārvalstu dokumentiem, kas minēti turpmāk tekstā, var iegūt, noklikšķinot uz saites uz vietni http://shop.cntd.ru. - Datu bāzes ražotāja piezīme.


- Eiropas Savienības Komisijas 23.02.2006. r. Nē. 406/2006/EK, ar ko nosaka paraugu ņemšanas metodes un analīzes metodes mikotoksīnu līmeņa oficiālajai kontrolei pārtikas produktos oficiālai mikotoksīnu līmeņa kontrolei pārtikas produktos”);

- Eiropas Augļu sulu asociācijas AIJN prakses kodekss augļu un dārzeņu sulu kvalitātes un autentiskuma novērtēšanai.

6 IEVADS PIRMO REIZI


Informācija par izmaiņām šajā standartā tiek publicēta ikgadējā informācijas rādītājā "Nacionālie standarti", bet izmaiņu un grozījumu teksts - ikmēneša informācijas rādītājā "Nacionālie standarti". Šī standarta pārskatīšanas (aizstāšanās) vai atcelšanas gadījumā ikmēneša informācijas rādītājā "Nacionālie standarti" tiks publicēts attiecīgs paziņojums. Attiecīgā informācija, paziņojumi un teksti tiek ievietoti arī publiskajā informācijas sistēmā - Federālās tehnisko noteikumu un metroloģijas aģentūras oficiālajā tīmekļa vietnē internetā

1 izmantošanas joma

1 izmantošanas joma

Šis standarts attiecas uz sulām un citiem sulu produktiem no augļiem un dārzeņiem, izņemot citrusaugļu šūnas, un nosaka metodi mikotoksīnu – patulīna un ohratoksīna A – noteikšanai, izmantojot tandēma augstas veiktspējas šķidruma hromatomasas spektrometriju mērījumu diapazonā. patulīna masas koncentrācija no 0,1 līdz 100,0 µg/dm un ohratoksīna A no 0,1 līdz 20,0 µg/dm.

PIEZĪME Šo starptautisko standartu ieteicams piemērot, lai aprobētu un uzkrātu papildu informāciju saistībā ar tā piemērošanu.

2 Normatīvās atsauces

Šajā standartā tiek izmantotas normatīvās atsauces uz šādiem starpvalstu standartiem:

GOST 12.1.004-91 Darba drošības standartu sistēma. Uguns drošība. Vispārīgās prasības

GOST 12.1.007-76 Darba drošības standartu sistēma. Klasifikācija un vispārīgās drošības prasības

GOST 12.1.010-76 Darba drošības standartu sistēma. Eksplozijas drošība. Vispārīgās prasības

GOST 12.1.019-79 Darba drošības standartu sistēma. Elektriskā drošība. Vispārīgās prasības un aizsardzības veidu nomenklatūra

GOST 61-75 reaģenti. Etiķskābe. Specifikācijas

GOST OIML R 76-1-2011 Valsts sistēma mērījumu vienveidības nodrošināšanai. Neautomātiskie svari. 1. daļa. Metroloģiskās un tehniskās prasības. Pārbaudes

GOST 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) Laboratorijas stikla trauku mērīšana. Cilindri, vārglāzes, kolbas, mēģenes. Vispārīgās specifikācijas

GOST ISO 3696-2013 Ūdens laboratorijas analīzēm. Tehniskās prasības un kontroles metodes

GOST ISO 5725-1-2003 Mērīšanas metožu un rezultātu precizitāte (pareizība un precizitāte). 1. daļa. Pamatnoteikumi un definīcijas

GOST ISO 5725-2-2003 Mērīšanas metožu un rezultātu precizitāte (pareizība un precizitāte). 2. daļa: Pamatmetode standarta mērījumu metodes atkārtojamības un reproducējamības noteikšanai

GOST 5789-78 Reaģenti. Toluols. Specifikācijas

GOST 16317-87 Sadzīves elektriskās saldēšanas iekārtas. Vispārīgās specifikācijas

GOST 20015-88 Hloroforms. Specifikācijas

GOST 25336-82 Stikla trauki un laboratorijas aprīkojums. Veidi. Galvenie parametri un izmēri

GOST 26313-84 Augļu un dārzeņu pārstrādes produkti. Pieņemšanas noteikumi, paraugu ņemšanas metodes

GOST 26671-85 Pārstrādāti augļi un dārzeņi, gaļas un gaļas un dārzeņu konservi. Paraugu sagatavošana laboratorijas analīzei

GOST 29030-91 Augļu un dārzeņu pārstrādes produkti. Piknometriskā metode šķīstošo cietvielu relatīvā blīvuma un satura noteikšanai

GOST 29227-91 (ISO 835/1-81) Laboratorijas stikla trauki. Pipetes absolvēja. 1. daļa. Vispārīgās prasības

GOST ISO/IEC 17025-2009 Vispārīgās prasības testēšanas un kalibrēšanas laboratoriju kompetencei

