Mikotoksinlerin belirlenmesi için yöntemler. Mikotoksikozların teşhisi için laboratuvar yöntemleri. Mikotoksinler ve bunların belirlenmesi için yöntemler

Yavruların doğumundan sonra, kaltak ve sahipleri için, yalnızca kaltağın beslenmesine ve sağlığına değil, aynı zamanda yeni doğan bebeklere de dikkat edilmesi gereken sorumlu bir dönem başlar. Yavruların doğumundan sonra, ilk bir veya iki gün, orospu, özellikle doğumdan sonra çok fazla yerse, iştahsızlık, hazımsızlık yaşayabilir.

Bu süre zarfında antibiyotiklere başvurmamanız gerektiğini unutmayın - bu, bebeklerin sağlığını olumsuz yönde etkileyecektir. Daha güvenli ilaçlarla (bitkiler, probiyotikler, gastrik lavaj, aktif kömür ve tercihen linyitin gibi) geçinmeye çalışın. Bu durumda çok iyi sonuçlar, Heel'den kesinlikle zararsız homeopatik müstahzarların kullanılmasıyla elde edilir ve veterinerlik ilaçları aramak gerekli değildir, “insan” olanlar daha kötü çalışmaz. Echinacea compositum, Nux vomica, Berebe-ris-hommacord'un bir veya iki deri altı enjeksiyonunu deneyin. İlacın aynı Diar-heel şirketinin tabletlerinde kullanılmasıyla iyi sonuçlar elde edilir. İlaç günde 3 kez 1 tablet verilir. 1,5 yemek kaşığı kaynamış suda önceden çözülüp iyice karıştırılırsa sonuçlar daha iyidir.

Doğumdan sonraki ilk üç gün içinde olası bir rahatsızlığı ağırlaştırmamak için beslenmeye özen gösterilmelidir. Bu dönemde yabancı yazarlar, kaltağa haşlanmış küçük tavukları, kemiklerle birlikte öğütmeyi ve haşlanmış pirinçle karıştırmayı önermektedir.

Doğumdan sonraki ilk günlerden sonra, orospu iştahını gözle görülür şekilde artırır ve bu oldukça doğaldır - vücudunun ihtiyaçları gözle görülür şekilde artar. Önce kolostrum, sonra süt aktif olarak üretilmeye başlar. Büyük ölçüde, sütün miktarı ve kalitesi, yalnızca kaltağın bireysel özelliklerine değil, aynı zamanda beslenmesine de bağlıdır.

İlk haftada, yem miktarı normal diyeti 1,5 kat aşıyor. Ancak bu dönemde eklampsiye neden olmamak için kaltağa çok fazla et verilmemelidir. Şu anda bir protein bileşeni olarak balık veya süzme peynir verebilirsiniz. Kaltak sık sık (4-5 saatte bir) küçük porsiyonlarda besleyin. Midenin normal işlevi geri yüklendikten sonra, mineral takviyeleri vermeye devam etmek ve tüyleri güçlendirmek için araçlar gereklidir.

• et, balık ve sakatat - %45,
• tahıllar - %30,
• süt ve süt ürünleri - %10,
• sebzeler -% 15.

Emziren bir kaltağın daha fazla sütü olması için, diyetine emzirmeyi teşvik eden yiyecekleri dahil etmelidir: çiğ havuç, et, balık, et suyu, yulaf ezmesi, vb. rahatsızlıklara neden olmaz), sütlü çay, sütlü zayıf kahve. Süt miktarını arttırmanın bir yolu olarak şunları deneyebilirsiniz:

• kekik kaynatma;
• melisa kaynatma: bir çay kaşığı otu iki bardak kaynar su ile dökün, demlenmesine izin verin, şeker ekleyin;
• bir termosa iki çay kaşığı çay koyun, iki bardak kaynar süt dökün, 3-4 saat demlenmesini bekleyin, ardından şekeri ekleyin ve soğutun;
• anason kaynatma.

Birçok sahibin laktasyon artırmak için orospulara verdiği Apilac, farklı sürtüklere vermeye çalışmama rağmen benim uygulamamda istenilen sonuçları vermedi.

Köpek içmeyi kesinlikle reddederse, onu içmeye zorlamayı deneyebilirsiniz, ancak önce yeterince sıcak bir içeceğe küçük bir parça tereyağı koyarak onu “kandırmaya” çalışmak daha iyidir. Tereyağı kokusu onu baştan çıkaracak olabilir.

Köpeğin bitkin düşmemesi için bu dönemde beslenmesinin tam olması ve mamanın yeterli miktarda kalori, protein, vitamin ve mineral içermesi gerekir.

Ancak emzirme dönemi boyunca besin miktarı sabit değildir. Daha önce de belirtildiği gibi, ilk haftada diyet 1,5 kat artırılmalıdır. Dişideki süt miktarı arttıkça rasyon da artmalıdır: ikinci hafta rasyon iki katına, üçüncü haftadan laktasyonun sonuna kadar ise üçe katlanmalıdır: normal durumunda bir köpek. Bir kaltağın ihtiyaç duyduğu yiyecek miktarı, onun altlığının boyutuna bağlıdır. Bir çöpteki dört yavru, diyette 2 kat artış gerektirir ve sekiz yavru, en az üç kat artış gerektirir.

Genellikle orospu yavruları 4-6 hafta besler. Bir orospu tarafından üretilen süt miktarı emzirme boyunca sabit değildir. 20-25. güne kadar süt miktarı artar, sonra azalır. Batılı uzmanlar bu dönemde yemin kalori içeriğini hesaplamak için çok kolay bir yol sunuyor. Bu yöntem, tüm çöpü 3-4 günlükken tartmaktan, her kilogram köpek yavrusu için orospu diyetine 250 cal ek enerji eklemekten ve buna göre gıda miktarını ve kalori içeriğini arttırmaktan oluşur.

Emzirme süresi, köpeğin bireysel özelliklerine ve beslenmesine bağlıdır. Her durumda, elbette, köpeğin bireysel özellikleri dikkate alınmalıdır. Yavruların kelimenin tam anlamıyla "emilen", uzun süre, büyük miktarlarda süt üreten ve iki aya kadar yavru besleyen sürtükler var. Doğal olarak, diyetleri, emzirmenin 14-17. gününe denk gelen “süt üretiminin zirvesinde” bile çok az sütü olan ve sahibinin sadece besleyeceğini hayal eden kaltaklardan daha büyük ve daha eksiksiz olmalıdır. çocuklar üç haftaya kadar. Büyük ölçüde, kaltağın süt üretimi, esansiyel amino asitler açısından zengin tam bir protein diyetinden etkilenir. Amino asitlerin eksikliği, öncelikle sütün kalitesini ve miktarını etkiler ve bu da yavruların büyüme hızının düşmesine neden olur ve gelişimlerini yavaşlatır.

Vitaminler ayrıca emziren dişi köpeklerin beslenmesinde de önemli bir rol oynar. Sadece sürtüklerin kendileri için değil, aynı zamanda yavruların gelişimi için de gereklidirler. Orospu tüm emzirme dönemi boyunca gerekli miktarda vitamin almasını sağlamak için gereklidir. Örneğin, yavruların büyümesi için çok gerekli olan sütteki A vitamini içeriği, yalnızca annenin yeminde bulunmasına bağlıdır *. Bu nedenle, mal sahibi, bu vitaminin emziren bir orospu diyetinde sürekli varlığını izlemelidir. Bu aynı zamanda köpek sütü yoluyla büyük miktarlarda atılan D vitamini ve B vitaminleri için de geçerlidir.

Orospu, süt üretmek için atılan sütte bulunanla aynı miktarda ek enerjiye ihtiyaç duyar. Bu nedenle, diyetin enerji değeri öncelikle kaltağın süt arzına bağlı olacaktır. Yemin kalori içeriği de emzirme dönemine bağlıdır. Laktasyonun birinci ve ikinci haftalarında, kaltağın üçüncü ve dördüncü haftalara göre daha az süt ürettiği bilinmektedir. Bu nedenle, diyet, laktasyon döneminin ilk yarısında, yemin enerji yoğunluğunun normal durumdaki orospu ihtiyacına göre 2 kat, ikinci - 3 kat artacağı şekilde tasarlanmalıdır. Uygulamada, şuna benziyor: laktasyonun ilk yarısında süt oluşumu için, vücut ağırlığı 10 kg olan emziren bir orospu, ana diyetin yanı sıra 750 kcal kalori içeriğine sahip ek bir diyete ihtiyaç duyar ve sonraki iki hafta - günlük 1500 kcal.

Doğumdan hemen sonra dişi meme bezleri kolostrum salgılar. Her yeni doğan yavru köpeğin, spesifik antikorlar içeren kolostrum almasını sağlamak gerekir.

Süt oluşumu için büyük önem taşıyan mineraller, eksikliği sadece emziren köpeklerde değil, aynı zamanda yavrularda da çeşitli osteodistrofik hastalıklara neden olur. Aynı zamanda, emziren dişilerin omurgası minerallerde tükenir ve gözenekli, kırılgan hale gelir, yeni doğan yavrularda osteoporoz ve raşitizm ortaya çıkar. Hamilelik sırasında ve genç sürtüklerde - büyüme ve ilk laktasyon için hazırlık döneminde mineral rezervlerinin birikmesini önlemek önemlidir. Emziren orospular, emzirmeyen orospulardan daha fazla tuza ihtiyaç duyar.

Emzirmenin birinci-ikinci ve üçüncü-dördüncü haftalarında 5 kg ağırlığındaki emziren dişi köpeklerin diyetlerinin kalitatif bileşimi ve günlük enerji yoğunluğu

Laktasyonun birinci-ikinci ve üçüncü-dördüncü haftalarında 15 kg ağırlığındaki laktasyondaki dişi köpeklerin diyetlerinin kalitatif kompozisyonu ve günlük enerji yoğunluğu

Laktasyonun birinci-ikinci ve üçüncü-dördüncü haftalarında 25 kg ağırlığındaki emziren orospuların diyetinin kalitatif bileşimi ve günlük enerji yoğunluğu

Mikotoksinlerin belirlenmesi için yöntemler

Gıda ve yemlerdeki mikotoksinlerin içeriğini tespit etmeye ve belirlemeye yönelik modern yöntemler, tarama yöntemlerini, nicel, analitik ve biyolojik yöntemleri içerir. Mikotoksin metodolojisi çok hızlı gelişiyor. Geliştirilen yöntemlerin ve çeşitli modifikasyonların sayısı şimdiden birkaç yüze ulaştı ve artmaya devam ediyor.

