Metody oznaczania mikotoksyn. Laboratoryjne metody diagnozowania mykotoksyn. Mikotoksyny i metody ich oznaczania

Po urodzeniu szczeniąt rozpoczyna się dla suczki i jej właścicieli odpowiedzialny okres, w którym należy dbać nie tylko o karmienie i zdrowie suczki, ale także o noworodki. Po urodzeniu szczeniąt, przez pierwszy lub dwa dni suka może mieć słaby apetyt, niestrawność, zwłaszcza jeśli dużo zjadła poporodu.

Pamiętaj, że w tym okresie nie powinieneś uciekać się do antybiotyków - wpłynie to niekorzystnie na zdrowie niemowląt. Staraj się radzić sobie z bezpieczniejszymi lekami (takimi jak zioła, probiotyki, płukanie żołądka, węgiel aktywowany, a najlepiej lignityna). Bardzo dobre wyniki w tym przypadku uzyskuje się stosując absolutnie nieszkodliwe preparaty homeopatyczne firmy Heel i nie trzeba szukać weterynaryjnych, „ludzkie” działają nie gorzej. Spróbuj jednego lub dwóch wstrzyknięć podskórnych Echinacea compositum, Nux vomica, Berebe-ris-hommacord. Dobre wyniki uzyskuje się stosując lek w tabletkach tej samej firmy Diar-heel. Lek podaje się 3 razy dziennie po 1 tabletce. Wyniki są lepsze, jeśli zostanie wstępnie rozpuszczony w 1,5 łyżce przegotowanej wody i dokładnie wymieszany.

W ciągu pierwszych trzech dni po porodzie należy zachować ostrożność podczas karmienia, aby nie pogłębić ewentualnego zaburzenia. Zagraniczni autorzy w tym okresie sugerują podawanie ugotowanych małych kurczaków, zmielonych razem z kośćmi i zmieszanych z gotowanym ryżem.

Już po pierwszych dniach po porodzie suka zauważalnie poprawia apetyt i jest to całkiem naturalne – potrzeby jej organizmu zauważalnie wzrastają. Najpierw zaczyna aktywnie produkować siara, a potem mleko. W dużej mierze ilość i jakość mleka zależą nie tylko od indywidualnych cech suki, ale także od jej karmienia.

W pierwszym tygodniu ilość paszy przekracza zwykłą dietę 1,5 razy. Ale w tym okresie suce nie należy podawać zbyt dużo mięsa, aby nie spowodować rzucawki. Jako składnik białkowy w tym czasie możesz podać ryby lub twarożek. Sukę karmić często (co 4-5 godzin), małymi porcjami. Po przywróceniu normalnej funkcji żołądka konieczne jest wznowienie podawania suplementów mineralnych i środków wzmacniających sierść.

• mięso, ryby i podroby - 45%,
• zboża - 30%,
• mleko i przetwory mleczne - 10%,
• warzywa - 15%.

Aby suka w okresie laktacji miała więcej mleka, powinna włączyć do swojej diety pokarmy sprzyjające laktacji: surową marchew, mięso, ryby, bulion, płatki owsiane itp. Tak często, jak to możliwe, podawaj suce do picia: mleko (jeśli nie powoduje zaburzeń), herbata z mlekiem, słaba kawa z mlekiem. Aby zwiększyć ilość mleka, możesz spróbować:

• wywar z oregano;
• wywar z melisy: jedną łyżeczkę trawy zalać dwiema szklankami wrzącej wody, zaparzyć, dodać cukier;
• włożyć dwie łyżeczki herbaty do termosu, zalać dwiema szklankami wrzącego mleka, parzyć 3-4 godziny, następnie dodać cukier i ostudzić;
• wywar z anyżu.

Apilac, który wielu właścicieli daje sukom w celu zwiększenia laktacji, nie przyniósł w mojej praktyce pożądanych rezultatów, chociaż starałem się podawać go różnym sukom.

Jeśli pies stanowczo odmawia picia, możesz oczywiście spróbować go zmusić do picia, ale lepiej najpierw spróbować „oszukać” go, wkładając mały kawałek masła do jeszcze wystarczająco ciepłego napoju. Bardzo możliwe, że uwiedzie ją zapach masła.

Aby nie dopuścić do wyczerpania suki, jej karmienie w tym okresie powinno być kompletne, a karma powinna zawierać wystarczającą ilość kalorii, białka, witamin i minerałów.

Jednak przez cały okres laktacji ilość pokarmu nie jest stała. Jak już wspomniano, w pierwszym tygodniu dietę należy zwiększyć 1,5 raza. Wraz ze wzrostem ilości mleka u suki, racja powinna również wzrastać: w drugim tygodniu rację należy podwoić, a od trzeciego tygodnia do końca laktacji potroić: Porównanie z dietą pies w swoim normalnym stanie. Ilość pokarmu, jakiej potrzebuje suka, zależy od wielkości jej miotu. Cztery szczenięta w miocie wymagają dwukrotnego zwiększenia diety, a osiem szczeniąt wymaga co najmniej trzykrotnego zwiększenia.

Zazwyczaj suka karmi szczenięta przez 4-6 tygodni. Ilość mleka produkowanego przez sukę nie jest stała przez całą laktację. Do 20-25 dnia ilość mleka wzrasta, a następnie maleje. Zachodni eksperci oferują bardzo łatwy sposób na obliczenie zawartości kalorii w paszy w tym okresie. Metoda ta polega na zważeniu całego miotu w wieku 3-4 dni, dodaniu do diety suki 250 kcal dodatkowej energii na każdy kilogram szczeniąt i zgodnie z tym zwiększeniem ilości i kaloryczności karmy.

Czas trwania laktacji zależy od indywidualnych cech i sposobu karmienia psa. W każdym przypadku należy oczywiście wziąć pod uwagę indywidualne cechy psa. Są suki, które szczenięta dosłownie „wysysają”, produkują mleko przez długi czas, w dużych ilościach i karmią szczenięta nawet przez dwa miesiące. Naturalnie ich dieta powinna być większa i pełniejsza niż u suk, które mają mało mleka nawet w samym „szczycie produkcji mleka”, który przypada na 14-17 dzień laktacji i których właścicielka po prostu marzy, że będzie karmić dzieci do trzech tygodni. W dużym stopniu na produkcję mleka suki wpływa kompletna dieta białkowa, bogata w niezbędne aminokwasy. Brak aminokwasów wpływa przede wszystkim na jakość mleka, a także na jego ilość, a to powoduje spowolnienie tempa wzrostu szczeniąt i spowolnienie ich rozwoju.

Witaminy odgrywają również ważną rolę w żywieniu suk w okresie laktacji. Są potrzebne nie tylko dla samych suk, ale także dla rozwoju szczeniąt. Konieczne jest, aby suka otrzymywała wymaganą ilość witamin przez cały okres laktacji. Na przykład zawartość witaminy A w mleku, tak niezbędnej do wzrostu szczeniąt, zależy tylko od jej obecności w paszy matki*. Dlatego właściciel powinien monitorować stałą obecność tej witaminy w diecie suki karmiącej. Dotyczy to również witaminy D i witamin z grupy B, które w dużych ilościach są wydalane z mlekiem psa.

Do produkcji mleka suka potrzebuje takiej samej dodatkowej energii, jaka jest zawarta w mleku wydalanym. Dlatego wartość energetyczna diety będzie zależeć przede wszystkim od laktacji suki. Zawartość kalorii w paszy zależy również od okresu laktacji. Wiadomo, że w pierwszym i drugim tygodniu laktacji suka produkuje mniej mleka niż w trzecim i czwartym. Dlatego dietę należy tak skomponować, aby w pierwszej połowie okresu laktacji energochłonność paszy wzrosła 2-krotnie, w drugiej 3-krotnie w stosunku do zapotrzebowania suki w stanie normalnym. W praktyce wygląda to tak: do wytworzenia mleka w pierwszej połowie laktacji karmiąca suka o masie ciała 10 kg potrzebuje dodatkowej diety o zawartości kalorii 750 kcal oprócz głównej, a w kolejne dwa tygodnie – 1500 kcal dziennie.

Natychmiast po porodzie kobiece gruczoły sutkowe wydzielają siarę. Należy upewnić się, że każdy nowo narodzony szczeniak musi otrzymać siarę zawierającą specyficzne przeciwciała.

Ogromne znaczenie dla tworzenia mleka mają minerały, których brak powoduje różnego rodzaju choroby osteodystroficzne nie tylko u suk w okresie laktacji, ale także u potomstwa. W tym samym czasie kręgosłup karmiących samic jest ubogi w minerały i staje się porowaty, kruchy, pojawia się osteoporoza i krzywica u nowo narodzonych szczeniąt. Ważne jest zapobieganie gromadzeniu się rezerw mineralnych w czasie ciąży, au młodych suk - w okresie wzrostu i przygotowania do pierwszej laktacji. Suki w okresie laktacji potrzebują więcej soli niż suki niew okresie laktacji.

Skład jakościowy i dobowa energochłonność diet suk karmiących o wadze 5 kg w I-II i III-IV tygodniu laktacji

Skład jakościowy i dobowa energochłonność diet suk karmiących o wadze 15 kg w I-II i III-IV tygodniu laktacji

Skład jakościowy i dobowa energochłonność diety suk karmiących o wadze 25 kg w I-II i III-IV tygodniu laktacji

Metody oznaczania mikotoksyn

Nowoczesne metody wykrywania i oznaczania zawartości mykotoksyn w żywności i paszy obejmują metody przesiewowe, ilościowe, analityczne i biologiczne. Metodologia mykotoksyn rozwija się bardzo szybko. Liczba opracowanych metod i różnych modyfikacji sięga już kilkuset i wciąż rośnie.

Metody przesiewowe, charakteryzujące się prostotą i szybkością analizy, pozwalają szybko i niezawodnie „odsiać” próbki niezanieczyszczone. Obejmują one powszechnie stosowane metody, takie jak test minikolumnowy dla aflatoksyn, ochratoksyny A i zearalenonu; metody TLC do równoczesnego oznaczania do 30 różnych mikotoksyn; fluorescencyjna metoda wykrywania zanieczyszczeń aflatoksynami itp.