GOST 32689.1-2014 Augu izcelsmes pārtikas produkti. Multimetodes pesticīdu atlieku gāzu hromatogrāfiskai noteikšanai. 1. daļa. Vispārīgie noteikumi

GOST 32689.2-2014 Augu izcelsmes pārtikas produkti. Multimetodes pesticīdu atlieku gāzu hromatogrāfiskai noteikšanai. 2. daļa: Ekstrakcijas un attīrīšanas metodes

GOST 32689.3-2014 Augu izcelsmes pārtikas produkti. Multimetodes pesticīdu atlieku gāzu hromatogrāfiskai noteikšanai. 3. daļa. Rezultātu noteikšana un apstiprināšana

Piezīme - Izmantojot šo standartu, ieteicams pārbaudīt atsauces standartu derīgumu publiskajā informācijas sistēmā - Federālās tehnisko noteikumu un metroloģijas aģentūras oficiālajā tīmekļa vietnē internetā vai saskaņā ar ikgadējo informācijas indeksu "Nacionālie standarti" , kas publicēts ar kārtējā gada 1. janvāri, un par ikmēneša informācijas indeksa "Nacionālie standarti" kārtējā gada jautājumiem. Ja atsauces standarts tiek aizstāts (modificēts), tad, izmantojot šo standartu, jums jāvadās pēc aizstājošā (modificētā) standarta. Ja atsauces standarts tiek atcelts bez aizstāšanas, noteikums, kurā ir sniegta atsauce uz to, attiecas tiktāl, ciktāl šī atsauce netiek ietekmēta.

3 Saīsinājumi

HPLC-MS/MS - tandēma augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas masas spektrometrija;

OTA, ohratoksīns A;

PAT - patulīns;

ESI- izsmidzināšanas jonizācija elektriskā laukā ( Elektrosmidzināšanas jonizācija);

IARC- Starptautiskā vēža pētniecības aģentūra;

LOD- noteikšanas robeža;

LOQ- kvantitatīvās noteikšanas robeža;

SRM- komponentu identificēšana selektīvo reakciju kontroles režīmā ( Atlasītās reakcijas uzraudzība).

4 Metodes būtība

Metodes būtība ir PAT un OTA mikotoksīnu iepriekšēja ekstrakcija ar acetonitrilu bezūdens magnija sulfāta klātbūtnē, koncentrēšana, atkārtota šķīdināšana acetonitrilā un mikotoksīnu masas koncentrācijas kvantitatīva noteikšana, izmantojot HPLC-MS/MS ar izsmidzināšanas jonizāciju. elektriskajā laukā un komponentu identificēšana selektīvo reakciju kontroles režīmā.

5 Mērinstrumenti, palīgiekārtas, references materiāli, reaģenti un stikla trauki

Analītiskā HPLC-MS/MS* sistēma ar trīskvadrupolu masas detektoru mērījumiem masas diapazonā no 10 līdz 3000 atommasas vienībām (amm.u.), ar masas mērīšanas precizitāti vismaz 0,1 a.m.u., jonizācijas izsmidzināšana elektriskā laukā, spēja strādāt izvēlēto reakciju kontroles un bērnu un vecāku jonu skenēšanas režīmā, minimālā signāla un trokšņa attiecība 1000:1. Analītiskajā sistēmā jāiekļauj HPLC modulis, kas sastāv no bināra sūkņa ar maisītāju, hromatogrāfijas kolonnas termostata, kas nodrošina sildīšanas temperatūru līdz 50 °C, un hromatogrāfijas kolonnas ar apgrieztās fāzes sorbentu ar graudu izmēru 5 μm C. , 150 mm garš un 3 mm iekšējais diametrs. Izmantotajai sistēmai jānodrošina mikotoksīnu noteikšana diapazonā no 0,1 līdz 100,0 µg/dm.
________________
* Papildinformāciju par ieteicamajām LC/MS/MS sistēmām skatiet A pielikumā.


Spektrofotometrs ar mērījumu diapazonu, kas ļauj veikt testēšanu pie viļņa garuma no 250 līdz 400 nm, ko pieļauj absolūtā kļūda optiskā blīvuma mērījumos, kas nepārsniedz 0,1%.

Svari saskaņā ar GOST OIML R 76-1, kas nodrošina svēršanas precizitāti ar vienas svēršanas pieļaujamās absolūtās kļūdas robežu ne vairāk kā ±0,01 mg.

Vannas ultraskaņa.

Centrifūga ar rotora ātrumu 4000-5000 apgr./min mēģenēm ar ietilpību 50 ml.

Centrifūga ar rotora ātrumu 10000-12000 apgr./min Eppendorf tipa mēģenēm ar ietilpību 1,5-2,0 ml.

Žāvēšanas skapis nodrošina temperatūras uzturēšanu līdz 200°С.

Sadzīves ledusskapis saskaņā ar GOST 16317.

Šeikeris maisīšanai.