Basitlik ve analiz hızı ile karakterize edilen tarama yöntemleri, kontamine olmayan numuneleri hızlı ve güvenilir bir şekilde "elemenize" olanak tanır. Bunlar, aflatoksinler, okratoksin A ve zearalenon için mini kolon tahlili gibi yaygın olarak kullanılan yöntemleri; 30'a kadar farklı mikotoksinin eşzamanlı tespiti için TLC yöntemleri; aflatoksin vb. ile kontaminasyonu tespit etmek için floresan yöntemi.

Mikotoksinlerin belirlenmesi için kantitatif analitik yöntemler, kimyasal, radyoimmünokimyasal ve enzim immünoanalizine bölünebilir. Kimyasal yöntemler şu anda en yaygın olanıdır ve ardışık izolasyon aşamalarını ve mikotoksinlerin uygun miktarını içerir. İzolasyon aşaması iki aşamadan oluşur: ekstraksiyon - mikotoksinin substrattan ayrılması ve saflaştırma - mikotoksinin benzer fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip bileşiklerden ayrılması. Mikotoksinlerin son ayrımı, çeşitli solvent sistemlerinde silika jel plakaları üzerinde bir veya iki boyutlu ince tabaka kromatografisi (TLC), gaz ve gaz-sıvı kromatografisi, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometrisi kullanılarak gerçekleştirilir. Mikotoksinlerin kantitatif tayini genellikle ultraviyole ışıkta TLC üzerindeki floresan yoğunluğunun hem görsel hem de dansitometrik olarak bilinen konsantrasyon standartlarıyla doğrudan karşılaştırılmasıyla gerçekleştirilir. Yöntemlerin güvenilirliğini artırmak için, diğer kromatografik, kolorimetrik veya florimetrik özelliklere sahip mikotoksin türevlerinin hazırlanmasına dayanan çeşitli doğrulama testleri kullanılır.

Son yıllarda, mikotoksinlerin saptanması, tanımlanması ve miktar tayini için son derece hassas ve yüksek düzeyde spesifik radyoimmünokimyasal ve enzim immünoassay yöntemlerinin geliştirilmesine artan ilgi ile karakterize edilmiştir. Bu yöntemler, sığır serum albümini ile mikotoksin konjugantlarına karşı antiserum elde etmeye dayanmaktadır. Avantajları, mikotoksinlerin pikogramlarını tespit etmeyi ve belirleme sürecini otomatikleştirme yönünde geliştirmeleri mümkün kılan olağanüstü hassasiyetleridir. Genellikle çok spesifik ve hassas olmayan biyolojik yöntemler, esas olarak kimyasal analiz yöntemlerinin mevcut olmadığı mikotoksinlerin tespiti veya doğrulayıcı testler olarak kullanılmaktadır. Çeşitli mikroorganizmalar, tavuk embriyoları, birçok laboratuvar hayvanı, hücre ve doku kültürleri test objesi olarak görev yapmaktadır.

Gıda ürünlerinin bileşimindeki mikotoksinlerin içeriğini belirlemek için, "Diapak" konsantre kartuşlarında katı faz ekstraksiyonu yöntemiyle numune hazırlama gerçekleştirilir (s. 3.2.3). Hazırlanan numunelerde mikotoksinlerin ayrılması, tanımlanması ve kantitatif tayini, modüler bir tasarımda Milichrome-5 serisinin mikrokolon kromatografı üzerinde yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile gerçekleştirilir (Şekil 12).

Pirinç. 12. Mikrokolon kromatografı

Makale, patulin tayini için HPLC'nin ters fazlı bir versiyonunu ele almaktadır. Algılama 276 nm dalga boyunda gerçekleştirilir. Patulin'in doğru bir şekilde tanımlanması için, ek bir tanımlama parametresi olarak spektral oranların kullanılmasını mümkün kılan çoklu dalga boyu algılama da kullanılır. Ayırma, analizin çözünürlüğünü ve hassasiyetini artıran gradyan elüsyon modunda gerçekleştirilir.

Pirinç. 13. Sıvı kromatografı:

1 - pompa; 2 – numune enjeksiyon ünitesi; 3 – kromatografik kolon; 4 - dedektör;
5 - fraksiyonlar için elüat veya toplayıcı için tahliye; 6 - kayıt memuru (kaydedici,
entegratör veya kişisel bilgisayar)

6
4

Bir sıvı kromatografı kullanılarak numune analizi (Şekil 13) aşağıdaki gibi gerçekleştirilir. Analiz edilen numune çözeltisinin belirli bir hacmi, numune enjeksiyon ünitesi (2) kullanılarak kromatografik kolonun (3) üst kısmına verilir. Bir pompa (1) kullanılarak, analiz edilen karışım, analiz edilen karışımın ayrı fraksiyonlara (bileşenlere) ayrıldığı bir kromatografik kolon (3) içinden eluent ile pompalanır. Ayrılan bileşenleri içeren kolondan akan eluat, okumaları kaydedici (6) tarafından kaydedilen dedektör (4) tarafından analiz edilir.

1. 
   HPLC'nin metodolojik temelleri

Patulin belirlemek için kullanılan HPLC yönteminin özünü anlamak için, onun altında yatan bazı metodolojik yönleri incelemek gerekir.

Eluotropik seri. Eluentin ayrıştırma gücü, ayrıştırıcının (çözücü veya çözücüler karışımı) adsorbanın yüzeyinden adsorbat'ı değiştirme yeteneğidir. Bu durumda, seçici moleküller sorbentin aktif bölgelerine ne kadar güçlü adsorbe edilirse, yıkama gücü o kadar yüksek olur. Artan elüsyon mukavemetinde bir sıra halinde düzenlenen solventler, bir eluotropik seri oluşturur.

Ters fazlı kromatografi için elüentler olarak, elüsyon kuvvetini değiştiren su ve organik bileşikleri içeren solvent karışımları kullanılır - n-alkoller, asetonitril, tetrahidrofuran ve su ile gerçek çözeltiler oluşturan diğerleri. Normal fazlı kromatografide, polar değiştiriciler eluent olarak kullanılır - lineer ve siklik hidrokarbonlar (heksan, sikloheksan, heptan, vb.).

Sıvı kromatograflar için dedektörler. Şu anda 20'den fazla HPLC dedektörü geliştirilmiştir. Bunlardan üçü optik, ikisi elektrokimyasal olmak üzere en yaygın kullanılan beş tanesidir. Bu beş dedektör, tüm organik ve inorganik madde sınıflarını analiz etmenizi sağlar.

Optik dedektörler, dalga boyu aralığında çalışan bir spektrofotometrik dedektör (ultraviyole (UV) içerir.
200–360 nm ve 360–780 nm dalga boyu aralığında görünür), florimetrik ve kırılma indisi dedektörleri; elektro-kimyasal - voltametrik ve kondüktometrik dedektörlere. Maddelerin kütle spektrumlarının veri tabanlarını kullanarak kromatografik olarak ayrılmış bileşenlerin tanımlanmasına izin verdiği için benzersiz bir bilgi içeriğine sahip olan kütle spektrometrik dedektörü özellikle önemlidir.

spektrofotometrik dedektör en yaygın HPLC dedektörüdür. Çalışma prensibi, iyi bilinen Bouguer-Lambert-Beer ışık absorpsiyon yasasına dayanmaktadır. Bir spektrofotometrik dedektör, bir madde tarafından radyasyonun seçici absorpsiyon absorpsiyonunun spektrumlarını kaydeder. Absorpsiyon spektrumları, incelenen maddenin yapısına bağlıdır. Bu, bir maddeyi spektrum veya standartlardan oluşan bir kitaplığa sahip olan spektrumuyla tanımlamanıza olanak tanır. Bouguer-Lambert-Beer yasasına göre, spektral bantların yoğunluğu, nicel analizin temeli olan bir maddenin konsantrasyonuna, yani bir maddenin konsantrasyonunun belirlenmesine bağlıdır.

Yoğunluğu olan bir kaynaktan gelen monokromatik ışık ben 0 uzunluğunda bir hendeğe düşer ben (Optik yol). Küvet, konsantrasyona sahip bir madde çözeltisi ile doldurulur. İTİBAREN. Bir madde monokromatik radyasyonu emebilir. Belirli bir monokromatik radyasyonu emme yeteneğinin ölçüsü, değerdir. ε molar absorpsiyon katsayısı veya sönme katsayısıdır. Küvetten yoğun bir şekilde zayıflamış bir ışık huzmesi çıkar. ben. Bir dalga boyunda ışık absorpsiyon yasasına göre λ= const

ben= ben 0 ∙10 -ε Cl , (7)

nerede ben küvetten geçtikten sonra ışık akısının yoğunluğudur;
ben 0, gelen ışık akısının yoğunluğudur; ε sönme katsayısıdır; İTİBAREN küvetteki maddenin molar konsantrasyonudur; ben küvetin uzunluğudur.

Davranış ben ile ben Yüzde olarak ifade edilen 0, aktarım olarak adlandırılır T, ve değer A=lg(I 0 / ben) - optik yoğunluk.

A=lg(I 0 /I)= ε С∙ben. (8)

Bir maddenin optik yoğunluğu, analitin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Spektrofotometrik dedektörlerde analitik nicelik optik yoğunluktur. ANCAK. Formül (8) bir spektrofotometrik dedektör kullanıldığında nicel analiz için temel görevi görür, çünkü optik yoğunluk ANCAK madde, kromatografik pikin yüksekliği veya alanı ile doğru orantılıdır.

Optik yoğunluk bağımlılığı ANCAK 190 ila 360 nm dalga boyu aralığında madde ile küvet üzerine gelen ışığın dalga boyundan ultraviyole absorpsiyon spektrumu olarak adlandırılır (Şekil 14).

200 230 260 290 320 350 λ , nm

ANCAK, f.r.p.
Pirinç. 14. Sulu bir çözeltinin ultraviyole absorpsiyon spektrumu
maddeler X

3.2.3. örnek hazırlama

Herhangi bir maddenin maksimum absorpsiyon dalga boyu vardır.
(λ , nm). Bu dalga boyunu kullanırken, dedektör bir maddeyi algılamak için en düşük eşiğe sahiptir.

Bir spektrofotometrik dedektör (SPD) kullanılarak, ultraviyole ışığını emen çeşitli sınıflardan çok sayıda madde tespit edilir.

Kromatografide bir spektrofotometrik dedektörün kullanılması, tanımlamayı büyük ölçüde kolaylaştırır. Yazılımla birlikte çoklu dalga boyu dedektörü, aynı anda birkaç dalga boyunda bir kromatogram almanıza ve bileşenleri tanımlamak için ek bir parametre hesaplamanıza olanak tanır - spektraldavranış (Q) farklı dalga boylarında kromatografik pikin yüksekliklerinin oranıdır.

nerede ANCAK 1 ve ANCAK 2 - 1 ve 2 dalga boylarında optik yoğunluk katsayıları. Değer Q her madde için sabit bir özelliktir ve konsantrasyonuna bağlı değildir. Spektral oranların doğruluğu, maddenin optik yoğunluğunun değerlerine ve dedektörün tasarımına bağlıdır.