Ilościowe metody analityczne do oznaczania mikotoksyn można podzielić na testy chemiczne, radioimmunochemiczne i immunoenzymatyczne. Metody chemiczne są obecnie najpowszechniejsze i obejmują kolejne etapy izolacji i właściwego oznaczania ilościowego mikotoksyn. Etap izolacji składa się z dwóch etapów: ekstrakcji – oddzielenia mikotoksyn od podłoża oraz oczyszczania – oddzielenia mikotoksyn od związków o podobnych właściwościach fizycznych i chemicznych. Ostateczna separacja mikotoksyn odbywa się za pomocą jedno- lub dwuwymiarowej chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na płytkach z żelem krzemionkowym w różnych układach rozpuszczalników, chromatografii gazowej i gazowo-cieczowej, wysokosprawnej chromatografii cieczowej i spektrometrii masowej. Ilościowe oznaczenie mikotoksyn odbywa się zwykle przez bezpośrednie porównanie intensywności fluorescencji na TLC w świetle ultrafioletowym ze wzorcami o znanym stężeniu, zarówno wizualnie, jak i densytometrycznie. Aby poprawić wiarygodność metod, stosuje się różne testy potwierdzające, polegające na przygotowaniu pochodnych mikotoksyn o innych właściwościach chromatograficznych, kolorymetrycznych lub fluorymetrycznych.

Ostatnie lata charakteryzowały się zwiększoną dbałością o rozwój wysoce czułych i wysoce specyficznych metod radioimmunochemicznych i immunoenzymatycznych do wykrywania, identyfikacji i ilościowego oznaczania mikotoksyn. Metody te opierają się na uzyskaniu antysurowic na koniugantów mikotoksyn z albuminą surowicy bydlęcej. Ich zaletą jest wyjątkowa czułość, która umożliwia wykrywanie pikogramów mikotoksyn i prowadzenie prac w kierunku automatyzacji procesu oznaczania. Metody biologiczne, zwykle mało specyficzne i czułe, wykorzystywane są głównie do wykrywania mikotoksyn, dla których chemiczne metody analizy nie są dostępne, lub jako testy potwierdzające. Obiektami badań są różne mikroorganizmy, zarodki kurze, wiele zwierząt laboratoryjnych, kultury komórkowe i tkankowe.

W celu oznaczenia zawartości mykotoksyn w składzie produktów spożywczych preparatykę próbek przeprowadza się metodą ekstrakcji do fazy stałej na wkładach zagęszczających „Diapak” (p. 3.2.3). Separacja, identyfikacja i ilościowe oznaczanie mikotoksyn w przygotowanych próbkach odbywa się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na chromatografie mikrokolumnowym serii Milichrome-5 o budowie modułowej (rys. 12).

Ryż. 12. Chromatograf mikrokolumnowy

W pracy omówiono wersję HPLC z odwróconą fazą do oznaczania patuliny. Detekcję przeprowadza się przy długości fali 276 nm. Do dokładnej identyfikacji patuliny wykorzystuje się również detekcję wielofalową, co umożliwia wykorzystanie współczynników widmowych jako dodatkowego parametru identyfikacyjnego. Rozdział jest przeprowadzany w trybie elucji gradientowej, co poprawia rozdzielczość i czułość analizy.

Ryż. 13. Chromatograf cieczowy:

1 - pompa; 2 – jednostka wtrysku próbki; 3 – kolumna chromatograficzna; 4 - detektor;
5 - dren do eluatu lub kolektor dla frakcji; 6 - rejestrator (rejestrator,
integrator lub komputer osobisty)

6
4

Analizę próbki za pomocą chromatografu cieczowego (rys. 13) przeprowadza się w następujący sposób. Pewna objętość analizowanego roztworu próbki jest wprowadzana do górnej części kolumny chromatograficznej (3) za pomocą jednostki do wstrzykiwania próbki (2). Za pomocą pompy (1) analizowana mieszanina jest przepompowywana z eluentem przez kolumnę chromatograficzną (3), w której analizowana mieszanina jest rozdzielana na odrębne frakcje (składniki). Eluat wypływający z kolumny, zawierający oddzielone składniki, jest analizowany przez detektor (4), którego odczyty są rejestrowane przez rejestrator (6).

1. 
   Podstawy metodologiczne HPLC

Aby zrozumieć istotę metody HPLC stosowanej do oznaczania patuliny, konieczne jest zbadanie niektórych aspektów metodologicznych, które leżą u jej podstaw.

Szeregi eluotropowe. Moc eluentu eluentu to zdolność eluentu (rozpuszczalnika lub mieszaniny rozpuszczalników) do wyparcia adsorbatu z powierzchni adsorbentu. W tym przypadku im silniejsze cząsteczki eluentu są zaadsorbowane w miejscach aktywnych sorbentu, tym większa jest jego moc elucyjna. Rozpuszczalniki ułożone w rzędzie, zwiększające siłę elucji, tworzą szereg eluotropowy.

Jako eluenty do chromatografii z odwróconą fazą stosuje się mieszaniny rozpuszczalników zawierające wodę i związki organiczne modyfikujące siłę elucji - n-alkohole, acetonitryl, tetrahydrofuran i inne, które z wodą tworzą prawdziwe roztwory. W chromatografii z normalną fazą jako eluenty stosuje się modyfikatory polarne - węglowodory liniowe i cykliczne (heksan, cykloheksan, heptan itp.).

Detektory do chromatografów cieczowych. Obecnie opracowano ponad 20 detektorów HPLC. Pięć jest najczęściej używanych, z których trzy są optyczne, a dwa elektrochemiczne. Te pięć detektorów pozwala na analizę wszystkich klas substancji organicznych i nieorganicznych.

Detektory optyczne obejmują detektor spektrofotometryczny (ultrafiolet (UV), działający w zakresie długości fal)
200–360 nm i widoczne w zakresie długości fal 360–780 nm), detektory fluorymetryczne i współczynniki załamania światła; do detektorów elektrochemicznych - woltamperometrycznych i konduktometrycznych. Szczególne znaczenie ma detektor spektrometrii masowej, który posiada unikalną zawartość informacyjną, ponieważ pozwala na identyfikację chromatograficznie odseparowanych składników za pomocą baz danych widm mas substancji.

Detektor spektrofotometryczny jest najpopularniejszym detektorem HPLC. Zasada jego działania opiera się na znanym prawie absorpcji światła Bouguera-Lamberta-Beera. Detektor spektrofotometryczny rejestruje widma selektywnej absorpcji promieniowania przez substancję. Widma absorpcyjne zależą od struktury badanej substancji. Pozwala to na identyfikację substancji na podstawie jej widma, posiadającej bibliotekę widm lub standardów. Zgodnie z prawem Bouguera-Lamberta-Beera intensywność pasm spektralnych zależy od stężenia substancji, co jest podstawą analizy ilościowej, czyli określenia stężenia substancji.

Niech monochromatyczne światło ze źródła o intensywności I 0 spada na rów o długości ja (Ścieżka optyczna). Kuweta jest wypełniona roztworem substancji o stężeniu Z. Substancja jest zdolna do pochłaniania promieniowania monochromatycznego. Miarą zdolności do pochłaniania danego promieniowania monochromatycznego jest wartość ε jest molowym współczynnikiem absorpcji lub współczynnikiem ekstynkcji. Osłabiona wiązka światła wychodzi z kuwety z intensywnością I. Zgodnie z prawem pochłaniania światła na długości fali λ= stały

I= I 0 ∙10 -ε Cl , (7)

gdzie I to intensywność strumienia światła po przejściu przez kuwetę;
I 0 to intensywność padającego strumienia światła; ε jest współczynnikiem ekstynkcji; Z to stężenie molowe substancji w kuwecie; ja to długość kuwety.

Postawa I do I 0 , wyrażone w procentach, nazywa się transmisją T, a wartość A=lg(I 0 / I) – gęstość optyczna.

A=lg(I 0 /I)= ε С∙ja. (8)

Gęstość optyczna substancji jest wprost proporcjonalna do stężenia analitu. W detektorach spektrofotometrycznych wielkością analityczną jest gęstość optyczna ALE. Wzór (8) służy jako podstawa do analizy ilościowej przy użyciu detektora spektrofotometrycznego, ponieważ gęstość optyczna ALE substancja jest wprost proporcjonalna do wysokości lub powierzchni piku chromatograficznego.

Zależność gęstości optycznej ALE od długości fali światła padającego na kuwetę z substancją w zakresie długości fal od 190 do 360 nm nazywamy widmem absorpcji w ultrafiolecie (rys. 14).

200 230 260 290 320 350 λ , nm

ALE, fr.p.
Ryż. 14. Widmo absorpcyjne roztworu wodnego w ultrafiolecie
Substancje X

3.2.3. przygotowanie próbki

Każda substancja ma długość fali o maksymalnej absorpcji
(λ , nm). Podczas korzystania z tej długości fali detektor ma najniższy próg wykrywania substancji.

Za pomocą detektora spektrofotometrycznego (SPD) wykrywana jest duża liczba substancji różnych klas, które pochłaniają światło ultrafioletowe.

Zastosowanie detektora spektrofotometrycznego w chromatografii znacznie ułatwia identyfikację. Detektor wielu długości fal w połączeniu z oprogramowaniem pozwala uzyskać chromatogram na kilku długościach fali jednocześnie i obliczyć dodatkowy parametr do identyfikacji składników - widmowypostawa (Q) to stosunek wysokości piku chromatograficznego przy różnych długościach fali

gdzie ALE 1 i ALE 2 - współczynniki gęstości optycznej przy długościach fal 1 i 2. Wartość Q dla każdej substancji jest stałą cechą i nie zależy od jej stężenia. Dokładność stosunków widmowych zależy od wartości gęstości optycznej substancji oraz konstrukcji detektora.