Ierīces šķidruma paraugu dozēšanai ar nemainīgu vai mainīgu ietilpību 20-1000 mm ar relatīvo kļūdu faktiskā tilpuma dozācijā ne vairāk kā 2,5%.

Mikrofiltrs - uzgalis uz šļirces (reģenerēta celuloze, diametrs 13 mm, poru izmērs 0,2-0,4 mikroni).

Kvarca kivetes ar darba garumu 1 cm.

PAT un OTA mikotoksīni izmantošanai kā references paraugi ar galvenās vielas saturu vismaz 98%.

Ledus etiķskābe saskaņā ar GOST 61, analītiskā klase.

Acetonitrils gradienta HPLC.

Metanols gradienta HPLC.

Magnija sulfāts bezūdens, ķīmiski tīrs

Bezūdens kalcija hlorīds, granulēts, ķīmiski tīrs

Hloroforms saskaņā ar GOST 20015, ķīmiski tīrs

Toluols saskaņā ar GOST 5789, ķīmiski tīrs

Etilspirts, absolūts.

Ūdens laboratorijas analīzēm, 1. tīrības pakāpe saskaņā ar GOST ISO 3696.

2. precizitātes klases graduētas pipetes ar ietilpību 1, 2, 5, 10 cm 2 no 2. precizitātes klases saskaņā ar GOST 29227.

2. precizitātes klases mērkolbas ar ietilpību 5, 10, 25, 50, 100 un 1000 cm 2 vai 2a saskaņā ar GOST 1770.

Asa dibena kolbas ar ietilpību 10,25 cm3.

Eppendorf tipa centrifūgas caurule ar ietilpību 1,5-2,0 ml.

Mikromēģene ar ietilpību 100-400 mm.

2. precizitātes klases mērcilindri ar ietilpību 25, 50, 250 cm3 jebkuras konstrukcijas saskaņā ar GOST 1770.

Centrifūgas caurule ar skrūvējamu vāciņu, 50 cm

Porcelāna krūze ar diametru 125-150 mm.

Laboratorijas eksikators ar ietilpību 3 dm.

Piltuvju laboratorija saskaņā ar GOST 25336.

Plakandibena kolbas ar ietilpību 50, 100, 250 cm3 saskaņā ar GOST 25336.

Ķīmiskās glāzes ar ietilpību 10, 20, 50, 100 un 200 cm3 saskaņā ar GOST 25336.

Atļauts izmantot citus mērinstrumentus, palīgierīces, traukus, kas pēc metroloģiskajiem un tehniskajiem parametriem nav zemāki par iepriekšminēto un nodrošina nepieciešamo mērījumu precizitāti, kā arī standarta paraugus, reaģentus un materiālus, kuru kvalitāte nav sliktāka par augstāk minēto. .

6 Paraugu ņemšana

Paraugu ņemšana - saskaņā ar GOST 26313. Paraugu sagatavošana un uzglabāšana - saskaņā ar GOST 26671, GOST 32689.1, GOST 32689.2 un GOST 32689.3.

7 Sagatavošanās testēšanai

7.1. Vispārīgās prasības

Pirms testēšanas tiek veikta iepriekšēja laboratorijas stikla trauku sagatavošana, kā arī reaģentu un palīgmateriālu kvalitātes kontrole saskaņā ar GOST 32689.1, GOST 32689.2 un GOST 32689.3 prasībām.

7.2. Palīgšķīdumu sagatavošana

7.2.1. Kustīgās fāzes A sagatavošana

Mērkolbā ar tilpumu 1000 ml ar cieši noslēgtu slīpēta stikla vai fluoroplastmasas aizbāzni ar pipeti iepilina 1 ml ledus etiķskābes, 100 ml metanola un uzpilda līdz atzīmei ar bidestilētu ūdeni. Maisījumu rūpīgi sajauc.

Mobilās fāzes A glabāšanas laiks istabas temperatūrā - ne vairāk kā viens mēnesis.

7.2.2. Kustīgās fāzes B sagatavošana

Mērkolbā ar tilpumu 1000 ml ar cieši noslēgtu slīpēta stikla vai fluoroplastmasas aizbāzni ar pipeti ievieto 1 ml ledus etiķskābes un uzpilda līdz atzīmei ar metanolu. Maisījumu rūpīgi sajauc.

Mobilās fāzes B glabāšanas laiks istabas temperatūrā - ne vairāk kā viens mēnesis.

PIEZĪME Kustīgā fāze nedrīkst nonākt saskarē ar gumijas un polimēru materiāliem [izņemot politetrafluoretilēnu (PTFE)].

7.2.3. Šķīdinātāja sagatavošana 1

Piemērotā traukā sajauc 99 tilpuma daļas toluola un vienu tilpuma daļu ledus etiķskābes. Maisījumu rūpīgi sajauc.

1. šķīdinātāja glabāšanas laiks istabas temperatūrā nav ilgāks par 6 mēnešiem.