Konsantre kartuşlarda katı faz ekstraksiyon yöntemi kullanılarak numune hazırlama, zamandan ve işçilik maliyetlerinden tasarruf sağlar. Katı faz ekstraksiyonu, numuneyi konsantre etmenize ve beraberindeki safsızlıklardan arındırmanıza olanak tanır. Katı faz ekstraksiyonunun karmaşık şeması, iki kartuşun sıralı kullanımını sağlar:

– evrensel yoğunlaştırma kartuşu “DIAPAK P-Z” – bir dizi üst ve alt filtreli (10 adet) yeniden kullanılabilir kartuş (50 numuneye kadar);

– ince temizlik için evrensel kartuş “DIAPAK S” – tek kullanımlık kartuş.

İçin konsantre kartuşların hazırlanması aşağıdaki işlemleri yapmanız gerekmektedir.

İçin "DIAPAK P-Z" konsantre kartuşunun hazırlanması:

- kartuştan 10 ml su-asetonitril (58:42) karışımı pompalayın;

– numune hazırlamadan hemen önce kartuştan 10 ml distile su pompalayın.

İçin konsantre kartuşun hazırlanması "DIAPAK S":

- kartuştan 5 ml benzen pompalayın ve kartuşu her iki ucundan da tıkayın.

Gıda ürününün konsantrasyon için hazırlanması

10.0 g ağırlığındaki bir numuneyi bir cam beher içine koyun, az miktarda damıtılmış su ile karıştırın ve nicel olarak 50 ml'lik bir ölçülü balona aktarın. Şişeye 6.0 ml Carrez I solüsyonu ve Carrez II solüsyonu ekleyin. Şişenin içindekileri distile su ile işarete getirin, iyice karıştırın ve kağıt kıvrımlı filtreden dereceli silindire süzün. Temiz filtrat P'nin hacmini ölçün.

Arıtılmış meyve suları ve içecekler hazırlarken, numuneyi 20 ml berrak bir süzüntü P elde edilene kadar yoğun bir kağıt filtreden süzün.

Numunenin "DIAPAK P-Z" kartuşu üzerindeki konsantrasyonu

Filtrat P'nin tüm hacmini önceden hazırlanmış kartuşa saniyede 1-2 damla hızında uygulayın.

Kartuşu, tüm yıkamaları atarak 5 ml bidistile su ile durulayın.

Patulin'i 10 ml etil asetat kartuşundan 5 ml içeren bir şişeye veya tıpalı hacimsel tüpe elute edin.
%1.5 sulu sodyum karbonat solüsyonu, tıpa, kuvvetlice karıştırın ve pul pul dökülmesine izin verin.

Filtre muhafazasını yaklaşık 2 g susuz sodyum sülfat ile doldurarak kurutma kolonunu birleştirin, kolonun duvarına vurarak kurutma ajanını sıkıştırın ve bir pamuklu çubukla sabitleyin.

Üst etil asetat tabakasını bir pipetle süzün, bir kurutma kolonundan süzün, süzüntüyü 50 ml'lik kalp şeklinde bir şişede toplayın; ilaveten önce 10 ml ve sonra 5 ml etil asetat ile sulu bir sodyum karbonat çözeltisini ekstrakte edin ve ayırmadan sonra, aynı şişeye bir kurutma kolonundan dökülen etil asetat hacimlerini art arda süzün.

Etil asetatı 40°C'yi aşmayan bir sıcaklıkta yaklaşık 0,5 ml'lik bir hacme kadar vakumla buharlaştırın (kuruluğa kadar buharlaştırmayın!), 2.5 ml benzen ekleyin (hacim oranı 1:5'e uyun).

"DIAPAK S" kartuşundaki numunenin temizlenmesi

Hazırlanan kartuşun kapaklarını çıkarın ve benzen-etil asetat numune solüsyonunu saniyede 1-2 damla hızında geçirin. Şişeyi 0.5-1.0 ml daha benzen-etil asetat (85:15) ile yıkayın ve yıkamaları atarak kartuşa uygulayın.

Patulin'i 6 ml'lik kartuştan benzen:etil asetat (7:3) ile ayrıştırın, elüatı bir çekirdek sıyırma şişesine toplayın.

Eluatı kuru hava banyosunda 40°C'yi aşmayan bir sıcaklıkta kuruyana kadar buharlaştırın.

Hemen! Buharlaştırmadan sonra numuneyi 0,2-0,25 ml eluent A (bölüm 3.2.4.2) içinde yeniden çözün, 5-8°C'ye soğutun.

3.2.4. İş emri

Amaç- Milichrome-5 serisinin bir mikrokolon kromatografı üzerinde yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile gıda ürünlerinin bileşimindeki mikotoksin patulin içeriğinin belirlenmesi.

3.2.4.1. Ölçüm tekniği

Ölçümler aşağıdaki ana adımları içerir:

- bilinen bir patulin kütle konsantrasyonuna sahip çözeltilere göre kromatografın kalibrasyonu;

- paragraflara göre katı faz ekstraksiyonu yöntemiyle bir gıda numunesinin hazırlanması. 3.2.3;

- bir UV detektörü tarafından sinyal kaydı ile HPLC ile ekstrenin analizi;

- tutma parametreleri ve spektral oranlar ile patulin tanımlaması;

- kayıtlı analitik sinyale (tepe yüksekliği) ve kalibrasyon grafiğine dayalı olarak numunedeki patulin kütle konsantrasyonunun hesaplanması;

- gıda ürününün bileşimindeki patulin kütle fraksiyonunun hesaplanması.

Aletler, reaktifler ve malzemeler, işi yapmak için gerekli:

– Milichrome-5 serisi kromatografı veya WinXrom veya Multichrome yazılımı ile herhangi bir başka HPLC kromatografı;

– HPLC kromatografik kolonu: Diasfer–110–С10СN (5 µm, 2×80 mm, TU 4215–001–05451931–94);

– 1-100 µl için değişken hacimli dağıtıcı;

– 100–1000 µl için değişken hacimli dağıtıcı;

- 10 ml'ye kadar kapasiteye sahip, sıkıca öğütülmüş ince kesitli konik bir şişe;

– membran filtreler;

- 1, 2, 5 ve 10 mg/l konsantrasyonlu bir dizi standart patulin solüsyonu;

- fosforik asit %85;

– sıvı kromatografisi için asetonitril (özel saflık spesifikasyonu TU 6–09–3513–86, 200 nm'ye kadar UV absorpsiyonu);

– heksan, kimyasal olarak saf (rektifiye edilmiş);

– trifloroasetik asit;

– Carrez solüsyonu I – 15.0 g potasyum hekzasiyanoferat II'yi 100 ml su içinde çözün.

- Carrez II solüsyonu - 30.0 g çinko asetatı 100 ml su içinde çözün;

- eluentler A, B ve C.

eluentlerin hazırlanması

Eluent A. 20 ml asetonitril ve 0,5 ml %10'luk trifloroasetik asit çözeltisi, 100 ml kapasiteli, sıkıca öğütülmüş cam kesitli bir ölçülü balona eklenir. Çözelti iyice karıştırılır ve önceden bir naylon membran filtreden (0,2 µm) süzülmüş damıtılmış su ile işarete getirilir. Daha sonra eluent, 1 kg∙s/cm2'lik bir seyreklikte 1 dakika süreyle tahliye edilerek gazdan arındırılır.

Eluentler B ve C eluent A ile aynı şekilde hazırlanır, sırasıyla 100 ml çözelti başına sadece 10 ve 0 ml asetonitril alınır.

3.2.4.2. Kromatografik ayırma modlarını ayarlama
ve sonuçların kaydı

Ölçümleri gerçekleştirmek için kromatografın çalışma modlarını ayarlamak gerekir.

Dağıtıcı modları:

– rejenerasyon – 300 µl;

– numune hacmi – 5 µl;

– eluent tüketimi – 150 µl/dak;

– gradyan elüsyon modları: 800 µl – eluent A,
500 ul - eluent B, 300 ul - eluent C;

- termostat sıcaklığı - 35 0 С.

Algılama modları:

– dalga boylarının sayısı – 3;

– dalga boyları – 250, 276, 290 nm;

– ölçüm süresi – 0,04 s.

Kromatografik sistemin koşullandırılması, ölçümlerden 30 dakika önce patulin içeren standart karışımın 5-10 µl eluent ile değiştirildiği ve ardından standart mikotoksin karışımının ayrıldığı bir "boş" analiz gerçekleştirilerek gerçekleştirilir.

1. Egzersiz. Patulin içeriğini belirlemek için gıda ürünlerinin numune hazırlama yöntemini incelemek. Numuneleri paragraf 3.2.3'e göre hazırlayın.

Görev 2. Kromatografı kalibre edin. Kromatograf, 1, 2, 5 ve 10 mg/l konsantrasyonlarda standart patulin solüsyonları sırayla eklenerek kalibre edilir.

Bir öğretmenin rehberliğinde, kromatografik ayırma parametrelerinin (madde 3.2.4.3) PC klavyesinden programa (WinXrom) girilmesi ve otomatik modda 2-4 kromatografik analizlerin başlatılması önerilir. Sonuçlar bir tablo şeklinde sunulur. 6.

T a b l e 6

Elde edilen kromatografik profillere dayanarak, bir kalibrasyon grafiği oluşturun (konsantrasyon ordinat ekseni boyunca çizilir - mg / l, absis ekseni boyunca mikotoksinin optik yoğunluğudur ANCAK– s.o.p.).

Görev 3. Gıda ürününün test örneğindeki patulin'i tanımlayın ve konsantrasyonunu belirleyin.

Bir öğretmenin rehberliğinde hazırlanan gıda ürünü numunesinin otomatik modda ölçümüne başlayın
(görev 2'de seçilen kromatografik ayırma parametreleri ile). Ölçümün tamamlanmasının ardından, görev 2'de elde edilen standart dosyaya (“StandartDD–AA–YY.001”) göre patulin mikotoksini tanımlayın. Görev 2'de yerleşik kalibrasyon grafiğini kullanarak, gıda örneğindeki patulin konsantrasyonunu belirleyin.

Sonuçları Tabloya kaydedin. 7.