Przygotowanie próbki metodą ekstrakcji do fazy stałej na wkładach koncentracyjnych pozwala zaoszczędzić czas i koszty pracy. Ekstrakcja do fazy stałej pozwala na zatężenie próbki i oczyszczenie jej z towarzyszących zanieczyszczeń. Złożony schemat ekstrakcji do fazy stałej przewiduje sekwencyjne użycie dwóch wkładów:

– uniwersalny wkład koncentracyjny „DIAPAK P-Z” – wkład wielokrotnego użytku (do 50 próbek) z kompletem filtrów górnych i dolnych (10 sztuk);

– uniwersalny wkład do dokładnego czyszczenia „DIAPAK S” – wkład jednorazowy.

Do przygotowanie nabojów koncentrujących musisz wykonać następujące operacje.

Do przygotowanie wkładu koncentracyjnego "DIAPAK P-Z":

- przepompować przez kartridż 10 ml mieszaniny woda-acetonitryl (58:42);

– bezpośrednio przed przygotowaniem próbki przepompować przez kartusz 10 ml wody destylowanej.

Do przygotowanie wkładu zagęszczającego „DIAPAK S”:

- przepompować 5 ml benzenu przez wkład i zatkać wkład na obu końcach.

Przygotowanie produktu spożywczego do koncentracji

Próbkę ważącą 10,0 g umieścić w szklanej zlewce, wymieszać z niewielką ilością wody destylowanej i przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dodaj do kolby 6,0 ml roztworu Carreza I i roztworu Carreza II. Doprowadzić zawartość kolby do kreski wodą destylowaną, dokładnie wymieszać i przefiltrować do cylindra miarowego przez papierowy filtr harmonijkowy. Zmierz objętość klarownego filtratu P.

Podczas przygotowywania klarowanych soków i napojów przefiltrować próbkę przez gęsty filtr papierowy do uzyskania 20 ml klarownego filtratu P.

Stężenie próbki na wkładzie "DIAPAK P-Z"

Całą objętość filtratu P nałożyć na wcześniej przygotowany wkład z szybkością 1–2 kropli na sekundę.

Wypłucz wkład 5 ml wody podwójnie destylowanej, wyrzucając wszystkie popłuczyny.

Wypłucz patulinę z 10 ml wkładu z octanem etylu do kolby lub zakorkowanej probówki miarowej zawierającej 5 ml
1,5% wodny roztwór węglanu sodu, zakorkować, energicznie wymieszać i pozostawić do złuszczania.

Zmontuj kolumnę suszącą, wypełniając obudowę filtra około 2 g bezwodnego siarczanu sodu, zagęszczaj środek suszący, stukając w ściankę kolumny i utrwalając bawełnianym wacikiem.

Zlać górną warstwę octanu etylu za pomocą pipety, przefiltrować przez kolumnę suszącą, zbierając filtrat do 50 ml kolby w kształcie serca; dodatkowo ekstrahować wodny roztwór węglanu sodu najpierw 10 ml, a następnie 5 ml octanu etylu i po oddzieleniu kolejno przesączyć zdekantowane objętości octanu etylu przez kolumnę suszącą do tej samej kolby.

Odparować octan etylu pod próżnią w temperaturze nie przekraczającej 40°C do objętości około 0,5 ml (nie odparowywać do sucha!), Dodać 2,5 ml benzenu (przestrzegać stosunku objętości 1:5).

Czyszczenie próbki na kartridżu "DIAPAK S"

Zdjąć zatyczki z przygotowanego wkładu i przepuszczać roztwór próbki benzen-octan etylu z szybkością 1-2 kropli na sekundę. Kolbę przemyć kolejnym 0,5-1,0 ml benzenu-octanu etylu (85:15) i nałożyć na wkład, usuwając popłuczyny.

Wymyć patulinę z 6 ml wkładu benzenem:octanem etylu (7:3), zbierając eluat do kolby do usuwania rdzenia.

Odparować eluat do sucha w łaźni z suchym powietrzem w temperaturze nieprzekraczającej 40°C.

Od razu! Po odparowaniu ponownie rozpuścić próbkę w 0,2–0,25 ml eluentu A (sekcja 3.2.4.2), schłodzonego do 5–8°C.

3.2.4. Porządek pracy

Cel– oznaczenie zawartości mikotoksyn patuliny w składzie produktów spożywczych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na chromatografie mikrokolumnowym serii Milichrome-5.

3.2.4.1. Technika pomiaru

Pomiary obejmują następujące główne kroki:

- kalibracja chromatografu według roztworów o znanym stężeniu masowym patuliny;

- przygotowanie próbki żywności metodą ekstrakcji do fazy stałej zgodnie z ust. 3.2.3;

– analiza ekstraktu metodą HPLC z rejestracją sygnału detektorem UV;

– identyfikacja patuliny na podstawie parametrów retencji i współczynników spektralnych;

– obliczenie stężenia masowego patuliny w próbce na podstawie zarejestrowanego sygnału analitycznego (wysokość piku) oraz wykresu kalibracyjnego;

- obliczenie udziału masowego patuliny w składzie produktu spożywczego.

Instrumenty, odczynniki i materiały, potrzebne do wykonania pracy:

– chromatograf serii Milichrome-5 lub dowolny inny chromatograf HPLC z oprogramowaniem WinXrom lub Multichrome;

– Kolumna chromatograficzna HPLC: Diasfer–110–С10СN (5 µm, 2×80 mm, TU 4215–001–05451931–94);

– dozownik o zmiennej objętości na 1-100 µl;

– dozownik o zmiennej objętości na 100–1000 µl;

- kolba stożkowa o ściśle zmielonej cienkiej części o pojemności do 10 ml;

– filtry membranowe;

- zestaw roztworów wzorcowych patuliny o stężeniu 1, 2, 5 i 10 mg/l;

- kwas fosforowy 85%;

– acetonitryl do chromatografii cieczowej (specjalna specyfikacja czystości TU 6–09–3513–86, absorpcja UV do 200 nm);

– heksan chemicznie czysty (rektyfikowany);

– kwas trifluorooctowy;

– roztwór Carreza I – rozpuścić 15,0 g heksacyjanoferianu II potasu w 100 ml wody.

- roztwór Carreza II - rozpuścić 30,0 g octanu cynku w 100 ml wody;

- eluenty A, B i C.

Przygotowanie eluentów

Eluent A. 20 ml acetonitrylu i 0,5 ml 10% roztworu kwasu trifluorooctowego dodaje się do kolby miarowej o szczelnie szlifowanej części szklanej o pojemności 100 ml. Roztwór jest dokładnie mieszany i doprowadzany do kreski wodą destylowaną, uprzednio przefiltrowaną przez nylonowy filtr membranowy (0,2 µm). Następnie eluent jest odgazowywany przez próżnię przez 1 minutę przy rozrzedzeniu 1 kg∙s/cm2.

Eluenty B i C przygotowany w taki sam sposób jak eluent A, na 100 ml roztworu pobiera się odpowiednio tylko 10 i 0 ml acetonitrylu.

3.2.4.2. Ustawianie trybów separacji chromatograficznej
i rejestracja wyników

Do przeprowadzenia pomiarów konieczne jest ustawienie trybów pracy chromatografu.

Tryby dozownika:

– regeneracja – 300 µl;

– objętość próbki – 5 µl;

– zużycie eluentu – 150 µl/min;

– tryby elucji gradientowej: 800 µl – eluent A,
500 µl - eluent B, 300 µl - eluent C;

- temperatura termostatu - 35 0 С.

Tryby wykrywania:

– liczba długości fal – 3;

– długości fal – 250, 276, 290 nm;

– czas pomiaru – 0,04 s.

Kondycjonowanie układu chromatograficznego przeprowadza się na 30 minut przed pomiarami, wykonując analizę „ślepą”, w której standardową mieszaninę zawierającą patulinę zastępuje się 5–10 µl eluentu, a następnie rozdziela się standardową mieszaninę mikotoksyn.

Ćwiczenie 1. Zbadanie metody przygotowania próbek produktów spożywczych do oznaczenia zawartości patuliny. Przygotować próbki zgodnie z pkt 3.2.3.

Zadanie 2. Skalibruj chromatograf. Chromatograf kalibruje się przez kolejne wprowadzanie roztworów wzorcowych patuliny o stężeniach 1, 2, 5 i 10 mg/l.

Pod kierunkiem prowadzącego proponuje się wprowadzić parametry rozdziału chromatograficznego (pkt 3.2.4.3) z klawiatury PC do programu (WinXrom) i uruchomić 2-4 analizy chromatograficzne w trybie automatycznym. Wyniki prezentowane są w formie tabeli. 6.

T a b l e 6

Na podstawie otrzymanych profili chromatograficznych skonstruuj wykres kalibracyjny (wzdłuż osi rzędnych wykreśla się stężenie - mg/l, wzdłuż osi odciętej jest optyczna gęstość mikotoksyny ALE– s.o.p.).

Zadanie 3. Zidentyfikuj patulinę w badanej próbce produktu spożywczego i określ jej stężenie.

Pod kierunkiem nauczyciela rozpocznij pomiar próbki przygotowanego produktu spożywczego w trybie automatycznym
(z parametrami rozdziału chromatograficznego wybranymi w zadaniu 2). Po zakończeniu pomiaru zidentyfikuj mikotoksynę patuliny zgodnie ze standardowym plikiem („StandardDD–MM–YY.001”) uzyskanym w zadaniu 2. Korzystając z wykresu kalibracyjnego wbudowanego w zadaniu 2, określ stężenie patuliny w próbce żywności.

Zapisz wyniki w tabeli. 7.

Tabela 7

Stężenie masowe patuliny w próbce żywności oblicza się ze wzoru

gdzie Z– stężenie masowe patuliny w próbce, mg/l (obliczone zgodnie z zależnością kalibracyjną, na podstawie wysokości piku analitycznego); V p to objętość próbki, ml; R - stopień ekstrakcji mikotoksyn na etapie przygotowania próbki (równy 60%); M pr masa próbki produktu spożywczego użytej do oczyszczenia i późniejszego oznaczenia chromatograficznego, g.