7.3. Magnija sulfāta sagatavošana

Bezūdens magnija sulfāts, ko izmanto ekstrakcijā kā sorbents, jāizžāvē pat derīguma termiņa laikā, lai no gaisa izvadītu absorbēto mitrumu. Sorbentu kalcinē 180°C - 200°C temperatūrā 6-10 stundas un uzglabā eksikatorā virs bezūdens kalcija hlorīda. Reaģenta piemērotības kritērijs ir papildu ūdens slāņa neesamība, kad šķīdumu karsē, ekstrakcijas stadiju veic līdz temperatūrai 30°C - 40°C, un pēc 2-3 minūtēm reakcijas masa tiek sasildīta. maisīja.

7.4. Mikotoksīnu izejas šķīdumu sagatavošana

7.4.1. PAT šķīdumu sagatavošana

7.4.1.1. PAT izejas šķīduma sagatavošana, masas koncentrācija 200 µg/cm

Ņem 2,0 mg tīra kristāliskā PAT, kas nosvērts ar precizitāti 0,01 mg, izšķīdina mērkolbā ar tilpumu 10 ml nelielā hloroforma daudzumā un pēc tam ar hloroformu palielina šķīduma tilpumu līdz atzīmei.

Sākotnējā PAT šķīduma glabāšanas laiks 0°C temperatūrā stikla mērkolbā ar slīpētu aizbāzni, kas cieši ietīts alumīnija folijā, nav ilgāks par 1 mēnesi.

7.4.1.2. PAT šķīduma pagatavošana, masas koncentrācija 20 µg/cm

Pārnes 1 ml iegūtā PAT izejas šķīduma (skatīt 7.4.1.1. punktu) 10 ml mērkolbā un atšķaida līdz zīmei ar hloroformu. Lai noteiktu precīzu PAT masas koncentrāciju šķīdumā, ņem 5,0 ml iegūtā PAT standartšķīduma un pārnes apmēram 15 cm ietilpīgā traukā, pēc tam hloroformu atdala ar slāpekļa tīrīšanu, līdz tiek iegūta sausa viela. Tūlīt pēc sausnas iegūšanas traukā pievieno 5,0 ml absolūtā etanola. Pilnībā izšķīdiniet PAT. Iegūto PAT šķīdumu ievada kvarca kivetē ar optiskā ceļa garumu 1 cm, pēc tam spektrofotometrā reģistrē šķīduma spektru viļņu garuma diapazonā no 250 līdz 350 nm, par kontroli izmantojot absolūto etanolu references kivetē. .

PAT masas koncentrāciju šķīdumā µg/cm aprēķina pēc formulas

kur ir spektra optiskā blīvuma maksimālā vērtība (viļņa garums aptuveni 275 nm), vienības. OP;

- PAT molekulmasa, kas vienāda ar 153,1 g/mol;

- konversijas koeficients;


- optiskās absorbcijas (ekstinkcijas) molārais koeficients, kas vienāds ar 14600, m/mol.

7.4.1.3. 100 µg/cm PAT šķīduma sagatavošana

5 ml sākotnējā PAT šķīduma hloroformā ar masas koncentrāciju 200 µg/ml (sk. 7.4.1.1. punktu) pārnes 10 ml tilpuma mērkolbā, koncentrē līdz sausam atlikumam istabas temperatūrā zem ūdens plūsmas. slāpekli un nekavējoties atkārtoti izšķīdina acetonitrilā, pievienojot to tilpumam kolbā līdz etiķetēm.

7.4.1.4. PAT šķīdumu glabāšanas laiks saskaņā ar 7.4.1.2. un 7.4.1.3. 0°C stikla mērkolbā ar slīpētu aizbāzni, kas cieši ietīts alumīnija folijā, nav ilgāks par 24 stundām.

Pirms lietošanas šķīdumu temperatūru paaugstina līdz istabas temperatūrai (alumīnija foliju nedrīkst noņemt no mērkolbas, līdz saturs sasniedz istabas temperatūru). PAT iznīcināšanas dēļ nav atļauts uzglabāt references paraugus plānas sausnas plēves veidā, kas iegūts pēc šķīdinātāja noņemšanas -.

7.4.2. OTA izejas šķīduma sagatavošana

7.4.2.1. 20 µg/ml OTA izejas šķīduma sagatavošana

Izšķīdina 2,0 mg tīra kristāliska OTA, kas nosvērts ar precizitāti līdz 0,01 mg, 25 ml vārglāzē ar 1. šķīdinātāju (skatīt 7.2.3. punktu) un kvantitatīvi pārnes uz 100 ml mērkolbu un atšķaida ar 1. šķīdinātāju līdz atzīmei.

Lai noteiktu precīzu OTA masas koncentrāciju šķīdumā, iegūto sākotnējo OTA šķīdumu ievada kvarca kivetē ar optiskā ceļa garumu 1 cm, pēc tam spektrofotometrā reģistrē šķīduma spektru viļņu garuma diapazonā no 300 līdz 370 nm, izmantojot 1. šķīdinātāju kā atsauces kiveti.