Tablo 7

Bir gıda örneğindeki patulin kütle konsantrasyonu aşağıdaki formülle hesaplanır:

nerede İTİBAREN– numunedeki patulin kütle konsantrasyonu, mg/l (analitik pikin yüksekliğine dayalı olarak kalibrasyon bağımlılığına göre hesaplanır); V p numune hacmi, ml; R - numune hazırlama aşamasında mikotoksin ekstraksiyon derecesi (%60'a eşit); M pr saflaştırma ve ardından kromatografik belirleme için kullanılan gıda ürünü numunesinin kütlesidir, g.

Belirlenen nesnede mikotoksinin kütle fraksiyonunun ölçülmesinin sonucu aşağıdaki biçimde sunulur: X±  mg/kg; de R\u003d 0.95 ve protokolde (Ek 1) kaydedildi, burada X i , numunedeki patulin kütle konsantrasyonu, mg/kg; R- olasılık;  formülle hesaplanan mutlak hata sınırıdır

Sonucu aldıktan sonra, kontrol (analiz) yöntemleri için ilgili GOST'lerde verilen yakınsamanın operasyonel kontrolü için standartların değerlerinin değerlendirilmesi gerekir.

Çalışılan gıda ürünündeki patulin içeriğinin SanPiN 2.3.2.1078–01 tarafından belirlenen izin verilen seviyelere uygunluğu (veya uygunsuzluğu) hakkında bir sonuca varın.

Otokontrol için sorular

1. Kromatografik analiz yöntemlerinin sınıflandırılmasının altında hangi ilkeler yatmaktadır?

2. Kromatografik ayırmanın özü nedir? Nitel tanımlama ve nicel analiz nasıl yapılır?

3. Hangi gıda ürünleri mikotoksin içerir? SanPiN gerekliliklerine uygun olarak gıda ürünlerinin bileşiminde hangi mikotoksinler belirlenir?

4. Gıda ürünlerindeki mikotoksin içeriğini belirlemek için hangi kromatografik yöntem kullanılır?

5. Spektrofotometrik algılama neye dayanır? Spektral oranlar nedir ve ne için kullanılır?

6. Patulin içeriğini HPLC ile belirlemek için gıda numunesi hazırlama nasıl yapılır?

7. Patulin belirlemek için HPLC yöntemine hangi işlemler dahildir?

8. Eluent ve gradyan elüsyonu nedir? HPLC ile patulin tayininde hangi eluentler kullanılır?

9. Patulin nasıl tanımlanır ve ölçülür?

10. Patulin'in HPLC tayininin doğruluğu nasıl sağlanır?

Mikotoksinlerin belirlenmesi için yöntemler

Gıda ve yemlerdeki mikotoksinlerin içeriğini saptamaya ve belirlemeye yönelik modern yöntemler, tarama yöntemlerini, nicel analitik ve biyolojik yöntemleri içerir.

Tarama yöntemleri seri analiz için hızlı ve kullanışlıdır, kontamine ve kontamine olmayan numuneleri hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmanıza olanak tanır. Tarama yöntemleri arasında, aflatoksinlerle kirlenmiş tahılı belirlemek için bir floresan yöntem olan ince tabaka kromatografisi (TLC yöntemleri) yer alır.

Mikotoksinlerin belirlenmesi için kantitatif analitik yöntemler, kimyasal, radyoimmünolojik ve enzim immünoassay yöntemleri ile temsil edilir. Günümüzde en yaygın olanı, iki aşamayı içeren kimyasal yöntemlerdir: izolasyon aşaması ve mikotoksinlerin kantitatif tayin aşaması. İzolasyon aşaması, ekstraksiyon (mikotoksinin substrattan ayrılması) ve saflaştırma (mikotoksinin benzer fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip bileşiklerden ayrılması) içerir. Mikotoksinlerin nihai ayrımı ve miktar tayini, çeşitli kromatografik yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir. Tüm mikotoksin tiplerini belirlemek için evrensel bir yöntem, ince tabaka kromatografisidir (TLC).

Bir ürün serisinden numune alırken, temel amaç mikotoksin konsantrasyonu açısından serinin tamamını temsil eden ortalama bir numune veya ortalama bir numune elde etmektir (alınan numuneler tüm serinin kalitesini karakterize etmelidir). Bu görevin yerine getirilmesi, mikotoksinlerin doğasına ve dağılımına, ürünün özelliklerine (ham, işlenmiş, serbest akışlı, sıvı, macunsu, vb.), numune hazırlama yöntemine bağlıdır. Örneğin, yer fıstığının aflatoksinlerle kontaminasyonu belirgin bir heterojen karaktere sahiptir: bireysel fıstık tanelerinde, içerikleri miligramın binde biri ile 1 kg başına onlarca veya daha fazla miligram arasında değişebilir, yani 5-6 büyüklük sırası ile farklılık gösterebilir. Bu nedenle yer fıstığında aflatoksin tayininde örnekleme hatasının toplam analiz hatasına katkısı en başta gelmekte ve bazı durumlarda %90'dan fazla olabilmektedir.

Mikotoksin kontaminasyonunun tekdüzeliği açısından, tüm ürünler iki gruba ayrılabilir: 1) yüksek derecede heterojenliğe sahip ürünler (kabuklu ve kabuksuz fıstıklar, yağlı tohumlar, tam veya kaba taneler, sert kabuklu yemişler); 2) tek tip kontaminasyona sahip ürünler (sıvılar: süt, bitkisel yağlar, meyve suları, püreler; un, öğütülmüş yemekler).

l'inci gruptaki ürünlerin temsili bir ortalama numunesini elde etmek için, ilk numunenin boyutu mümkün olduğu kadar büyük (en az 2 kg), ortalama laboratuvar numunesi ise zeminden (homojenleştirilmiş) ortalama numuneden izole edilmelidir. .

2. grup homojen ürünler için (reçel, marmelat, küçük teneke kaplarda meyve suları, yoğunlaştırılmış süt, kuru süt ürünleri vb.), ortalama numune boyutuna (100) karşılık gelen paketleme birimi sayısında numune alınmalıdır. -200 g), ürünün aynı partiden gelmesi şartıyla.

Bireysel aflatoksinlerin saptanması ve tanımlanması için kimyasal yöntemler, UV ışığında (yaklaşık 365 nm) spesifik flüoresanslarına, ince tabaka kromatografisindeki hareketlilik farklılıklarına, absorpsiyon ve flüoresan spektrumlarının özgüllüğüne dayanır.

Aflatoksinlerin aksine, trikotesenlerin spektrumun görünür kısmında absorpsiyon veya floresansı yoktur, bu da ince tabaka kromatografisi ile tespit edilmesini zorlaştırır. Aynı zamanda, trikotesenler, TLC plakalarının trikotesenlerle renkli veya floresan türevleri oluşturan özel reaktiflerle işlenmesine dayanan yöntemler kullanılarak TLC ile tespit edilebilir. Örneğin, plakaları işlerken T-2 toksini; konsantre sülfürik asit, UV ışığında mavi floresanlı noktalar oluşturur;).

Mikotoksinlerin kantitatif tespiti için tahkim yöntemleri aşağıdaki gibidir:

o gaz-sıvı kromatografisi (T-2 toksini için);

‣‣‣ bir UV fotometrik detektörü (deoksinivalenol ve patulin için) kullanan yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC);

‣‣‣ Floresan detektör kullanan HPLC (aflatoksinler ve zearalenon için).

Şek. Şekil 2, en basit tasarımda modern bir sıvı kromatograf cihazını göstermektedir.

Tank 1'den giriş filtresi 9 boyunca hareketli faz, bir yüksek basınç pompası 2 tarafından numune giriş sistemine 3 - örneğin ayrıca verildiği bir manuel enjektör veya bir otomatik numune alıcıya beslenir. Daha sonra filtre 8 vasıtasıyla, mobil fazın akımı ile numune ön kolondan ayırma kolonu 4'e girer, ardından hareketli fazın akışı kolondan ayrılır ve ayrılacak karışımın bileşenlerini (elüat) içerir. detektöre 5 girer ve taşma tankına 7 çıkarılır. Eluat ölçüm detektör döngüsünden aktığında, kromatogram kaydedilir ve veriler kayıt cihazına 6 veya bir bilgisayara aktarılır.

Sıvı kromatograf cihazı (izokratik sistem):

1 - kapasite; 2 - yüksek basınç sistemi; 3 - manuel enjektör veya otomatik örnekleyici; 4 - ayırma sütunu; 5 - dedektör; b - kayıt şirketi veya bilgisayar; 7 - tahliye tankı; 8 - filtre; 9 - giriş filtresi

Şekil l'de gösterilen sistem. 2 izokratiktir: hareketli fazın bileşimi kromatografi sırasında değişmez. Kromatografik analiz sırasında mobil fazın bir veya daha fazla bileşeninin konsantrasyonunu değiştirmek son derece önemliyse, genellikle iki veya daha fazla pompadan oluşan gradyan sistemleri kullanılır. Gradyanlı elüsyon durumunda, her çözücü ayrı bir kaptan manyetik karıştırıcılı özel bir karıştırma odasına beslenir, burada belirli bir programa göre belirli bir hacim oranıyla karıştırılırlar.

Mikotoksinlerin analizi için, zamanla doğrusal olarak değişen konsantrasyona sahip sudaki asetonitril çözeltilerinin mobil faz olarak kullanıldığı gradyan sistemleri daha sık kullanılır.

Kromatografik kolon, aşılı hidrokarbon radikalleri ile silika jel bazlı özel bir sorbent ile doldurulmuş, iç çapı 4.6 mm olan 150 ila 250 mm çapında bir metal borudur. Koruma kolonu, kromatografik kolonu kontaminasyondan korumaya hizmet eder.

UV fotometrik dedektör, en yaygın HPLC dedektör türüdür. Dedektörün çalışma prensibi, geleneksel bir spektrofotometreninkine benzer: bir çözeltinin optik yoğunluğunu kaydeder. Aradaki fark, UV dedektörünün bir akış dedektörü olması, solüsyonlu bir küvet yerine fotometrik hücre kullanmasıdır. Eluent akışı, çalışan hücreden akar ve saf mobil faz, referans hücreden akar. Işık kaynağı, yoğun UV radyasyonu üreten bir cıva lambasıdır. Uygun optik filtreler kullanılarak istenilen dalga boyundaki ışık seçilir, hücrelerden geçer, mobil fazın molekülleri ve ayrılacak bileşenler tarafından kısmen emilir ve bir fotodedektör tarafından yakalanır. Eluatın ışık absorpsiyonu (optik yoğunluk), kromatogramı kaydeden bir grafik kaydedici veya bilgisayar tarafından sürekli olarak kaydedilir. Karışımın ayrılmış bileşenleri (örneğin mikotoksinler) kromatogramda pikler olarak sunulur. Kromatogramdaki tepe konumu maddeyi tanımlamak için kullanılır ve tepe alanı nicel belirleme için kullanılır.