Wynik pomiaru ułamka masowego mikotoksyn w oznaczanym przedmiocie przedstawiamy w postaci: X± mg/kg; w R\u003d 0,95 i zapisane w protokole (dodatek 1), gdzie X i , stężenie masowe patuliny w próbce, mg/kg; R- prawdopodobieństwo; to bezwzględna granica błędu, obliczona ze wzoru

Po otrzymaniu wyniku należy ocenić wartości standardów operacyjnej kontroli zbieżności, które są podane w odpowiednich GOST dla metod kontroli (analizy).

Wyciągnij wniosek o zgodności (lub niezgodności) zawartości patuliny w badanym produkcie spożywczym z dopuszczalnymi poziomami określonymi przez SanPiN 2.3.2.1078-01.

Pytania do samokontroli

1. Jakie zasady leżą u podstaw klasyfikacji chromatograficznych metod analizy?

2. Jaka jest istota rozdziału chromatograficznego? Jak przeprowadzana jest identyfikacja jakościowa i analiza ilościowa?

3. Jakie produkty spożywcze zawierają mykotoksyny? Jakie mikotoksyny są określane w składzie produktów spożywczych zgodnie z wymogami SanPiN?

4. Jaką metodą chromatograficzną określa się zawartość mykotoksyn w produktach spożywczych?

5. Na czym polega detekcja spektrofotometryczna? Co to są stosunki widmowe i do czego służą?

6. Jak przebiega przygotowanie próbki żywności w celu oznaczenia zawartości patuliny metodą HPLC?

7. Jakie operacje obejmuje metoda HPLC do oznaczania patuliny?

8. Co to jest elucja eluentowa i gradientowa? Jakie eluenty stosuje się do oznaczania patuliny metodą HPLC?

9. W jaki sposób identyfikuje się i określa ilościowo patulinę?

10. W jaki sposób zapewniona jest dokładność oznaczania patuliny metodą HPLC?

Metody oznaczania mikotoksyn

Nowoczesne metody wykrywania i oznaczania zawartości mykotoksyn w żywności i paszy obejmują metody przesiewowe, ilościowe metody analityczne i biologiczne.

Metody przesiewowe są szybkie i wygodne do analizy seryjnej, pozwalają szybko i niezawodnie oddzielić próbki zanieczyszczone i niezanieczyszczone. Metody przesiewowe obejmują chromatografię cienkowarstwową (metody TLC), fluorescencyjną metodę oznaczania ziarna zanieczyszczonego aflatoksynami.

Ilościowe metody analityczne do oznaczania mikotoksyn są reprezentowane przez metody chemiczne, radioimmunologiczne i immunoenzymatyczne. Obecnie najbardziej rozpowszechnione są metody chemiczne, które obejmują dwa etapy: etap izolacji oraz etap ilościowego oznaczania mikotoksyn. Etap izolacji obejmuje ekstrakcję (oddzielenie mikotoksyn od podłoża) oraz oczyszczanie (oddzielenie mikotoksyn od związków o podobnych właściwościach fizycznych i chemicznych). Ostateczną separację i oznaczenie ilościowe mikotoksyn prowadzi się różnymi metodami chromatograficznymi. Uniwersalną metodą oznaczania wszystkich rodzajów mikotoksyn jest chromatografia cienkowarstwowa (TLC).

Podczas pobierania próbek z partii produktu głównym celem jest uzyskanie próbki średniej lub próbki średniej, która jest reprezentatywna dla całej partii pod względem stężenia mikotoksyn (pobrane próbki powinny charakteryzować jakość całej partii). Realizacja tego zadania uzależniona jest od charakteru i rozmieszczenia mikotoksyn, właściwości produktu (surowy, przetworzony, sypki, płynny, pastowaty itp.), sposobu przygotowania próbki. Na przykład zanieczyszczenie orzeszków ziemnych aflatoksynami ma wyraźny niejednorodny charakter: w poszczególnych ziarnach orzeszków ziemnych ich zawartość może wahać się od tysięcznych miligrama do dziesiątek lub więcej miligramów na 1 kg, tj. różnić się o 5-6 rzędów wielkości. Z tego powodu udział błędu pobierania próbek w całkowitym błędzie analizy w oznaczaniu aflatoksyn w orzeszkach ziemnych jest głównym i w niektórych przypadkach może przekraczać 90%.

Z punktu widzenia jednorodności zanieczyszczenia mikotoksynami wszystkie produkty można podzielić na dwie grupy: 1) produkty o wysokim stopniu niejednorodności (orzechy ziemne łuskane i niełuskane, nasiona oleiste, całe lub gruboziarniste, orzechy); 2) produkty o jednolitym charakterze zanieczyszczenia (płyny: mleko, oleje roślinne, soki, przeciery; mąka, mąki mielone).

Aby uzyskać reprezentatywną próbkę średnią produktów I-tej grupy, wielkość próbki wyjściowej powinna być jak największa (minimum 2 kg), natomiast średnia próbka laboratoryjna powinna być wyizolowana z próbki średniej zmielonej (zhomogenizowanej) .

W przypadku produktów jednorodnych II grupy (dżemy, marmolady, soki owocowe w małych pojemnikach blaszanych, mleko skondensowane, suche produkty mleczne itp.) próbki należy pobierać w ilości jednostek opakowaniowych odpowiadającej wielkości próbki średniej (100 -200 g), pod warunkiem, że produkt pochodzi z tej samej partii.

Chemiczne metody wykrywania i identyfikacji poszczególnych aflatoksyn opierają się na ich specyficznej fluorescencji w świetle UV (około 365 nm), na różnicach ruchliwości w chromatografii cienkowarstwowej, na specyficzności ich widm absorpcyjnych i fluorescencji.

W przeciwieństwie do aflatoksyn trichoteceny nie wykazują absorpcji ani fluorescencji w widzialnej części widma, co utrudnia ich wykrycie metodą chromatografii cienkowarstwowej. Jednocześnie trichoteceny można wykrywać metodą TLC metodami opartymi na traktowaniu płytek TLC specjalnymi odczynnikami, które z trichotecenami tworzą kolorowe lub fluorescencyjne pochodne. Na przykład toksyna T-2 podczas przetwarzania płytek; stężony kwas siarkowy tworzy plamy z niebieską fluorescencją ;) w świetle UV.

Arbitrażowe metody ilościowego oznaczania mikotoksyn są następujące:

‣‣‣ chromatografia gazowo-cieczowa (dla toksyny T-2);

‣‣‣ wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) z zastosowaniem detektora fotometrycznego UV (dla deoksyniwalenolu i patuliny);

‣‣‣ HPLC z detektorem fluorescencyjnym (dla aflatoksyn i zearalenonu).

Na ryc. 2 przedstawia urządzenie nowoczesnego chromatografu cieczowego w najprostszej konstrukcji.

Faza ruchoma ze zbiornika 1 przez filtr wlotowy 9 jest dostarczana przez pompę wysokociśnieniową 2 do układu wejściowego próbki 3 - ręcznego wtryskiwacza lub automatycznego podajnika próbek, gdzie również wprowadzana jest próbka. Następnie przez filtr 8 próbka z prądem fazy ruchomej wchodzi przez przedkolumnę do kolumny separacyjnej 4. Następnie przepływ fazy ruchomej opuszcza kolumnę i zawiera składniki mieszaniny do rozdzielenia (eluatu) wchodzi do detektora 5 i jest usuwany do zbiornika przelewowego 7. Gdy eluat przepływa przez pętlę pomiarową detektora, chromatogram jest rejestrowany i dane są przesyłane do rejestratora 6 lub do komputera.

Urządzenie do chromatografii cieczowej (układ izokratyczny):

1 - pojemność; 2 - system wysokiego ciśnienia; 3 - ręczny wtryskiwacz lub autosampler; 4 - kolumna rozdzielająca; 5 - detektor; b - rejestrator lub komputer; 7 - zbiornik spustowy; 8 - filtr; 9 - filtr wejściowy

Układ przedstawiony na ryc. 2 jest izokratyczny: skład fazy ruchomej nie zmienia się podczas chromatografii. Jeżeli podczas analizy chromatograficznej niezwykle istotna jest zmiana stężenia jednego lub więcej składników fazy ruchomej, wówczas stosuje się tzw. układy gradientowe, składające się zwykle z dwóch lub więcej pomp. W przypadku elucji gradientowej każdy rozpuszczalnik podawany jest z oddzielnego naczynia do specjalnej komory mieszania z mieszadłem magnetycznym, gdzie zgodnie z określonym programem są one mieszane w określonym stosunku objętościowym.

Do analizy mikotoksyn coraz częściej stosuje się układy gradientowe, w których jako fazę ruchomą stosuje się roztwory acetonitrylu w wodzie o stężeniu zmieniającym się liniowo w czasie.

Kolumna chromatograficzna to metalowa rura o średnicy od 150 do 250 mm i wewnętrznej średnicy 4,6 mm, wypełniona specjalnym sorbentem na bazie żelu krzemionkowego z zaszczepionymi rodnikami węglowodorowymi. Kolumna ochronna służy do ochrony kolumny chromatograficznej przed zanieczyszczeniem.

Detektor fotometryczny UV jest najpowszechniejszym typem detektora HPLC. Zasada działania detektora jest podobna do konwencjonalnego spektrofotometru: rejestruje gęstość optyczną roztworu. Różnica polega na tym, że detektor UV jest detektorem przepływowym, zamiast kuwety z roztworem wykorzystuje komórkę fotometryczną. Strumień eluentu przepływa przez komórkę roboczą, a czysta faza ruchoma przepływa przez komórkę referencyjną. Źródłem światła jest lampa rtęciowa, która wytwarza intensywne promieniowanie UV. Światło o pożądanej długości fali jest wybierane za pomocą odpowiednich filtrów optycznych, przechodzi przez komórki, jest częściowo pochłaniane przez cząsteczki fazy ruchomej i oddzielane składniki oraz jest wychwytywane przez fotodetektor. Absorpcja światła (gęstość optyczna) eluatu jest w sposób ciągły rejestrowana przez rejestrator wykresów lub komputer, rejestrując chromatogram. Oddzielone składniki mieszaniny (na przykład mikotoksyny) są przedstawione na chromatogramie jako piki. Pozycja piku na chromatogramie służy do identyfikacji substancji, a powierzchnia piku do oznaczania ilościowego.