OTA masas koncentrāciju sākotnējā šķīdumā μg/cm aprēķina pēc formulas

kur ir spektra optiskā blīvuma maksimālā vērtība (viļņa garums ir aptuveni 333 nm), vienības. OP;

- OTA molekulmasa, kas vienāda ar 402,7 g/mol;

- konversijas koeficients;

- korekcijas koeficients, kas noteikts saskaņā ar A papildinājumu;

- optiskās absorbcijas (ekstinkcijas) molārais koeficients, kas vienāds ar 544, m/mol.

Oriģinālā OTA šķīduma glabāšanas laiks mīnus 18°C ​​temperatūrā stikla mērkolbā ar slīpētu aizbāzni, kas cieši iesaiņots alumīnija folijā, nav ilgāks par četriem gadiem.

7.4.2.2. 5 µg/ml OTA šķīduma pagatavošana

Ievelk 2,5 ml OTA izejas šķīduma (7.4.2.1.), pārnes 10 ml mērkolbā un atšķaida ar 1. šķīdinātāju (7.2.3.) līdz atzīmei.

OTA šķīduma glabāšanas laiks 4°C temperatūrā stikla mērkolbā ar slīpētu aizbāzni, kas cieši ietīts alumīnija folijā, nav ilgāks par 24 stundām.

Pirms lietošanas šķīduma temperatūru sasilda līdz istabas temperatūrai (nav atļauts noņemt alumīnija foliju no mērkolbas, līdz saturs sasniedz istabas temperatūru).

7.5. PAT un OTA kalibrēšanas šķīdumu sagatavošana

PAT un OTA kalibrēšanas šķīdumus sagatavo, sajaucot noteiktus to izejas šķīdumu tilpumus (sk. 7.4.1.1. un 7.4.2.1.) ar dzidrinātu ābolu sulu, kas nesatur nosakāmās analizējamās vielas.

7.5.1. PAT kalibrēšanas šķīdumu sagatavošana

7.5.1.1. Starpposma šķīduma pagatavošana ar PAT masas koncentrāciju 1000 ng/cm (šķīdums n-1)

1 ml PAT šķīduma (sk. 7.4.1.3.) vai 1 ml PAT sastāva standarta parauga ar PAT masas koncentrāciju 100 µg/cm pārnes mērkolbā ar ietilpību 100 ml un tilpumu šķīdumu noregulē līdz atzīmei ar acetonitrilu.

7.5.1.2. Starpposma šķīduma pagatavošana ar PAT masas koncentrāciju 10 ng/cm (šķīdums n-2)

Pārnes 1 ml šķīduma -1 (skatīt 7.5.1.1. punktu) 100 ml mērkolbā un atšķaida līdz atzīmei ar acetonitrilu.

7.5.1.3. PAT kalibrēšanas šķīdumu sagatavošana

Atlasīti saskaņā ar 1. tabulu noteikti starpšķīdumu apjomi n-1 un n-2 (sk. 7.5.1.1. un 7.5.1.2.) un izdaliet 10 ml mērkolbās.


1. tabula. Risinājumu apjomi n-1 un n-2 PAT kalibrēšanas šķīdumu pagatavošanai

Indikatora nosaukums	Kalibrēšanas risinājumi
Šķīduma tilpums n-2 cm
Šķīduma tilpums n-1 cm
Injicētā PAT daudzums, ng
PAT masas koncentrācija šķīdumā, ng/cm

7.5.2. OTA kalibrēšanas šķīdumu sagatavošana

7.5.2.1. 200 ng/ml OTA starpšķīduma (šķīduma) sagatavošana A-1)

Koncentrējiet 1 ml 5 µg/ml OTA šķīduma (skatīt 7.4.2.2. punktu) līdz sausai slāpekļa plūsmai istabas temperatūrā un nekavējoties pārnes ar acetonitrilu uz 25 ml mērkolbu.

7.5.2.2. 10 ng/ml OTA starpšķīduma (šķīduma) sagatavošana BET-2)

0,5 ml OTA starpšķīduma BET-1 (skatīt 7.5.2.1. punktu) pārnes 10 ml mērkolbā un atšķaida līdz atzīmei ar acetonitrilu.

7.5.2.3. OTA kalibrēšanas šķīdumu sagatavošana

Atlasīti saskaņā ar 2. tabulu noteikti starpšķīdumu apjomi BET-1 un BET-2 (skatīt 7.5.2.1. un 7.5.2.2.) un izdaliet 10 ml mērkolbās.


2. tabula. Risinājumu apjomi BET-1 un BET-2 OTA kalibrēšanas šķīdumu pagatavošanai

Indikatora nosaukums	Kalibrēšanas risinājumi
Šķīduma tilpums BET-2 cm
Šķīduma tilpums BET-1 cm
Ievadītā OTA daudzums, ng
OTA masas koncentrācija šķīdumā, ng/cm

Šķīduma tilpumu kolbās uzpilda līdz atzīmei ar dzidrinātu ābolu (vai citu filtrētu) sulu.