Daha karmaşık bir cihaz, bir floresan (florimetrik) dedektördür.
ref.rf'de barındırılıyor
Böyle bir dedektör, organik bileşiklerin, özellikle aflatoksinlerin ve zearalenonun UV veya görünür radyasyona maruz kaldığında floresan yayma kabiliyetini kullanır. Floresan dedektör, karşılıklı olarak dik iki optik kanala sahip bir akış hücresine sahiptir. Biri heyecan verici radyasyon sağlamaya hizmet eder, diğeri floresan yoğunluğunun ölçülmesine izin verir. Aflatoksin B1 ve M1 analizi durumunda, uyarma dalga boyu 360 nm ve yayılan dalga boyu 420 nm'dir.

Aflatoksinlerin analizi için bir UV detektörünün de kullanılabileceği, ancak duyarlılığının bir florimetrik detektörünkinden daha düşük bir büyüklük sırası olduğu belirtilmelidir; bu nedenle, düşük konsantrasyonlarda aflatoksinleri analiz ederken (MPC'de) floresan tespiti tercih edilir. seviye ve altı).

Mikotoksinleri belirleme yöntemleri - kavram ve türleri. "Mikotoksinlerin belirlenmesi için yöntemler" kategorisinin sınıflandırılması ve özellikleri 2017, 2018.

GOST 32835-2014

DEVLETLER ARASI STANDART

SUYU ÜRÜNLERİ

Tandem yüksek performanslı sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (HPLC-MS/MS) ile mikotoksinlerin belirlenmesi

Meyve suyu ürünleri. Tandem yüksek performanslı sıvı kütle spektrometrisi (HPLC-MS/MS) ile mikotoksinlerin belirlenmesi

MKS 67.080.01

Giriş tarihi 2016-01-01

Önsöz

Eyaletler arası standardizasyon çalışmalarını yürütmek için hedefler, temel ilkeler ve temel prosedür GOST 1.0-92 "Eyaletlerarası standardizasyon sistemi. Temel hükümler" ve GOST 1.2-2009 "Eyaletlerarası standardizasyon sistemi. Eyaletler arası standardizasyon için eyaletler arası standartlar, kurallar ve tavsiyeler. Geliştirme, benimseme, başvuru, yenileme ve iptal için kurallar

Standart hakkında

1 Federal Devlet Yüksek Mesleki Eğitim Eğitim Kurumu "Moskova Devlet Gıda Üretimi Üniversitesi" (FGBOU VPO "MGUPP") tarafından geliştirilmiştir.

2 Federal Teknik Düzenleme ve Metroloji Ajansı tarafından TANITILMIŞTIR

3 Eyaletler Arası Standardizasyon, Metroloji ve Sertifikasyon Konseyi tarafından KABUL EDİLDİ (25 Haziran 2014, 45-2014 tarihli tutanak)

Kabul etmek için oy verildi:

MK (ISO 3166) 004-97'ye göre ülkenin kısa adı		Ulusal standartlar kuruluşunun kısaltılmış adı
Ermenistan		Ermenistan Cumhuriyeti Ekonomi Bakanlığı
Belarus		Belarus Cumhuriyeti Devlet Standardı
Kırgızistan		Kırgızistant
Rusya		rosstandart

4 Federal Teknik Düzenleme ve Metroloji Ajansı'nın 19 Ağustos 2014 tarihli emriyle N 896-st GOST 32835-2014, 1 Ocak 2016'dan itibaren Rusya Federasyonu'nun ulusal standardı olarak yürürlüğe girmiştir.

5 Bu standart, aşağıdaki uluslararası belgelerin hükümleri dikkate alınarak geliştirilmiştir:

- CODEX STAN 247-2005* Codex Alimentarius Komisyonu'nun Meyve Suları ve Nektarları için Codex Genel Standardı;
________________
* Metinde bundan sonra bahsedilen uluslararası ve yabancı belgelere erişim http://shop.cntd.ru sitesine bağlantıya tıklanarak elde edilebilir. - Veritabanı üreticisinin notu.


- 23.02.2006 tarihli Avrupa Birliği Komisyonu Yönetmeliği r. hayır. 406/2006/EC Gıdalardaki mikotoksin seviyelerinin resmi kontrolü için gıda maddelerindeki mikotoksin seviyelerinin resmi kontrolü için numune alma yöntemlerini ve analiz yöntemlerini ortaya koymak");

- Avrupa Meyve Suyu Birliği'nin Meyve ve Sebze Sularının Kalitesinin ve Orijinalliğinin Değerlendirilmesi için AIJN Uygulama Kuralları.

6 İLK KEZ TANITILDI


Bu standarttaki değişikliklerle ilgili bilgiler, yıllık bilgi endeksi "Ulusal Standartlar" ve değişiklik ve değişiklik metni - aylık bilgi endeksi "Ulusal Standartlar" da yayınlanır. Bu standardın revize edilmesi (değiştirilmesi) veya iptali durumunda, "Ulusal Standartlar" aylık bilgi endeksinde ilgili bir bildirim yayınlanacaktır. İlgili bilgiler, bildirimler ve metinler ayrıca kamuya açık bilgi sisteminde de yayınlanmaktadır - İnternette Federal Teknik Düzenleme ve Metroloji Ajansı'nın resmi web sitesinde

1 kullanım alanı

1 kullanım alanı

Bu standart, narenciye hücreleri hariç olmak üzere, meyve ve sebzelerden elde edilen meyve suları ve diğer meyve suyu ürünleri için geçerlidir ve mikotoksinlerin - patulin ve okratoksin A - tandem yüksek performanslı sıvı kromatoma spektrometrisi kullanılarak tayini için bir yöntem oluşturur. patulin kütle konsantrasyonu 0.1 ila 100.0 µg/dm ve okratoksin A 0.1 ila 20.0 µg/dm.

Not - Bu Uluslararası Standardın, uygulama açısından onaylanması ve ek bilgilerin toplanması amacıyla uygulanması tavsiye edilir.

2 Normatif referanslar

Bu standart, aşağıdaki eyaletler arası standartlara normatif referanslar kullanır:

GOST 12.1.004-91 İş güvenliği standartları sistemi. Yangın Güvenliği. Genel Gereksinimler

GOST 12.1.007-76 İş güvenliği standartları sistemi. Sınıflandırma ve genel güvenlik gereksinimleri

GOST 12.1.010-76 İş güvenliği standartları sistemi. Patlama güvenliği. Genel Gereksinimler

GOST 12.1.019-79 İş güvenliği standartları sistemi. Elektrik güvenliği. Genel gereksinimler ve koruma türlerinin isimlendirilmesi

GOST 61-75 Reaktifleri. Asetik asit. Özellikler

GOST OIML R 76-1-2011 Ölçümlerin tekdüzeliğini sağlamak için devlet sistemi. Otomatik olmayan ölçekler. Bölüm 1. Metrolojik ve teknik gereksinimler. testler

GOST 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) Laboratuvar cam malzemelerinin ölçülmesi. Silindirler, beherler, şişeler, test tüpleri. Genel Özellikler

GOST ISO 3696-2013 Laboratuvar analizi için su. Teknik gereksinimler ve kontrol yöntemleri

GOST ISO 5725-1-2003 Ölçüm yöntemleri ve sonuçlarının doğruluğu (doğruluğu ve kesinliği). Bölüm 1. Temel hükümler ve tanımlar

GOST ISO 5725-2-2003 Ölçüm yöntemleri ve sonuçlarının doğruluğu (doğruluğu ve kesinliği). Bölüm 2: Standart bir ölçüm yönteminin tekrarlanabilirliğini ve yeniden üretilebilirliğini belirlemek için temel yöntem

GOST 5789-78 Reaktifler. Toluen. Özellikler

GOST 16317-87 Ev tipi elektrikli soğutma cihazları. Genel Özellikler

GOST 20015-88 Kloroform. Özellikler

GOST 25336-82 Züccaciye ve laboratuvar ekipmanları. Türler. Ana parametreler ve boyutlar

GOST 26313-84 Meyve ve sebzelerin işlenmiş ürünleri. Kabul kuralları, numune alma yöntemleri

GOST 26671-85 İşlenmiş meyve ve sebzeler, konserve et ve et ve sebzeler. Laboratuvar analizi için numune hazırlama

GOST 29030-91 Meyve ve sebzelerin işlenmiş ürünleri. Çözünür katıların nispi yoğunluğunu ve içeriğini belirlemek için piknometrik yöntem

GOST 29227-91 (ISO 835/1-81) Laboratuvar cam eşyaları. Pipetler mezun oldu. Bölüm 1. Genel gereksinimler

GOST ISO/IEC 17025-2009 Test ve kalibrasyon laboratuvarlarının yeterliliği için genel şartlar

GOST 32689.1-2014 Bitkisel kökenli gıda ürünleri. Pestisit kalıntılarının gaz kromatografik tayini için çoklu yöntemler. Bölüm 1. Genel Hükümler

GOST 32689.2-2014 Bitkisel kökenli gıda ürünleri. Pestisit kalıntılarının gaz kromatografik tayini için çoklu yöntemler. Bölüm 2: Ekstraksiyon ve Saflaştırma Yöntemleri

GOST 32689.3-2014 Bitkisel kökenli gıda ürünleri. Pestisit kalıntılarının gaz kromatografik tayini için çoklu yöntemler. Bölüm 3. Sonuçların belirlenmesi ve doğrulanması

Not - Bu standardı kullanırken, halka açık bilgi sistemindeki referans standartların geçerliliğini - Federal Teknik Düzenleme ve Metroloji Ajansı'nın İnternet'teki resmi web sitesinde veya "Ulusal Standartlar" yıllık bilgi endeksine göre kontrol etmeniz önerilir. cari yılın 1 Ocak itibariyle yayınlanan ve cari yıl için aylık bilgi endeksi "Ulusal Standartlar" konularında yayınlandı. Referans standart değiştirilirse (değiştirilirse), bu standardı kullanırken, değiştirme (değiştirilmiş) standart tarafından yönlendirilmelisiniz. Atıf yapılan standart değiştirilmeden iptal edilirse, bu referansın etkilenmediği ölçüde ona atıfta bulunulan hüküm uygulanır.

3 Kısaltmalar

HPLC-MS/MS - tandem yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi;

OTA, okratoksin A;

PAT - patulin;

ESI- bir elektrik alanında püskürtme iyonizasyonu ( Elektrosprey İyonizasyon);

IARC- Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı;

LOD- algılama sınırı;

LOQ- nicel belirleme sınırı;

SRM- seçici reaksiyonların kontrol modunda bileşenlerin tanımlanması ( Seçilmiş Reaksiyon İzleme).