Bardziej złożonym urządzeniem jest detektor fluorescencyjny (fluorymetryczny).
Hostowane na ref.rf
Taki detektor wykorzystuje zdolność związków organicznych, w szczególności aflatoksyn i zearalenonu, do fluoryzowania pod wpływem promieniowania UV lub widzialnego. Detektor fluorescencyjny posiada kuwetę przepływową z dwoma wzajemnie prostopadłymi kanałami optycznymi. Jeden z nich służy do dostarczania wzbudzającego promieniowania, drugi umożliwia pomiar natężenia fluorescencji. W przypadku analizy aflatoksyn B 1 i M 1 długość fali wzbudzenia wynosi 360 nm, a emitowana długość fali 420 nm.

Należy zauważyć, że detektor UV może być również używany do analizy aflatoksyn, jednak jego czułość jest o rząd wielkości niższa niż detektora fluorymetrycznego, dlatego detekcja fluorescencyjna jest preferowana przy analizie niskich stężeń aflatoksyn (na poziom RPP i poniżej).

Metody oznaczania mikotoksyn – pojęcie i rodzaje. Klasyfikacja i cechy kategorii „Metody oznaczania mikotoksyn” 2017, 2018.

GOST 32835-2014

MIĘDZYNARODOWY STANDARD

PRODUKTY Z SOKÓW

Oznaczanie mikotoksyn metodą tandemowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (HPLC-MS/MS)

Produkty sokowe. Oznaczanie mikotoksyn metodą tandemowej wysokosprawnej spektrometrii masowej cieczy (HPLC-MS/MS)

MKS 67.080.01

Data wprowadzenia 2016-01-01

Przedmowa

Cele, podstawowe zasady i podstawowa procedura prowadzenia prac nad normalizacją międzystanową są określone przez GOST 1.0-92 „Międzystanowy system normalizacji. Podstawowe postanowienia” i GOST 1.2-2009 „Międzystanowy system normalizacji. Normy międzystanowe, zasady i zalecenia dotyczące normalizacji międzystanowej. Zasady opracowywania, przyjmowania, składania wniosków, odnawiania i anulowania

O standardzie

1 OPRACOWANE przez Federalną Państwową Instytucję Edukacyjną Wyższego Szkolnictwa Zawodowego „Moskiewski Państwowy Uniwersytet Produkcji Żywności” (FGBOU VPO „MGUPP”)

2 WPROWADZONE przez Federalną Agencję Regulacji Technicznych i Metrologii

3 PRZYJĘTE przez Międzystanową Radę ds. Normalizacji, Metrologii i Certyfikacji (Protokół z dnia 25 czerwca 2014 r. N 45-2014)

Głosowano za akceptacją:

Skrócona nazwa kraju wg MK (ISO 3166) 004-97		Skrócona nazwa krajowej jednostki normalizacyjnej
Armenia		Ministerstwo Gospodarki Republiki Armenii
Białoruś		Państwowa Norma Republiki Białoruś
Kirgistan		Kirgiskistandart
Rosja		Rosstandart

4 Zarządzeniem Federalnej Agencji ds. Regulacji Technicznych i Metrologii z dnia 19 sierpnia 2014 r. N 896-st GOST 32835-2014 został wprowadzony w życie jako norma krajowa Federacji Rosyjskiej od 1 stycznia 2016 r.

5 Niniejsza norma została opracowana z uwzględnieniem postanowień następujących dokumentów międzynarodowych:

- CODEX STAN 247-2005* Codex General Standard For Fruit Juices And Nectars of the Codex Alimentarius Commission;
________________
* Dostęp do międzynarodowych i zagranicznych dokumentów wymienionych poniżej w tekście można uzyskać, klikając link do strony http://shop.cntd.ru. - Notatka producenta bazy danych.


- Rozporządzenie Komisji Unii Europejskiej z dnia 23.02.2006 r. nie. 406/2006/WE Ustanawiające metody pobierania próbek i metody analizy do celów urzędowej kontroli poziomów mikotoksyn w środkach spożywczych do celów urzędowej kontroli poziomów mikotoksyn w środkach spożywczych");

- Kodeks postępowania AIJN dotyczący oceny jakości i autentyczności soków owocowych i warzywnych Europejskiego Stowarzyszenia Soków Owocowych.

6 WPROWADZONE PO RAZ PIERWSZY


Informacje o zmianach w tym standardzie są publikowane w rocznym indeksie informacyjnym „Normy krajowe”, a tekst zmian i poprawek - w miesięcznym indeksie informacyjnym „Normy krajowe”. W przypadku zmiany (zastąpienia) lub anulowania tego standardu, odpowiednia informacja zostanie opublikowana w miesięcznym indeksie informacyjnym „Normy krajowe”. Odpowiednie informacje, powiadomienia i teksty są również publikowane w systemie informacji publicznej - na oficjalnej stronie internetowej Federalnej Agencji ds. Regulacji Technicznych i Metrologii w Internecie

1 obszar zastosowania

1 obszar zastosowania

Niniejsza norma ma zastosowanie do soków i innych soków z owoców i warzyw, z wyjątkiem komórek owoców cytrusowych, i ustanawia metodę oznaczania mikotoksyn – patuliny i ochratoksyny A – przy użyciu tandemowej wysokosprawnej spektrometrii cieczowej z chromatomasią w zakresie pomiarowym stężenie masowe patuliny od 0,1 do 100,0 µg/dm i ochratoksyny A od 0,1 do 20,0 µg/dm.

UWAGA Zaleca się stosowanie niniejszej Normy Międzynarodowej w celu zatwierdzenia i gromadzenia dodatkowych informacji dotyczących jej stosowania.

2 odniesienia normatywne

W niniejszej normie zastosowano odniesienia normatywne do następujących norm międzystanowych:

GOST 12.1.004-91 System standardów bezpieczeństwa pracy. Bezpieczeństwo przeciwpożarowe. Ogólne wymagania

GOST 12.1.007-76 System standardów bezpieczeństwa pracy. Klasyfikacja i ogólne wymagania bezpieczeństwa

GOST 12.1.010-76 System standardów bezpieczeństwa pracy. Bezpieczeństwo przeciwwybuchowe. Ogólne wymagania

GOST 12.1.019-79 System standardów bezpieczeństwa pracy. Bezpieczeństwo elektryczne. Ogólne wymagania i nomenklatura rodzajów ochrony

Odczynniki GOST 61-75. Kwas octowy. Specyfikacje

GOST OIML R 76-1-2011 Państwowy system zapewnienia jednolitości pomiarów. Wagi nieautomatyczne. Część 1. Wymagania metrologiczne i techniczne. Testy

GOST 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) Pomiarowe szkło laboratoryjne. Cylindry, zlewki, kolby, probówki. Ogólne specyfikacje

GOST ISO 3696-2013 Woda do analizy laboratoryjnej. Wymagania techniczne i metody kontroli

GOST ISO 5725-1-2003 Dokładność (poprawność i precyzja) metod i wyników pomiarów. Część 1. Podstawowe postanowienia i definicje

GOST ISO 5725-2-2003 Dokładność (poprawność i precyzja) metod i wyników pomiarów. Część 2: Podstawowa metoda określania powtarzalności i odtwarzalności standardowej metody pomiarowej

Odczynniki GOST 5789-78. Toluen. Specyfikacje

GOST 16317-87 Elektryczne urządzenia chłodnicze do użytku domowego. Ogólne specyfikacje

GOST 20015-88 Chloroform. Specyfikacje

GOST 25336-82 Wyroby szklane i sprzęt laboratoryjny. Rodzaje. Główne parametry i wymiary

GOST 26313-84 Przetworzone produkty z owoców i warzyw. Zasady odbioru, metody pobierania próbek

GOST 26671-85 Przetworzone owoce i warzywa, konserwy mięsne i mięsno-warzywne. Przygotowanie próbki do analizy laboratoryjnej

GOST 29030-91 Przetworzone produkty z owoców i warzyw. Metoda piknometryczna wyznaczania gęstości względnej i zawartości rozpuszczalnych ciał stałych

GOST 29227-91 (ISO 835/1-81) Szkło laboratoryjne. Pipety wyskalowane. Część 1. Wymagania ogólne

GOST ISO/IEC 17025-2009 Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących

GOST 32689.1-2014 Produkty spożywcze pochodzenia roślinnego. Multimetody oznaczania pozostałości pestycydów metodą chromatografii gazowej. Część 1. Postanowienia ogólne

GOST 32689.2-2014 Produkty spożywcze pochodzenia roślinnego. Multimetody oznaczania pozostałości pestycydów metodą chromatografii gazowej. Część 2: Metody ekstrakcji i oczyszczania

GOST 32689.3-2014 Produkty spożywcze pochodzenia roślinnego. Multimetody oznaczania pozostałości pestycydów metodą chromatografii gazowej. Część 3. Określanie i walidacja wyników

Uwaga - Podczas korzystania z tej normy zaleca się sprawdzenie ważności norm odniesienia w publicznym systemie informacyjnym - na oficjalnej stronie internetowej Federalnej Agencji ds. Regulacji Technicznych i Metrologii w Internecie lub zgodnie z rocznym indeksem informacyjnym „Normy krajowe” , który został opublikowany z dniem 1 stycznia br., oraz o emisjach miesięcznego indeksu informacyjnego „Normy Krajowe” za rok bieżący. Jeśli norma odniesienia zostanie zastąpiona (zmodyfikowana), to podczas korzystania z tego standardu należy kierować się normą zastępującą (zmodyfikowaną). Jeżeli przywołana norma zostanie anulowana bez zastąpienia, postanowienie, w którym podano odniesienie do niej, ma zastosowanie w zakresie, w jakim nie ma to wpływu na to odniesienie.

3 skróty

HPLC-MS/MS - tandemowa wysokosprawna chromatografia cieczowa-spektrometria mas;

OTA, ochratoksyna A;

PAT - patulina;

ESI- jonizacja napylania w polu elektrycznym ( Jonizacja przez elektrorozpylanie);

IARC- Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem;

LOD- Granica wykrywalności;

LOQ- granica oznaczalności ilościowej;

SRM- identyfikacja składników w trybie kontroli reakcji selektywnych ( Monitorowanie wybranych reakcji).