Testēšanai HPLC-MS/MS sistēmā injicē 10 mm PAT un OTA kalibrēšanas šķīdumus, kas sagatavoti saskaņā ar 7.5.1.3. un 7.5.2.3. un kalibrēti saskaņā ar 7.7. punktu, ņemot vērā 8.3.1.

Kalibrēšanas šķīduma glabāšanas laiks 0°C - 4°C temperatūrā stikla mērkolbā ar slīpētu aizbāzni nav ilgāks par 24 stundām.

7.6. LC/MS/MS sistēmas sagatavošana

HPLC-MS/MS sistēmas sagatavošana mērījumiem tiek veikta saskaņā ar lietošanas instrukciju (instrukciju) un B pielikumā sniegto informāciju.

Uzstādot masas spektrometra darbības režīmus, ieteicams izmantot B pielikumā dotos MS/MS parametrus mikotoksīnu noteikšanai.

Šajā gadījumā ir jāievēro šādi nosacījumi:

- apkārtējā gaisa temperatūra no 20°С līdz 25°С;

- atmosfēras spiediens no 84 līdz 106 kPa;

- spriegums tīklā (220±10) V;

- strāvas frekvence tīklā no 49 līdz 51 Hz;

- relatīvais gaisa mitrums no 40% līdz 80%.

7.7. HPLC-MS/MS sistēmas kalibrēšana

Sistēmas kalibrēšana ar mikotoksīnu šķīdumiem sulās saskaņā ar 7.5 tiek veikta saskaņā ar HPLC-MS/MS sistēmas lietošanas instrukciju (instrukciju) un ņemot vērā nosacījumus saskaņā ar 8.3.1 reizi mēnesī. PAT un OTA pīķu laukumus nosaka hromatogrammās, un no pīķa laukuma nosaka kalibrēšanas atkarību koncentrācijas diapazonā saskaņā ar 7.5. Aprēķiniet korelācijas koeficientu un mikotoksīnu masas koncentrācijas aprēķināto vērtību novirzi katrā kalibrēšanas punktā no faktiskās vērtības saskaņā ar kalibrēšanas šķīdumu sagatavošanas procedūru (sk. 7.5.). Kalibrēšana tiek uzskatīta par pieņemamu, ja korelācijas koeficients ir vismaz 0,999 (PAT) un 0,965 (OTA), un masas koncentrācijas aprēķinātās vērtības relatīvā novirze no faktiskās vērtības nav lielāka par ±10%.

Relatīvās novirzes vietā kalibrēšanas raksturlieluma pieņemamību var novērtēt ar relatīvo standartnovirzi, kas nedrīkst pārsniegt 5%.

8 Testēšana

8.1. Ekstrakcija

10 ml () iepriekš rūpīgi sajauktu sulas produktu ievieto centrifūgas mēģenē ar skrūvējamu vāciņu ar ietilpību 50 ml. Mēģenei pievieno 20 ml acetonitrila un 15 g bezūdens magnija sulfāta. Maisījumu trīs līdz piecas minūtes intensīvi maisa manuāli vai ar kratītāju. Pēc maisīšanas iegūto ekstraktu centrifugē 10 minūtes pie 4000-5000 apgr./min istabas temperatūrā vai 5 minūtes centrifūgas klātbūtnē ar dzesēšanu 5°C temperatūrā. Izmēra kopējo ekstrakta tilpumu pēc centrifugēšanas (). 18-19 cm () ekstrakta, kas ņemts ar pipeti vai dozēšanas ierīci, tiek pārnests uz asa dibena kolbu ar ietilpību 25 cm 1 cm () acetonitrils.

Ja uz trauka sieniņām ir nešķīstoša karameļu plēve, to trīs līdz piecas minūtes iznīcina ultraskaņas vannā. Šķīdumu pārnes Ependorfa tipa mēģenē ar ietilpību 1,5-2,0 cm3 un centrifugē ar ātrumu 10 000-12 000 apgr./min 3-5 minūtes. Augšējo slāni ņem un filtrē caur mikrofiltru ar poru izmēru 0,2-0,4 µm tieši mikromēģenē ar ietilpību 100-400 mm. HPLC-MS/MS testam sistēmā ievada 10 mm sagatavotā parauga.

8.2. Paraugu sagatavošana no koncentrētiem produktiem

Koncentrētas sulas (biezenis) atšķaida ar ūdeni līdz minimālajam šķīstošo cietvielu līmenim, kas noteikts normatīvajos dokumentos konkrētam sulas produkta veidam. Koncentrēti sulu produkti, kuriem nav paredzēti minimālie šķīstošo cietvielu līmeņi, tiek atjaunoti ar bidestilētu ūdeni līdz 11,2% šķīstošo cietvielu saturam. Šķīstošo cietvielu saturs tiek kontrolēts saskaņā ar GOST 29030.

Atjaunoto paraugu ekstrakcija tiek veikta saskaņā ar 8.1.