4 Yöntemin özü

Yöntemin özü, susuz magnezyum sülfat varlığında asetonitril ile PAT ve OTA mikotoksinlerinin ön ekstraksiyonunda, konsantrasyonda, asetonitrilde yeniden çözünmede ve sprey iyonizasyonlu HPLC-MS/MS kullanılarak mikotoksinlerin kütle konsantrasyonunun kantitatif belirlenmesinde yatmaktadır. bir elektrik alanında ve seçici reaksiyonların kontrol modunda bileşenlerin tanımlanması.

5 Ölçüm aletleri, yardımcı ekipman, referans malzemeleri, reaktifler ve cam eşyalar

10 ila 3000 atomik kütle birimi (a.m.u.) arasındaki kütle aralığında ölçümler için üç dört kutuplu bir kütle dedektörüne sahip analitik HPLC-MS/MS* sistemi, en az 0.1 a.m.u. kütle ölçüm doğruluğu, bir elektrik alanında iyonizasyon püskürtme, seçilen reaksiyonların kontrolü ve çocuk ve ebeveyn iyonlarının taranması modunda çalışma yeteneği, minimum 1000:1 sinyal-gürültü oranı. Analitik sistem, mikserli bir ikili pompa, 50°C'ye kadar ısıtma sıcaklığı sağlayan kromatografik kolon termostatı ve tane boyutu 5 μm C olan ters fazlı bir sorbent içeren bir kromatografik kolondan oluşan bir HPLC modülü içermelidir. , 150 mm uzunluğunda ve 3 mm iç çapındadır. Kullanılan sistem 0,1 ila 100,0 µg/dm aralığında mikotoksinlerin saptanmasını sağlamalıdır.
________________
* Önerilen LC/MS/MS sistemleri hakkında daha fazla bilgi için Ek A'ya bakın.


Optik yoğunluk ölçümlerinde %0,1'den fazla olmayan mutlak bir hatanın izin verdiği, 250 ila 400 nm dalga boyunda teste izin veren bir ölçüm aralığına sahip bir spektrofotometre.

GOST OIML R 76-1'e uygun teraziler, ±0.01 mg'dan fazla olmayan tek bir tartımın izin verilen mutlak hata sınırı ile tartım doğruluğu sağlar.

Banyo ultrasonik.

50 ml kapasiteli test tüpleri için 4000-5000 rpm rotor hızında santrifüjleyin.

1.5-2.0 ml kapasiteli Eppendorf tipi test tüpleri için 10000-12000 rpm rotor hızına sahip santrifüj.

200°С'ye kadar sıcaklık muhafazası sağlayan kurutma kabini.

GOST 16317'ye göre ev tipi buzdolabı.

Karıştırma için çalkalayıcı.

20-1000 mm sabit veya değişken kapasiteye sahip sıvı numunelerin dozlanması için cihazlar, gerçek hacmin dozlanmasında %2,5'ten fazla olmayan göreli bir hata ile.

Mikrofiltre - bir şırınga üzerindeki meme (rejenere selüloz, çap 13 mm, gözenek boyutu 0,2-0,4 mikron).

1 cm çalışma uzunluğuna sahip kuvars küvetler.

Ana madde içeriği en az %98 olan referans numuneler olarak kullanılmak üzere PAT ve OTA mikotoksinleri.

GOST 61'e göre buzlu asetik asit, analitik sınıf.

Gradyan HPLC için Asetonitril.

Gradyan HPLC için Metanol.

Magnezyum sülfat susuz, kimyasal olarak saf

Kalsiyum klorür susuz, granül, kimyasal olarak saf

GOST 20015'e göre kloroform, kimyasal olarak saf

GOST 5789'a göre toluen, kimyasal olarak saf

Etil alkol, mutlak.

Laboratuvar analizi için su, GOST ISO 3696'ya göre saflık 1.

GOST 29227'ye göre 2. doğruluk sınıfının 1, 2, 5, 10 cm 2 kapasiteli 2. doğruluk sınıfının dereceli pipetleri.

GOST 1770'e göre 5, 10, 25, 50, 100 ve 1000 cm 2 veya 2a kapasiteli 2. doğruluk sınıfının hacimsel şişeleri.

10,25 cm3 kapasiteli keskin dipli şişeler.

1.5-2.0 ml kapasiteli ependorf tipi santrifüj tüpü.

100-400 mm kapasiteli mikrotest tüpü.

GOST 1770'e göre herhangi bir tasarımın 25, 50, 250 cm3 kapasiteli 2. doğruluk sınıfının ölçüm silindirleri.

Vidalı kapaklı santrifüj tüpü, 50 cm

125-150 mm çapında porselen fincan.

3 dm kapasiteli laboratuvar desikatörü.

GOST 25336 uyarınca huni laboratuvarı.

GOST 25336'ya göre 50, 100, 250 cm3 kapasiteli düz tabanlı şişeler.

GOST 25336'ya göre 10, 20, 50, 100 ve 200 cm3 kapasiteli kimyasal camlar.

Metrolojik ve teknik özellikler açısından yukarıdakilerden daha düşük olmayan ve gerekli ölçüm doğruluğunu sağlayan diğer ölçüm cihazlarının, yardımcı ekipmanların, mutfak eşyalarının ve ayrıca yukarıdakilerden daha kötü olmayan standart numunelerin, reaktiflerin ve malzemelerin kullanılmasına izin verilir. .

6 Örnekleme

Örnekleme - GOST 26313'e göre. Numunelerin hazırlanması ve saklanması - GOST 26671, GOST 32689.1, GOST 32689.2 ve GOST 32689.3'e göre.

7 Test için hazırlık

7.1 Genel gereksinimler

Testten önce, GOST 32689.1, GOST 32689.2 ve GOST 32689.3 gerekliliklerine uygun olarak reaktiflerin ve yardımcı malzemelerin kalite kontrolünün yanı sıra laboratuvar cam eşyalarının ön hazırlığı gerçekleştirilir.

7.2 Yardımcı çözeltilerin hazırlanması

7.2.1 Mobil faz A'nın hazırlanması

Sıkıca kapatılmış buzlu cam veya floroplastik tıpa ile 1000 ml kapasiteli bir ölçülü balonda, 1 ml buzlu asetik asit, 100 ml metanol pipetleyin ve bidistile su ile işarete getirin. Karışım iyice karıştırılır.

Mobil faz A'nın oda sıcaklığında raf ömrü - bir aydan fazla değil.

7.2.2 Mobil faz B'nin hazırlanması

Sıkıca kapatılmış buzlu cam veya floroplastik tıpalı 1000 ml kapasiteli ölçülü balona 1 ml glasiyal asetik asit pipetle konur ve metanol ile işarete getirilir. Karışım iyice karıştırılır.

Mobil faz B'nin oda sıcaklığında raf ömrü - bir aydan fazla değil.

NOT Mobil faz, kauçuk ve polimerik malzemelerle [politetrafloroetilen (PTFE) hariç] temas etmemelidir.

7.2.3 Çözücü 1'in hazırlanması

Uygun bir kapta, hacimce 99 kısım toluen ve hacimce bir kısım buzlu asetik asit karıştırın. Karışım iyice karıştırılır.

Solvent 1'in oda sıcaklığında raf ömrü 6 aydan fazla değildir.

7.3 Magnezyum sülfatın hazırlanması

Ekstraksiyonda sorbent olarak kullanılan susuz magnezyum sülfat, emilen nemi havadan uzaklaştırmak için son kullanma tarihi içinde bile kurutulmalıdır. Sorbent 180°C - 200°C sıcaklıkta 6-10 saat kalsine edilir ve susuz kalsiyum klorür üzerinde bir desikatörde saklanır. Reaktifin uygunluğu için kriter, çözelti ısıtıldığında ilave bir sulu tabakanın olmamasıdır, ekstraksiyon aşaması 30°C - 40°C'lik bir sıcaklığa gerçekleştirilir ve 2-3 dakika sonra reaksiyon kütlesi karıştırıldı.

7.4 Mikotoksin stok solüsyonlarının hazırlanması

7.4.1 PAT çözümlerinin hazırlanması

7.4.1.1 PAT stok solüsyonunun hazırlanması, kütle konsantrasyonu 200 µg/cm

2,0 mg saf kristal PAT alın, 0,01 mg hassasiyetle tartılır, 10 ml'lik ölçülü balonda az miktarda kloroform içinde çözülür ve ardından çözeltinin hacmini kloroform ile işarete getirin.

İlk PAT çözeltisinin 0°C'lik bir sıcaklıkta, alüminyum folyoya sıkıca sarılmış bir zemin tıpalı cam ölçülü bir şişede raf ömrü 1 aydan fazla değildir.

7.4.1.2 PAT çözeltisinin hazırlanması, kütle konsantrasyonu 20 µg/cm

1 ml elde edilen PAT stok çözeltisini (bakınız 7.4.1.1) 10 ml'lik ölçülü balona aktarın ve kloroform ile işarete kadar seyreltin. Çözeltideki PAT'ın tam kütle konsantrasyonunu belirlemek için elde edilen PAT standart çözeltisinden 5.0 ml alınır ve yaklaşık 15 cm kapasiteli bir kaba aktarılır, ardından kuru bir madde elde edilene kadar kloroform nitrojen temizliği ile çıkarılır. Kuru madde elde edildikten hemen sonra kaba 5.0 ml mutlak etanol eklenir. PAT'yi tamamen çözün. Elde edilen PAT çözeltisi, optik yol uzunluğu 1 cm olan bir kuvars küvete verilir, ardından çözeltinin spektrumu, kontrol olarak referans küvette mutlak etanol kullanılarak 250 ila 350 nm dalga boyu aralığında bir spektrofotometrede kaydedilir. .

Çözeltideki PAT kütle konsantrasyonu, µg/cm, formülle hesaplanır.

spektrumun optik yoğunluğunun maksimum değeri nerede (dalga boyu yaklaşık 275 nm), birimler. OP;

- 153.1 g/mol'e eşit PAT moleküler ağırlığı;

- Dönüşüm faktörü;


- 14600, m/mol'e eşit mol optik absorpsiyon (sönme) katsayısı.

7.4.1.3 100 µg/cm PAT solüsyonunun hazırlanması

200 µg/ml kütle konsantrasyonuna sahip kloroform içinde 5 ml başlangıç ​​PAT çözeltisi (bakınız 7.4.1.1), 10 ml kapasiteli bir ölçülü balona aktarılır, oda sıcaklığında kuru bir tortuya konsantre edilir. nitrojen ve hemen asetonitril içinde yeniden çözülür, şişedeki hacme etiketlere getirilir.