4 Istota metody

Istota metody polega na wstępnej ekstrakcji mykotoksyn PAT i OTA acetonitrylem w obecności bezwodnego siarczanu magnezu, zatężeniu, ponownym rozpuszczeniu w acetonitrylu oraz ilościowym oznaczeniu stężenia masowego mykotoksyn metodą HPLC-MS/MS z jonizacją natryskową w polu elektrycznym i identyfikacji składników w trybie sterowania reakcjami selektywnymi.

5 Przyrządy pomiarowe, sprzęt pomocniczy, materiały odniesienia, odczynniki i wyroby szklane

System analityczny HPLC-MS/MS* z trójkwadrupolowym detektorem mas do pomiarów w zakresie mas od 10 do 3000 jednostek masy atomowej (j.m.), z dokładnością pomiaru masy co najmniej 0,1 a.m., rozpylaniem jonizacyjnym w polu elektrycznym, możliwość pracy w trybie kontroli wybranych reakcji oraz skanowania jonów potomnych i rodzicielskich, minimalny stosunek sygnału do szumu 1000:1. W skład systemu analitycznego powinien wchodzić moduł HPLC składający się z pompy binarnej z mieszadłem, termostatu kolumny chromatograficznej zapewniającego temperaturę grzania do 50°C oraz kolumny chromatograficznej z sorbentem z odwróconą fazą o uziarnieniu 5 μm C , 150 mm długości i 3 mm średnicy wewnętrznej. Zastosowany system powinien zapewnić detekcję mikotoksyn w zakresie od 0,1 do 100,0 µg/dm.
________________
* Więcej informacji na temat zalecanych systemów LC/MS/MS znajduje się w Załączniku A.


Spektrofotometr o zakresie pomiarowym pozwalającym na pomiary przy długości fali od 250 do 400 nm, z błędem bezwzględnym w pomiarach gęstości optycznej nie większym niż 0,1%.

Wagi zgodne z GOST OIML R 76-1, zapewniające dokładność ważenia z dopuszczalnym błędem bezwzględnym pojedynczego ważenia nie większym niż ±0,01 mg.

Wanna ultradźwiękowa.

Wirówka o prędkości obrotowej wirnika 4000-5000 obr/min do probówek o pojemności 50 ml.

Wirówka o prędkości obrotowej wirnika 10000-12000 obr/min do probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5-2,0 ml.

Szafa suszarnicza zapewniająca utrzymanie temperatury do 200°С.

Lodówka domowa według GOST 16317.

Shaker do mieszania.

Urządzenia do dozowania próbek cieczy o stałej lub zmiennej pojemności 20-1000 mm z błędem względnym dozowania objętości rzeczywistej nie większej niż 2,5%.

Mikrofiltr - dysza na strzykawkę (regenerowana celuloza, średnica 13 mm, wielkość porów 0,2-0,4 mikrona).

Kuwety kwarcowe o długości roboczej 1 cm.

Mikotoksyny PAT i OTA do stosowania jako próbki referencyjne o zawartości substancji głównej co najmniej 98%.

Kwas octowy lodowaty zgodnie z GOST 61, klasa analityczna.

Acetonitryl do gradientowej HPLC.

Metanol do gradientowej HPLC.

Siarczan magnezu bezwodny, chemicznie czysty

Chlorek wapnia bezwodny, granulowany, chemicznie czysty

Chloroform według GOST 20015, chemicznie czysty

Toluen według GOST 5789, chemicznie czysty

Alkohol etylowy, absolutny.

Woda do analizy laboratoryjnej, czystość 1 zgodnie z GOST ISO 3696.

Pipety wielomiarowe II klasy dokładności o pojemności 1, 2, 5, 10 cm2 II klasy dokładności wg GOST 29227.

Kolby miarowe II klasy dokładności o pojemności 5, 10, 25, 50, 100 i 1000 cm2 lub 2a wg GOST 1770.

Kolby o ostrym dnie o pojemności 10,25 cm3.

Probówka wirówkowa typu Eppendorf o pojemności 1,5-2,0 ml.

Probówka mikrotestowa o pojemności 100-400 mm.

Cylindry pomiarowe II klasy dokładności o pojemności 25, 50, 250 cm3 dowolnej konstrukcji zgodnie z GOST 1770.

Probówka wirówkowa z zakrętką, 50 cm

Kubek porcelanowy o średnicy 125-150 mm.

Eksykator laboratoryjny o pojemności 3 dm.

Laboratorium lejków zgodnie z GOST 25336.

Kolby płaskodenne o pojemności 50, 100, 250 cm3 wg GOST 25336.

Szkła chemiczne o pojemności 10, 20, 50, 100 i 200 cm3 zgodnie z GOST 25336.

Dopuszcza się stosowanie innych przyrządów pomiarowych, wyposażenia pomocniczego, przyborów nie ustępujących powyższym pod względem właściwości metrologicznych i technicznych oraz zapewniających niezbędną dokładność pomiaru, a także próbek wzorcowych, odczynników i materiałów o jakości nie gorszej niż ww. .

6 Pobieranie próbek

Pobieranie próbek - zgodnie z GOST 26313. Przygotowanie i przechowywanie próbek - zgodnie z GOST 26671, GOST 32689.1, GOST 32689.2 i GOST 32689.3.

7 Przygotowanie do testów

7.1 Wymagania ogólne

Przed badaniem przeprowadza się wstępne przygotowanie szkła laboratoryjnego, a także kontrolę jakości odczynników i materiałów pomocniczych zgodnie z wymaganiami GOST 32689.1, GOST 32689.2 i GOST 32689.3.

7.2 Przygotowanie roztworów pomocniczych

7.2.1 Przygotowanie fazy ruchomej A

W kolbie miarowej o pojemności 1000 ml ze szczelnie zamkniętym korkiem ze szlifowanego lub fluoroplastycznego szkła odpipetować 1 ml lodowatego kwasu octowego, 100 ml metanolu i doprowadzić do kreski wodą podwójnie destylowaną. Mieszanina jest dokładnie wymieszana.

Okres ważności fazy ruchomej A w temperaturze pokojowej - nie więcej niż jeden miesiąc.

7.2.2 Przygotowanie fazy ruchomej B

W kolbie miarowej o pojemności 1000 ml ze szczelnie zamkniętym korkiem ze szlifowanego lub fluoroplastycznego szkła umieszcza się 1 ml lodowatego kwasu octowego za pomocą pipety i doprowadza do kreski metanolem. Mieszanina jest dokładnie wymieszana.

Okres ważności fazy mobilnej B w temperaturze pokojowej - nie więcej niż jeden miesiąc.

UWAGA Faza ruchoma nie może stykać się z gumą i materiałami polimerowymi [z wyjątkiem politetrafluoroetylenu (PTFE)].

7.2.3 Przygotowanie rozpuszczalnika 1

W odpowiednim pojemniku wymieszać 99 części objętościowych toluenu i jedną część objętościową lodowatego kwasu octowego. Mieszanina jest dokładnie wymieszana.

Okres przechowywania rozpuszczalnika 1 w temperaturze pokojowej nie przekracza 6 miesięcy.

7.3 Przygotowanie siarczanu magnezu

Bezwodny siarczan magnezu użyty w ekstrakcji jako sorbent musi zostać wysuszony nawet przed upływem daty ważności, aby usunąć wchłoniętą wilgoć z powietrza. Sorbent jest kalcynowany w temperaturze 180°C - 200°C przez 6-10 godzin i przechowywany w eksykatorze nad bezwodnym chlorkiem wapnia. Kryterium przydatności odczynnika jest brak dodatkowej warstwy wodnej po podgrzaniu roztworu, etap ekstrakcji prowadzi się do temperatury 30°C - 40°C, a po 2-3 minutach masa reakcyjna jest wstrząśnięty.

7.4 Przygotowanie roztworów podstawowych mikotoksyn

7.4.1 Przygotowanie roztworów PAT

7.4.1.1 Przygotowanie roztworu podstawowego PAT, stężenie masowe 200 µg/cm

Pobrać 2,0 mg czystego krystalicznego PAT, odważonego z dokładnością do 0,01 mg, rozpuścić w kolbie miarowej o pojemności 10 ml w niewielkiej ilości chloroformu, a następnie dopełnić chloroformem objętość roztworu do kreski.

Okres przechowywania początkowego roztworu PAT w temperaturze 0°C w szklanej kolbie miarowej ze szlifowanym korkiem szczelnie owiniętym folią aluminiową nie przekracza 1 miesiąca.

7.4.1.2 Przygotowanie roztworu PAT, stężenie masowe 20 µg/cm

Przenieść 1 ml otrzymanego roztworu podstawowego PAT (zob. 7.4.1.1) do 10 ml kolby miarowej i rozcieńczyć chloroformem do oznaczenia. W celu określenia dokładnego stężenia masowego PAT w roztworze pobiera się 5,0 ml otrzymanego roztworu wzorcowego PAT i przenosi do pojemnika o pojemności około 15 cm3, a następnie usuwa chloroform przez przedmuchiwanie azotem aż do uzyskania suchej substancji. Natychmiast po otrzymaniu suchej masy do pojemnika dodaje się 5,0 ml absolutnego etanolu. Całkowicie rozpuścić PAT. Otrzymany roztwór PAT wprowadza się do kuwety kwarcowej o długości drogi optycznej 1 cm, następnie rejestruje się widmo roztworu na spektrofotometrze w zakresie długości fali od 250 do 350 nm, stosując jako kontrolę etanol absolutny w kuwecie odniesienia .

Stężenie masowe PAT w roztworze, µg/cm, oblicza się ze wzoru

gdzie jest maksymalna wartość gęstości optycznej widma (długość fali około 275 nm), jednostki. PO;

- masa cząsteczkowa PAT równa 153,1 g/mol;

- współczynnik konwersji;


- molowy współczynnik absorpcji optycznej (ekstynkcji), równy 14600, m/mol.