8.3. Mērījumu veikšana

8.3.1. Vispārīgie nosacījumi

Paraugus un kalibrēšanas šķīdumus, kas sagatavoti saskaņā ar 8.1. punktu, injicē izvēlētajā secībā. Visizplatītākā metode ir, kad kalibrēšanas šķīdumu ievadīšana sākas un beidzas parauga injekciju sērija.

HPLC-MS/MS sistēmai jābūt iestatītai uz SRM ar pārejām, kas nodrošina selektīvu analizēto mikotoksīnu noteikšanu. Aiztures laikus un pīķu laukumus nosaka, izmantojot analīzes programmatūru analīzes rezultātu reģistrēšanai un aprēķināšanai, kas pievienota HPLC-MS/MS sistēmai. HPLC/MS/MS sistēmu, atdalīšanas apstākļu un masas spektrometriskās noteikšanas piemēri ir sniegti B pielikumā.

Paraugus pārbauda atkārtojamības apstākļos divām paralēlām noteikšanām saskaņā ar GOST ISO 5725-1 (3.14. apakšnodaļa) un GOST ISO 5725-2.

8.3.2 Mikotoksīnu identifikācija

Lai identificētu mikotoksīnus, aiztures laikus, kas iegūti no parauga šķīdumiem, salīdzina ar atbilstošo mikotoksīnu aiztures laikiem no kalibrēšanas šķīdumiem. Lai apstiprinātu mikotoksīnu klātbūtni, tiek salīdzināta signāla intensitātes attiecība no pirmās un otrās m/z-pāreja ar mikotoksīnu signālu intensitātes attiecību no kalibrēšanas šķīdumiem.

Viena mikotoksīna maksimumu attiecība nedrīkst atšķirties vairāk kā par 20% no paredzamās signāla intensitātes attiecības.

9 Pārbaudes rezultātu apstrāde un prezentēšana

9.1. Kvantitatīvā noteikšana

Mikotoksīnu kvantitatīvo noteikšanu sagatavotā ekstrakta ievadītajā tilpumā (sk. 8.1. punktu) veic, salīdzinot mikotoksīna pīķa laukumu (vai augstumu) ar atbilstošo kalibrēšanas raksturlielumu šim mikotoksīnam.

Mikotoksīnu masas koncentrāciju pārbaudītajos produktos µg/dm aprēķina pēc formulas

kur ir pārrēķina koeficients no kubikcentimetriem uz kubikdecimetriem;

- mikotoksīna koncentrācija ekstrakta tilpumā 10 mm, ievadīta HPLC-MS/MS sistēmā, noteikta pēc kalibrēšanas atkarības, ng;

ir acetonitrila tilpums, kurā ekstrakts pēc koncentrācijas tika atkārtoti izšķīdināts, cm;

- kopējais ekstrakta tilpums, no kura ņem tilpumu koncentrēšanai, cm;

- hromatogrāfā ievadītā parauga tilpums (=10 mm), mm;

- pārbaudei ņemtā sulas produktu parauga tilpums, cm;

- koncentrēšanai izvēlētā ekstrakta tilpums, sk

Aprēķinot mikotoksīnu daudzumu koncentrētos sulas produktos, ņem vērā atšķaidījuma pakāpi ar ūdeni saskaņā ar 8.2.

Mērījumu rezultātu ņem par vidējo aritmētisko no trīs paralēlu noteikšanu rezultātiem, ja ir izpildīts pieņemšanas nosacījums

kur , ir maksimālās un minimālās vērtības no iegūtajiem trīs paralēlo noteikšanu rezultātiem, µg/dm;

, , - trīs paralēlu noteikšanu rezultāti, µg/dm;

- kritiskā diapazona vērtība, %.

Neatbilstība starp trim paralēlām noteikšanām (procentos no vidējās vērtības), kas veiktas vienā un tajā pašā laboratorijā, nedrīkst pārsniegt atkārtojamības (konverģences) robežu, kas vienāda ar 3,6· ar varbūtību = 0,95. Ja šis nosacījums ir izpildīts, galīgo mērījumu rezultātu pieņem kā vidējo aritmētisko no trīs paralēlām noteikšanām, kas noapaļotas līdz trešajai zīmei aiz komata.

Mērījumu rezultāti tiek ierakstīti protokolā saskaņā ar GOST ISO / IEC 17025.

9.2. Ja iegūtais rezultāts liecina, ka mikotoksīnu saturs pārsniedz kalibrēšanas atkarības diapazona augšējo robežu, sagatavo jaunu paraugu, palielinot tā atšķaidīšanu ar ūdeni, un veic atkārtotu mērījumu.

10 Metroloģiskie raksturlielumi

Metodes metroloģiskie raksturlielumi attiecībā uz PAT un OTA atbilst 3. tabulā norādītajiem nosacījumiem.


3. tabula. HPLC-MS/MS metodes precizitāte

Mērījumu diapazons, µg/dm	Atkārtojamības relatīvā standartnovirze, %	Reproducējamības relatīvā standartnovirze, %
nosakot PAT (ne vairāk)
nosakot OTA (ne vairāk)

PAT un OTA noteikšanas robežas sulu produktu paraugos ir: LOD- 0,03 mkg/dm, LOQ- 0,1 mcg / dm.