7.4.1.4 7.4.1.2 ve 7.4.1.3'e göre PAT çözeltilerinin 0°C'de, alüminyum folyoya sıkıca sarılmış bir zemin tıpalı cam ölçülü balonda raf ömrü 24 saatten fazla değildir.

Kullanımdan önce çözeltilerin sıcaklığı oda sıcaklığına getirilir (içeriği oda sıcaklığına ulaşana kadar alüminyum folyonun ölçülü balondan çıkarılmasına izin verilmez). PAT'nin tahrip olması nedeniyle, çözücünün çıkarılmasından sonra elde edilen ince bir kuru madde filmi şeklinde referans numunelerin saklanmasına izin verilmez -.

7.4.2 OTA stok solüsyonunun hazırlanması

7.4.2.1 20 µg/ml OTA stok solüsyonunun hazırlanması

0,01 mg hassasiyetle tartılan 2,0 mg saf kristal OTA'yı 25 ml'lik bir beher içinde çözücü 1 (bakınız 7.2.3) ile çözün ve kantitatif olarak 100 ml'lik bir ölçülü balona aktarın ve çözücü 1 ile işarete kadar seyreltin.

Bir çözeltideki OTA'nın tam kütle konsantrasyonunu belirlemek için, elde edilen ilk OTA çözeltisi, optik yol uzunluğu 1 cm olan bir kuvars küvete verilir, daha sonra çözeltinin spektrumu, dalga boyu aralığı 300 ila 300 arasında olan bir spektrofotometreye kaydedilir. 370 nm, referans küvet olarak solvent 1 kullanılarak.

İlk çözeltideki OTA'nın kütle konsantrasyonu, μg/cm, aşağıdaki formülle hesaplanır.

spektrumun optik yoğunluğunun maksimum değeri nerede (dalga boyu yaklaşık 333 nm'dir), birimler. OP;

- OTA'nın moleküler ağırlığı, 402.7 g/mol'e eşittir;

- Dönüşüm faktörü;

- Ek A'ya göre belirlenen düzeltme faktörü;

- 544, m/mol'e eşit molar optik absorpsiyon (sönme) katsayısı.

Orijinal OTA çözeltisinin eksi 18 ° C'lik bir sıcaklıkta, alüminyum folyoya sıkıca sarılmış bir zemin tıpalı cam hacimsel bir şişede raf ömrü dört yıldan fazla değildir.

7.4.2.2 5 µg/ml OTA solüsyonunun hazırlanması

2.5 ml OTA stok solüsyonundan (7.4.2.1) çekin, 10 ml'lik ölçülü balona aktarın ve işarete kadar solvent 1 (7.2.3) ile seyreltin.

Alüminyum folyoya sıkıca sarılmış bir zemin tıpalı cam ölçülü bir şişede 4 ° C sıcaklıkta bir OTA çözeltisinin raf ömrü 24 saatten fazla değildir.

Kullanımdan önce, çözeltinin sıcaklığı oda sıcaklığına getirilir (içerik oda sıcaklığına ulaşana kadar alüminyum folyonun ölçülü balondan çıkarılmasına izin verilmez) -.

7.5 PAT ve OTA kalibrasyon solüsyonlarının hazırlanması

PAT ve OTA kalibrasyon çözeltileri, stok çözeltilerinin belirli hacimlerde (bakınız 7.4.1.1 ve 7.4.2.1) belirlenecek analitleri içermeyen berrak elma suyu ile karıştırılmasıyla hazırlanır.

7.5.1 PAT kalibrasyon solüsyonlarının hazırlanması

7.5.1.1 1000 ng/cm PAT kütle konsantrasyonuna sahip bir ara çözeltinin hazırlanması (çözelti n-1)

1 ml PAT çözeltisi (bakınız 7.4.1.3) veya 100 µg/cm PAT kütle konsantrasyonuna sahip 1 ml standart PAT bileşimi numunesi, 100 ml kapasiteli ve hacmi olan bir ölçülü balona aktarılır. çözelti, asetonitril ile işarete ayarlanır.

7.5.1.2 10 ng/cm PAT kütle konsantrasyonuna sahip bir ara çözeltinin hazırlanması (çözelti n-2)

1 ml solüsyon -1'i (bkz. 7.5.1.1) 100 ml'lik ölçülü balona aktarın ve asetonitril ile işarete kadar seyreltin.

7.5.1.3 PAT kalibrasyon solüsyonlarının hazırlanması

Tablo 1'e göre seçilmiş belirli hacimlerde ara çözeltiler n-1 ve n-2 (bkz. 7.5.1.1 ve 7.5.1.2) ve 10 ml'lik ölçülü balonlara dağıtın.


Tablo 1 - Çözümlerin hacimleri n-1 ve n-2 PAT kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması için

Göstergenin adı	Kalibrasyon çözümleri
Çözüm hacmi n-2 cm
Çözüm hacmi n-1 cm
Enjekte edilen PAT miktarı, ng
Çözeltideki PAT kütle konsantrasyonu, ng/cm

7.5.2 OTA kalibrasyon solüsyonlarının hazırlanması

7.5.2.1 200 ng/ml OTA ara çözeltisinin hazırlanması (çözelti A-1)

Oda sıcaklığında nitrojen akışı altında kuruyana kadar 5 µg/ml OTA solüsyonundan (bakınız 7.4.2.2) 1 ml konsantre edin ve hemen asetonitril ile 25 ml'lik bir ölçülü balona aktarın.

7.5.2.2 10 ng/ml OTA ara çözeltisinin hazırlanması (çözelti ANCAK-2)

0,5 ml OTA ara çözeltisi ANCAK-1 (bkz. 7.5.2.1) 10 ml'lik ölçülü balona aktarılır ve asetonitril ile işarete kadar seyreltilir.

7.5.2.3 OTA kalibrasyon solüsyonlarının hazırlanması

Tablo 2'ye göre seçilmiş belirli hacimlerde ara çözeltiler ANCAK-1 ve ANCAK-2 (bkz. 7.5.2.1 ve 7.5.2.2) ve 10 ml'lik ölçülü balonlara dağıtın.


Tablo 2 - Çözümlerin hacimleri ANCAK-1 ve ANCAK-2 OTA kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması için

Göstergenin adı	Kalibrasyon çözümleri
Çözüm hacmi ANCAK-2 cm
Çözüm hacmi ANCAK-1 cm
Uygulanan OTA miktarı, ng
Çözeltideki OTA'nın kütle konsantrasyonu, ng/cm

Arıtılmış elma (veya diğer filtrelenmiş) suyu ile şişelerdeki çözeltinin hacmini işarete getirin.

HPLC-MS/MS'de test için, sisteme 7.5.1.3 ve 7.5.2.3'e göre hazırlanan ve 8.3.1'deki koşullar dikkate alınarak 7.7'ye göre kalibre edilen 10 mm PAT ve OTA kalibrasyon çözeltileri enjekte edilir.

Kalibrasyon çözeltisinin 0°C - 4°C sıcaklıkta, zemin tıpalı cam ölçülü balonda raf ömrü 24 saatten fazla değildir.

7.6 LC/MS/MS sisteminin hazırlanması

HPLC-MS/MS sisteminin ölçümler için hazırlanması, çalıştırma kılavuzuna (talimatına) ve Ek B'de verilen bilgilere göre gerçekleştirilir.

Kütle spektrometresinin çalışma modlarını ayarlarken, Ek B'de verilen mikotoksinlerin belirlenmesi için MS/MS parametrelerinin kullanılması tavsiye edilir.

Bu durumda, aşağıdaki koşullar yerine getirilmelidir:

- 20°С ila 25°С arasında ortam hava sıcaklığı;

- 84 ila 106 kPa arasındaki atmosferik basınç;

- şebeke gerilimi (220±10) V;

- şebekedeki akımın frekansı 49 ila 51 Hz;

- bağıl hava nemi %40 ila %80 arası.

7.7 HPLC-MS/MS sisteminin kalibrasyonu

Sistemin 7.5'e göre meyve sularındaki mikotoksin çözeltileri ile kalibrasyonu, HPLC-MS/MS sisteminin kullanım kılavuzuna (talimatına) göre ve ayda bir 8.3.1'e göre koşullar dikkate alınarak gerçekleştirilir. PAT ve OTA'nın pik alanları kromatogramlarda belirlenir ve 7.5'e göre konsantrasyon aralığındaki pik alanından bir kalibrasyon bağımlılığı belirlenir. Kalibrasyon çözeltileri hazırlama prosedürüne uygun olarak, her kalibrasyon noktasında mikotoksinlerin kütle konsantrasyonunun hesaplanan değerlerinin korelasyon katsayısını ve gerçek değerden sapmasını hesaplayın (bkz. 7.5). Korelasyon katsayısı en az 0,999 (PAT için) ve 0,965 (OTA için) ve hesaplanan kütle konsantrasyonu değerinin gerçek değerden bağıl sapması ±%10'dan fazla değilse kalibrasyon kabul edilebilir olarak kabul edilir.

Göreceli bir sapma yerine, bir kalibrasyon özelliğinin kabul edilebilirliği, %5'i geçmemesi gereken bir bağıl standart sapma ile değerlendirilebilir.

8 Test

8.1 Ekstraksiyon

10 ml () önceden iyice karıştırılmış meyve suyu ürünleri, 50 ml kapasiteli vidalı kapaklı bir santrifüj tüpüne yerleştirilir, test tüpüne 20 ml asetonitril ve 15 g susuz magnezyum sülfat eklenir. Karışım, manuel olarak veya bir çalkalayıcı ile üç ila beş dakika yoğun bir şekilde karıştırılır. Karıştırıldıktan sonra elde edilen ekstrakt, oda sıcaklığında 4000-5000 rpm'de 10 dakika veya 5°C sıcaklıkta soğutma ile bir santrifüj varlığında 5 dakika santrifüjlenir. Santrifüjlemeden sonra özütün toplam hacmini ölçün (). Pipet veya dozlama cihazı ile alınan ekstraktın 18-19 cm'si () 25 cm, 1 cm () asetonitril kapasiteli sivri dipli bir şişeye aktarılır.

Kabın duvarlarında çözünmeyen karamel film varsa, üç ila beş dakika ultrasonik banyoda yok edilir. Çözelti, 1.5-2.0 cm3 kapasiteli Eppendorf tipi bir tüpe aktarılır ve 10.000-12.000 rpm'de 3-5 dakika santrifüjlenir. Üst tabaka alınır ve 0.2-0.4 µm gözenek boyutuna sahip bir mikrofiltreden doğrudan 100-400 mm kapasiteli bir mikrotüp içine süzülür. HPLC-MS/MS testi için hazırlanan numunenin 10 mm'si sisteme enjekte edilir.