7.4.1.3 Przygotowanie roztworu PAT 100 µg/cm

5 ml początkowego roztworu PAT w chloroformie o stężeniu masowym 200 µg/ml (patrz 7.4.1.1) przenosi się do kolby miarowej o pojemności 10 ml, zatęża do suchej pozostałości w temperaturze pokojowej pod strumieniem azotu i natychmiast ponownie rozpuszczono w acetonitrylu, doprowadzając go do objętości w kolbie do etykiet.

7.4.1.4 Okres przechowywania roztworów PAT zgodnie z 7.4.1.2 i 7.4.1.3 w temperaturze 0°C w szklanej kolbie miarowej ze szlifowanym korkiem szczelnie owiniętym folią aluminiową nie przekracza 24 godzin.

Przed użyciem temperaturę roztworów doprowadza się do temperatury pokojowej (nie wolno wyjmować folii aluminiowej z kolby miarowej, dopóki zawartość nie osiągnie temperatury pokojowej). Ze względu na zniszczenie PAT nie wolno przechowywać próbek referencyjnych w postaci cienkiej warstwy suchej masy uzyskanej po usunięciu rozpuszczalnika.

7.4.2 Przygotowanie roztworu podstawowego OTA

7.4.2.1 Przygotowanie roztworu podstawowego 20 µg/ml OTA

Rozpuścić 2,0 mg czystej krystalicznej OTA, odważonej z dokładnością do 0,01 mg, w 25-mililitrowej zlewce z rozpuszczalnikiem 1 (patrz 7.2.3) i przenieść ilościowo do 100-mililitrowej kolby miarowej i rozcieńczyć rozpuszczalnikiem 1 do kreski.

W celu określenia dokładnego stężenia masowego OTA w roztworze otrzymany wyjściowy roztwór OTA wprowadza się do kuwety kwarcowej o długości drogi optycznej 1 cm, następnie rejestruje się widmo roztworu na spektrofotometrze w zakresie długości fal od 300 do 370 nm, przy użyciu rozpuszczalnika 1 jako kuwety odniesienia.

Stężenie masowe OTA w roztworze wyjściowym, μg/cm, oblicza się ze wzoru

gdzie jest maksymalna wartość gęstości optycznej widma (długość fali około 333 nm), jednostki. PO;

- masa cząsteczkowa OTA równa 402,7 g/mol;

- współczynnik konwersji;

- współczynnik korygujący określony zgodnie z Załącznikiem A;

- molowy współczynnik absorpcji optycznej (ekstynkcji), równy 544, m/mol.

Okres przechowywania oryginalnego roztworu OTA w temperaturze minus 18°C ​​w szklanej kolbie miarowej ze szlifowanym korkiem szczelnie owiniętym folią aluminiową nie przekracza czterech lat.

7.4.2.2 Przygotowanie roztworu 5 µg/ml OTA

Pobrać 2,5 ml roztworu podstawowego OTA (7.4.2.1), przenieść do 10 ml kolby miarowej i rozcieńczyć rozpuszczalnikiem 1 (ppkt 7.2.3) do oznaczenia.

Okres przechowywania roztworu OTA w temperaturze 4°C w szklanej kolbie miarowej ze szlifowanym korkiem szczelnie owiniętym folią aluminiową nie przekracza 24 godzin.

Przed użyciem temperaturę roztworu doprowadza się do temperatury pokojowej (nie wolno wyjmować folii aluminiowej z kolby miarowej, dopóki zawartość nie osiągnie temperatury pokojowej).

7.5 Przygotowanie roztworów kalibracyjnych PAT i OTA

Roztwory kalibracyjne PAT i OTA są przygotowywane przez zmieszanie określonych objętości ich roztworów podstawowych (patrz 7.4.1.1 i 7.4.2.1) z klarowanym sokiem jabłkowym, który nie zawiera oznaczanych analitów.

7.5.1 Przygotowanie roztworów kalibracyjnych PAT

7.5.1.1 Przygotowanie roztworu pośredniego o stężeniu masowym PAT 1000 ng/cm (roztwór n-1)

Do kolby miarowej o pojemności 100 ml i pojemności roztwór doprowadza się do kreski za pomocą acetonitrylu.

7.5.1.2 Przygotowanie roztworu pośredniego o stężeniu masowym PAT 10 ng/cm (roztwór n-2)

Przenieść 1 ml roztworu -1 (patrz 7.5.1.1) do 100 ml kolby miarowej i rozcieńczyć acetonitrylem do kreski.

7.5.1.3 Przygotowanie roztworów kalibracyjnych PAT

Wybrane zgodnie z tabelą 1 pewne objętości roztworów pośrednich n-1 i n-2 (patrz 7.5.1.1 i 7.5.1.2) i rozlać do 10 ml kolb miarowych.


Tabela 1 - Objętości roztworów n-1 i n-2 do przygotowania roztworów kalibracyjnych PAT

Nazwa wskaźnika	Roztwory kalibracyjne
Objętość roztworu n-2 cm
Objętość roztworu n-1 cm
Ilość wstrzykniętego PAT, ng
Stężenie masowe PAT w roztworze, ng/cm

7.5.2 Przygotowanie roztworów kalibracyjnych OTA

7.5.2.1 Przygotowanie roztworu pośredniego OTA 200 ng/ml (roztwór A-1)

Zatęż 1 ml roztworu 5 µg/ml OTA (patrz 7.4.2.2) do sucha w strumieniu azotu w temperaturze pokojowej i natychmiast przenieś za pomocą acetonitrylu do 25 ml kolby miarowej.

7.5.2.2 Przygotowanie roztworu pośredniego OTA 10 ng/ml (roztwór ALE-2)

0,5 ml roztworu pośredniego OTA ALE-1 (patrz 7.5.2.1) przenosi się do 10 ml kolby miarowej i rozcieńcza do kreski acetonitrylem.

7.5.2.3 Przygotowanie roztworów kalibracyjnych OTA

Wybrane zgodnie z tabelą 2 określone objętości roztworów pośrednich ALE-1 i ALE-2 (patrz 7.5.2.1 i 7.5.2.2) i rozlać do 10 ml kolb miarowych.


Tabela 2 - Objętości roztworów ALE-1 i ALE-2 do przygotowania roztworów kalibracyjnych OTA

Nazwa wskaźnika	Roztwory kalibracyjne
Objętość roztworu ALE-2 cm
Objętość roztworu ALE-1 cm
Ilość podanej OTA, ng
Stężenie masowe OTA w roztworze, ng/cm

Doprowadzić objętość roztworu w kolbach do kreski klarowanym sokiem jabłkowym (lub innym przefiltrowanym) sokiem.

Do badania w HPLC-MS/MS do układu wstrzykuje się 10 µm roztworów kalibracyjnych PAT i OTA przygotowanych według 7.5.1.3 i 7.5.2.3 i kalibrowanych według 7.7, z uwzględnieniem warunków 8.3.1.

Okres przechowywania roztworu kalibracyjnego w temperaturze 0°C - 4°C w szklanej kolbie miarowej ze szlifowanym korkiem nie przekracza 24 godzin.

7.6 Przygotowanie systemu LC/MS/MS

Przygotowanie systemu HPLC-MS/MS do pomiarów odbywa się zgodnie z instrukcją obsługi (instrukcją) oraz informacjami podanymi w Załączniku B.

Przy ustalaniu trybów pracy spektrometru mas zaleca się stosowanie parametrów MS/MS do oznaczania mikotoksyn podanych w dodatku B.

W takim przypadku muszą być spełnione następujące warunki:

- temperatura powietrza otoczenia od 20°С do 25°С;

- ciśnienie atmosferyczne od 84 do 106 kPa;

- napięcie w sieci (220±10) V;

- częstotliwość prądu w sieci od 49 do 51 Hz;

- wilgotność względna powietrza od 40% do 80%.

7.7 Kalibracja systemu HPLC-MS/MS

Kalibrację systemu roztworami mykotoksyn w sokach wg 7.5 przeprowadza się zgodnie z instrukcją obsługi (instrukcją) systemu HPLC-MS/MS iz uwzględnieniem warunków wg 8.3.1 raz w miesiącu. Powierzchnie pików PAT i OTA określa się na chromatogramach, a zależność kalibracyjną ustala się od powierzchni piku w zakresie stężeń zgodnie z 7.5. Oblicz współczynnik korelacji i odchylenie obliczonych wartości stężenia masowego mikotoksyn w każdym punkcie kalibracji od wartości rzeczywistej zgodnie z procedurą przygotowania roztworów kalibracyjnych (patrz 7.5). Kalibrację uważa się za dopuszczalną, jeżeli współczynnik korelacji wynosi co najmniej 0,999 (dla PAT) i 0,965 (dla OTA), a odchylenie względne obliczonej wartości stężenia masowego od wartości rzeczywistej nie przekracza ±10%.

Zamiast odchylenia względnego dopuszczalność charakterystyki kalibracji można ocenić za pomocą względnego odchylenia standardowego, które nie powinno przekraczać 5%.

8 Testowanie

8.1 Ekstrakcja

10 ml () wstępnie dokładnie wymieszanych soków umieszcza się w probówce wirówkowej z nakrętką o pojemności 50 ml, do probówki dodaje się 20 ml acetonitrylu i 15 g bezwodnego siarczanu magnezu. Mieszanina jest intensywnie mieszana przez trzy do pięciu minut ręcznie lub za pomocą wytrząsarki. Po wymieszaniu uzyskany ekstrakt odwirowuje się przez 10 minut przy 4000-5000 obr./min w temperaturze pokojowej lub 5 minut w obecności wirówki z chłodzeniem w temperaturze 5°C. Zmierz całkowitą objętość ekstraktu po odwirowaniu (). 18-19 cm () ekstraktu, pobranego za pomocą pipety lub urządzenia dozującego, przenosi się do kolby o ostrym dnie o pojemności 25 cm i 1 cm () acetonitrylu.