11 Mērījumu rezultātu kvalitātes kontrole

Mērījumu rezultātu kvalitātes kontrole laboratorijā ietver mērījumu rezultātu stabilitātes uzraudzību, izmantojot starpposma precizitātes standartnovirzes stabilitātes pārbaudi. Stabilitātes pārbaude tiek veikta, izmantojot Shewhart kontroles diagrammas. Veikto mērījumu rezultātu stabilitātes uzraudzības biežums tiek regulēts kvalitātes sistēmas iekšējos dokumentos. Neapmierinošu kontroles rezultātu gadījumā, piemēram, kad tiek pārsniegts darbības limits vai regulāri tiek pārsniegts brīdinājuma limits, tiek noskaidroti šo noviržu cēloņi, tostarp mainot reaģentus, pārbaudot operatora darbu.
GOST 12.1.007.

UZMANĪBU! Strādājot ar mikotoksīniem, jāņem vērā, ka PAT un OTA piemīt spēcīgas toksiskas īpašības ar izteiktu nefrotoksisku, imūntoksisku, teratogēnu un genotoksisku iedarbību. Saskaņā ar klasifikāciju IARC OTA attiecas uz kancerogēniem, kas ir potenciāli bīstami cilvēkiem (2.B grupa). Strādājot ar mikotoksīniem, jāievēro lielāki drošības pasākumi. Laboratorijas personālam jāvalkā aizsargapģērbs, tostarp sejas aizsargs, cimdi un aizsargbrilles. Visas darbības ar mikotoksīniem tiek veiktas velkmes pārsegā. Pēc darbu pabeigšanas izlietotie laboratorijas stikla trauki un atkritumi tiek pakļauti dekontaminācijai.

A pielikums (obligāts). Spektrofotometra pārbaude un korekcijas koeficienta CF noteikšana mikotoksīnu masas koncentrācijas aprēķināšanai standartšķīdumos

A pielikums
(obligāts)

Spektrofotometra pārbaude un korekcijas koeficienta noteikšana mikotoksīnu masas koncentrācijas aprēķināšanai standartšķīdumos

A.1. Lai noteiktu mikotoksīnu masas koncentrāciju izejas šķīdumos (sk. 7.4.1.1. un 7.4.2.1.), izmantojiet spektrofotometru, kas piemērots šķīdumu optiskā blīvuma mērīšanai kvarca kivetē ar 1 cm optiskā ceļa garumu viļņa garuma diapazonā. no 200 nm līdz 400 nm.

Spektrofotometra kalibrēšanu veic šādi.

Izmērīt optisko blīvumu trīs kālija dihromāta (KCrO) šķīdumiem sērskābē (HSO) - 0,25; 0,125 un 0,0625 mmol / dm maksimālajā absorbcijas punktā (viļņa garums aptuveni 350 nm), kā kontroli izmantojot sērskābes (HSO) šķīdumu ar koncentrāciju 0,009 mmol / dm.

Pēc tam katrai kālija dihromāta koncentrācijai pēc formulas aprēķina optiskā blīvuma molārā koeficienta vērtību, m/mol

kur ir kālija dihromāta šķīduma sērskābē izmērītā optiskā blīvuma vērtība attiecīgajai koncentrācijai, vienības. OP;

- kālija dihromāta šķīduma koncentrācija sērskābē, mmol/dm.

Ja starpība starp trim izmērītajām vērtībām ir ārpus garantētā optiskā blīvuma mērīšanas precizitātes diapazona, tad jāpārbauda kalibrēšanas procedūra vai aprīkojums. Aprēķināt vidējo aritmētisko.

Nosakiet korekcijas koeficientu (bezdimensiju vērtību) konkrētam aprīkojumam (spektrofotometram un kivetei) saskaņā ar formulu

kur ir molārā optiskā blīvuma koeficienta raksturīgā vērtība kālija dihromāta (KCrO) šķīdumiem, m/mol;

- optiskā blīvuma molārais koeficients, kas aprēķināts pēc formulas (A.1), m/mol.

Ja iegūtā korekcijas koeficienta vērtība ir mazāka par 0,95 vai lielāka par 1,05, tad ir jāpārbauda kalibrēšanas procedūra vai aprīkojums, lai novērstu novirzes (kalibrēšanai un tīrībai tiek izmantots tas pats kivetu komplekts) -.

B pielikums (informatīvs). HPLC-MS/MS sistēmu piemēri mikotoksīnu noteikšanai sulās un citos sulu produktos*

B pielikums
(atsauce)

________________
* Šie piemēri ir ieteicami un sniegti šī starptautiskā standarta lietotāju ērtībām.

B.1 HPLC-MS/MS sistēma Nr. 1

Aparatūras platforma: Varian 320-MS LC/MS/MS.

Jonisks