8.2 Konsantre ürünlerden numune hazırlama

Konsantre meyve suları (püre), belirli bir meyve suyu ürünü türü için düzenleyici belgeler tarafından şart koşulan minimum çözünür katı düzeyine kadar suyla sulandırılır. Asgari düzeyde çözünür katıların sağlanmadığı konsantre meyve suyu ürünleri, % 11.2 çözünür katı içeriğine bidistile su ile geri yüklenir. Çözünür katıların içeriği GOST 29030'a göre kontrol edilir.

Sulandırılmış numunelerin ekstraksiyonu 8.1'e göre yapılır.

8.3 Ölçüm alma

8.3.1 Genel koşullar

8.1'e göre hazırlanan numuneler ve kalibrasyon çözeltileri seçilen sırayla enjekte edilir. En yaygın yöntem, kalibrasyon çözeltilerinin enjeksiyonunun bir dizi numune enjeksiyonunu başlatıp bitirmesidir.

HPLC-MS/MS sistemi şu şekilde ayarlanmalıdır: SRM analiz edilen mikotoksinlerin seçici olarak saptanmasını sağlayan geçişlerle. Tutma süreleri ve tepe alanları, HPLC-MS/MS sistemine bağlı analiz sonuçlarının kaydedilmesi ve hesaplanması için analiz yazılımı kullanılarak belirlenir. HPLC/MS/MS sistemleri, ayırma koşulları ve kütle spektrometrik algılama örnekleri Ek B'de verilmiştir.

Numuneler, GOST ISO 5725-1 (alt bölüm 3.14) ve GOST ISO 5725-2'ye göre iki paralel belirleme için tekrarlanabilirlik koşulları altında test edilir.

8.3.2 Mikotoksinlerin tanımlanması

Mikotoksinleri belirlemek için numune çözeltilerinden elde edilen tutma süreleri, kalibrasyon çözeltilerinden karşılık gelen mikotoksinlerin tutma süreleri ile karşılaştırılır. Mikotoksinlerin varlığını doğrulamak için, birinci ve ikinci sinyal yoğunluklarının oranı arasında bir karşılaştırma yapılır. m/z- Kalibrasyon çözeltilerinden gelen mikotoksin sinyallerinin yoğunluk oranı ile geçiş.

Bir mikotoksin için piklerin oranı, beklenen sinyal yoğunlukları oranından %20'den fazla farklılık göstermemelidir.

9 Test sonuçlarının işlenmesi ve sunumu

9.1 Niceleme

Hazırlanan ekstraktın enjekte edilen hacmindeki mikotoksinlerin miktar tayini (bakınız 8.1), mikotoksin pikinin alanı (veya yüksekliği) ile bu mikotoksin için karşılık gelen kalibrasyon karakteristiği karşılaştırılarak gerçekleştirilir.

Test edilen ürünlerdeki mikotoksinlerin kütle konsantrasyonu, µg/dm, aşağıdaki formülle hesaplanır.

kübik santimetreden kübik desimetreye dönüştürme faktörü nerede;

- HPLC-MS/MS sistemine enjekte edilen 10 mm'lik ekstrakt hacmindeki mikotoksin konsantrasyonu, kalibrasyon bağımlılığı, ng ile belirlenir;

konsantre edildikten sonra özün yeniden çözüldüğü asetonitril hacmidir, cm;

- konsantrasyon için hacmin alındığı ekstraktın toplam hacmi, cm;

- kromatografa verilen numune hacmi (=10 mm), mm;

- test için alınan meyve suyu örneğinin hacmi, cm;

- konsantrasyon için seçilen ekstraktın hacmi, bkz.

Konsantre meyve suyu ürünlerindeki mikotoksin miktarı hesaplanırken, su ile seyreltme derecesi 8.2'ye göre dikkate alınır.

Kabul koşulu karşılanıyorsa, ölçüm sonucu, üç paralel belirlemenin sonuçlarının aritmetik ortalaması olarak alınır.

nerede , paralel belirlemelerin elde edilen üç sonucundan maksimum ve minimum değerlerdir, µg/dm;

, , - üç paralel belirlemenin sonuçları, µg/dm;

- kritik aralığın değeri, %.

Aynı laboratuvarda gerçekleştirilen üç paralel belirleme (ortalama değerin yüzdesi olarak) arasındaki tutarsızlık, olasılık = 0.95 ile 3.6·'ya eşit tekrarlanabilirlik (yakınsama) sınırını aşmamalıdır. Bu koşul karşılanırsa, nihai ölçüm sonucu, üç paralel belirlemenin aritmetik ortalaması olarak alınır ve üçüncü ondalık basamağa yuvarlanır.

Ölçüm sonuçları, GOST ISO / IEC 17025'e uygun olarak protokole kaydedilir.

9.2 Elde edilen sonuç, mikotoksin içeriğinin kalibrasyon bağımlılığı aralığının üst sınırını aştığını gösteriyorsa, su ile seyreltmesini artırarak yeni bir numune hazırlayın ve yeniden ölçün.

10 Metrolojik özellikler

PAT ve OTA için yöntemin metrolojik özellikleri Tablo 3'te verilen koşullara karşılık gelir.


Tablo 3 - HPLC-MS/MS Yöntemi Kesinliği

Ölçüm aralığı, µg/dm	Tekrarlanabilirliğin bağıl standart sapması, %	Tekrarlanabilirliğin bağıl standart sapması, %
PAT belirlenirken (artık yok)
OTA belirlenirken (artık yok)

Meyve suyu ürünleri numunelerinde PAT ve OTA tespit limitleri: LOD- 0.03 mcg/dm, LOQ- 0.1 mcg/dm.

11 Ölçüm sonuçlarının kalite kontrolü

Laboratuvardaki ölçüm sonuçlarının kalite kontrolü, ara kesinliğin standart sapmasının stabilite kontrolünü kullanarak ölçüm sonuçlarının stabilitesinin izlenmesini içerir. Stabilite testi, Shewhart'ın kontrol çizelgeleri kullanılarak gerçekleştirilir. Yapılan ölçümlerin sonuçlarının kararlılığının izlenme sıklığı, kalite sisteminin iç belgelerinde düzenlenir. Tatmin edici olmayan kontrol sonuçları durumunda, örneğin, eylem sınırı aşıldığında veya uyarı sınırı düzenli olarak aşıldığında, reaktiflerin değiştirilmesi, operatörün çalışmasının kontrol edilmesi dahil olmak üzere bu sapmaların nedenleri bulunur.
GOST 12.1.007.

DİKKAT! Mikotoksinlerle çalışırken, PAT ve OTA'nın belirgin nefrotoksik, immünotoksik, teratojenik ve genotoksik etkileri olan güçlü toksik özelliklere sahip olduğu dikkate alınmalıdır. Sınıflandırmaya göre IARC OTA, insanlar için potansiyel olarak tehlikeli kanserojenleri ifade eder (grup 2B). Mikotoksinlerle çalışırken daha fazla güvenlik önlemi alınmalıdır. Laboratuvar personeli yüz siperi, eldiven ve gözlük dahil koruyucu giysiler giymelidir. Mikotoksinlerle yapılan tüm işlemler davlumbazda gerçekleştirilir. Çalışmanın tamamlanmasının ardından kullanılmış laboratuvar cam ürünleri ve atıkları dekontaminasyona tabi tutulur.

Ek A (zorunlu). Standart çözeltilerde mikotoksinlerin kütle konsantrasyonlarını hesaplamak için spektrofotometrenin doğrulanması ve düzeltme faktörü CF'nin belirlenmesi

Ek A
(zorunlu)

Standart çözeltilerdeki mikotoksinlerin kütle konsantrasyonlarını hesaplamak için spektrofotometrenin doğrulanması ve düzeltme faktörünün belirlenmesi

A.1 Stok çözeltilerdeki mikotoksinlerin kütle konsantrasyonlarını belirlemek için (bakınız 7.4.1.1 ve 7.4.2.1), dalga boyu aralığında 1 cm optik yol uzunluğuna sahip bir kuvars küvet içindeki çözeltilerin optik yoğunluğunu ölçmek için uygun bir spektrofotometre kullanın. 200 nm'den 400 nm'ye kadar.

Spektrofotometrenin kalibrasyonu aşağıdaki gibi yapılır.

Sülfürik asit (HSO) içindeki üç potasyum dikromat (KCrO) çözeltisinin optik yoğunluğunu ölçün - 0.25; 0.125 ve 0.0625 mmol / dm maksimum absorpsiyon noktasında (dalga boyu yaklaşık 350 nm), kontrol olarak 0.009 mmol / dm konsantrasyona sahip bir sülfürik asit (HSO) çözeltisi kullanılır.

Daha sonra, formüle göre her potasyum dikromat konsantrasyonu için optik yoğunluğun molar katsayısının değeri hesaplanır, m/mol

karşılık gelen konsantrasyon için sülfürik asit içindeki bir potasyum dikromat çözeltisinin optik yoğunluğunun ölçülen değeri, birimler. OP;

- sülfürik asit içinde potasyum dikromat çözeltisi konsantrasyonu, mmol/dm.

Ölçülen üç değer arasındaki fark, garanti edilen optik yoğunluk ölçüm doğruluğu aralığının dışındaysa, kalibrasyon prosedürü veya ekipmanı kontrol edilmelidir. Aritmetik ortalamayı hesaplayın.

Formüle göre belirli ekipman (spektrofotometre ve küvet) için düzeltme faktörünü (boyutsuz değer) belirleyin

potasyum dikromat (KCrO) çözeltileri için molar optik yoğunluk katsayısının karakteristik değeri, m/mol;

- (A.1) formülüne göre hesaplanan mol optik yoğunluk katsayısı, m/mol.

Ortaya çıkan düzeltme faktörü değeri 0,95'ten küçük veya 1,05'ten fazlaysa, sapmaları ortadan kaldırmak için kalibrasyon prosedürü veya ekipmanı kontrol edilmelidir (kalibrasyon ve saflık için aynı küvet seti kullanılır) -.

Ek B (bilgilendirici). Meyve sularında ve diğer meyve sularında mikotoksinlerin belirlenmesi için HPLC-MS/MS sistemlerine örnekler*

Ek B
(referans)

________________
* Bu örnekler tavsiye edilir ve bu Uluslararası Standardın kullanıcılarının rahatlığı için sağlanmıştır.

B.1 HPLC-MS/MS Sistem No. 1

Donanım platformu: Varian 320-MS LC/MS/MS.

İyonik