Jeśli na ściankach naczynia znajduje się nierozpuszczalny film karmelowy, jest on niszczony w łaźni ultradźwiękowej przez trzy do pięciu minut. Roztwór przenosi się do probówki typu Eppendorfa o pojemności 1,5-2,0 cm3 i wiruje przy 10 000-12 000 obr./min przez 3-5 minut. Górna warstwa jest pobierana i filtrowana przez mikrofiltr o wielkości porów 0,2-0,4 µm bezpośrednio do mikroprobówki o pojemności 100-400 mm. W przypadku testu HPLC-MS/MS, 10 mm przygotowanej próbki jest wstrzykiwane do systemu.

8.2 Przygotowanie próbki z produktów skoncentrowanych

Soki zagęszczone (przecier) są odtwarzane wodą do minimalnego poziomu rozpuszczalnych substancji stałych określonego w przepisach prawnych dla danego rodzaju soku. Zagęszczone soki, dla których nie przewidziano minimalnej zawartości rozpuszczalnych substancji stałych, są przywracane wodą podwójnie destylowaną do zawartości rozpuszczalnych substancji stałych 11,2%. Zawartość rozpuszczalnych substancji stałych jest kontrolowana zgodnie z GOST 29030.

Ekstrakcję zrekonstytuowanych próbek przeprowadza się zgodnie z 8.1.

8.3 Wykonywanie pomiarów

8.3.1 Warunki ogólne

Próbki i roztwory kalibracyjne przygotowane zgodnie z 8.1 są nastrzykiwane w wybranej kolejności. Najpopularniejsza metoda polega na tym, że wstrzykiwanie roztworów kalibracyjnych rozpoczyna i kończy serię wstrzyknięć próbki.

System HPLC-MS/MS musi być ustawiony na SRM z przejściami zapewniającymi selektywną detekcję analizowanych mikotoksyn. Czasy retencji i powierzchnie pików określa się stosując oprogramowanie analityczne do rejestrowania i obliczania wyników analizy, dołączone do systemu HPLC-MS/MS. Przykłady systemów HPLC/MS/MS, warunki rozdziału i detekcja spektrometrii masowej podano w Załączniku B.

Próbki są testowane w warunkach powtarzalności dla dwóch równoległych oznaczeń zgodnie z GOST ISO 5725-1 (podrozdział 3.14) i GOST ISO 5725-2.

8.3.2 Identyfikacja mikotoksyn

Aby zidentyfikować mikotoksyny, czasy retencji uzyskane z roztworów próbek porównuje się z czasami retencji odpowiednich mikotoksyn z roztworów kalibracyjnych. Aby potwierdzić obecność mikotoksyn, porównuje się stosunek natężenia sygnału od pierwszego do drugiego m/z-przejście ze stosunkiem natężeń sygnałów mikotoksyn z roztworów kalibracyjnych.

Stosunek pików dla jednej mikotoksyny nie powinien różnić się o więcej niż 20% od oczekiwanego stosunku intensywności sygnału.

9 Przetwarzanie i prezentacja wyników badań

9.1 Kwantyfikacja

Oznaczenie ilościowe mikotoksyn w wstrzykniętej objętości przygotowanego ekstraktu (patrz 8.1) przeprowadza się przez porównanie powierzchni (lub wysokości) piku mikotoksyny z odpowiednią charakterystyką kalibracji dla tej mikotoksyny.

Stężenie masowe mikotoksyn w badanych produktach, µg/dm, oblicza się ze wzoru

gdzie jest przelicznik z centymetrów sześciennych na decymetry sześcienne;

- stężenie mikotoksyny w objętości ekstraktu 10 mm, wstrzykiwanej do systemu HPLC-MS/MS, określone zależnością kalibracyjną, ng;

to objętość acetonitrylu, w której ekstrakt został ponownie rozpuszczony po zatężeniu, cm;

- całkowita objętość ekstraktu, z którego pobrano objętość do stężenia, cm;

- objętość próbki wprowadzonej do chromatografu (=10 mm), mm;

- objętość próbki soków pobranej do badania, cm;

- objętość ekstraktu wybranego do zatężenia, patrz

Przy obliczaniu ilości mykotoksyn w produktach zagęszczonych sokami uwzględnia się stopień rozcieńczenia wodą zgodnie z pkt 8.2.

Wynik pomiaru stanowi średnią arytmetyczną wyników trzech równoległych oznaczeń, jeżeli spełniony jest warunek akceptacji

gdzie , to wartości maksymalne i minimalne z otrzymanych trzech wyników równoległych oznaczeń, µg/dm;

, , - wyniki trzech równoległych oznaczeń, µg/dm;

- wartość zakresu krytycznego, %.

Rozbieżność pomiędzy trzema równoległymi oznaczeniami (jako procent wartości średniej) wykonanymi w tym samym laboratorium nie powinna przekraczać granicy powtarzalności (zbieżności) równej 3,6· z prawdopodobieństwem = 0,95. Jeżeli ten warunek jest spełniony, ostateczny wynik pomiaru stanowi średnią arytmetyczną z trzech równoległych oznaczeń, zaokrągloną do trzeciego miejsca po przecinku.

Wyniki pomiarów zapisywane są w protokole zgodnie z GOST ISO/IEC 17025.

9.2 Jeżeli uzyskany wynik wskazuje, że zawartość mikotoksyn przekracza górną granicę zakresu zależności wzorcowania, należy przygotować nową próbkę zwiększając jej rozcieńczenie wodą i ponownie zmierzyć.

10 Charakterystyka metrologiczna

Charakterystyki metrologiczne metody dla PAT i OTA odpowiadają warunkom podanym w tabeli 3.


Tabela 3 — Dokładności metod HPLC-MS/MS

Zakres pomiarowy, µg/dm	Względne odchylenie standardowe powtarzalności, %	Względne odchylenie standardowe odtwarzalności, %
przy określaniu PAT (nie więcej)
przy ustalaniu OTA (nie więcej)

Granice wykrywania PAT i OTA w próbkach produktów sokowych to: LOD- 0,03 mcg/dm, LOQ- 0,1 mikrograma / dm.m.

11 Kontrola jakości wyników pomiarów

Kontrola jakości wyników pomiarów w laboratorium polega na monitorowaniu stabilności wyników pomiarów za pomocą sprawdzenia stabilności odchylenia standardowego dokładności pośredniej. Testy stabilności przeprowadza się za pomocą kart kontrolnych Shewharta. Częstotliwość monitorowania stabilności wyników przeprowadzonych pomiarów jest regulowana w wewnętrznych dokumentach systemu jakości. W przypadku niezadowalających wyników kontroli, na przykład w przypadku przekroczenia limitu działania lub regularnego przekroczenia limitu ostrzegawczego, ustalane są przyczyny tych odchyleń, w tym wymiana odczynników, sprawdzenie pracy operatora.
GOST 12.1.007.

UWAGA! Podczas pracy z mikotoksynami należy wziąć pod uwagę, że PAT i OTA mają silne właściwości toksyczne z wyraźnym działaniem nefrotoksycznym, immunotoksycznym, teratogennym i genotoksycznym. Zgodnie z klasyfikacją IARC OTA odnosi się do substancji rakotwórczych potencjalnie niebezpiecznych dla ludzi (grupa 2B). Podczas pracy z mykotoksynami należy zachować większe środki ostrożności. Personel laboratorium powinien nosić odzież ochronną, w tym osłonę twarzy, rękawice i okulary. Wszystkie operacje z mykotoksynami przeprowadzane są pod wyciągiem. Po zakończeniu prac zużyte szkło laboratoryjne oraz odpady poddawane są dekontaminacji.

Załącznik A (obowiązkowy). Weryfikacja spektrofotometru i wyznaczenie współczynnika korekcji CF do obliczania stężeń masowych mikotoksyn w roztworach wzorcowych

Załącznik A
(obowiązkowy)

Weryfikacja spektrofotometru i wyznaczenie współczynnika korygującego do obliczenia stężeń masowych mikotoksyn w roztworach wzorcowych

A.1 W celu określenia stężeń masowych mikotoksyn w roztworach podstawowych (patrz 7.4.1.1 i 7.4.2.1) należy użyć spektrofotometru odpowiedniego do pomiaru gęstości optycznej roztworów w kuwecie kwarcowej o długości drogi optycznej 1 cm w zakresie długości fal od 200 nm do 400 nm.

Kalibrację spektrofotometru przeprowadza się w następujący sposób.

Zmierzyć gęstość optyczną trzech roztworów dwuchromianu potasu (KCrO) w kwasie siarkowym (HSO) - 0,25; 0,125 i 0,0625 mmol/dm w punkcie maksymalnej absorpcji (długość fali około 350 nm), stosując jako kontrolę roztwór kwasu siarkowego (HSO) o stężeniu 0,009 mmol/dm.

Następnie oblicza się wartość molowego współczynnika gęstości optycznej, m/mol, dla każdego stężenia dwuchromianu potasu według wzoru

gdzie jest zmierzoną wartością gęstości optycznej roztworu dwuchromianu potasu w kwasie siarkowym dla odpowiedniego stężenia, jednostki. PO;

- stężenie roztworu dwuchromianu potasu w kwasie siarkowym, mmol/dm.

Jeżeli różnica pomiędzy trzema zmierzonymi wartościami wykracza poza gwarantowany zakres dokładności pomiaru gęstości optycznej, należy sprawdzić procedurę kalibracji lub sprzęt. Oblicz średnią arytmetyczną.

Wyznacz współczynnik korekcji (wartość bezwymiarową) dla konkretnego sprzętu (spektrofotometr i kuweta) według wzoru

gdzie jest wartością charakterystyczną molowego współczynnika gęstości optycznej dla roztworów dwuchromianu potasu (KCrO), m/mol;

- molowy współczynnik gęstości optycznej, obliczony ze wzoru (A.1), m/mol.

Jeżeli wynikowa wartość współczynnika korekcji jest mniejsza niż 0,95 lub większa niż 1,05, należy sprawdzić procedurę kalibracji lub sprzęt w celu wyeliminowania odchyleń (ten sam zestaw kuwet jest używany do kalibracji i czystości) -.

Dodatek B (informacyjny). Przykłady systemów HPLC-MS/MS do oznaczania mykotoksyn w sokach i innych produktach sokowych*

Załącznik B
(odniesienie)

________________
* Te przykłady są zalecane i podane dla wygody użytkowników niniejszej Normy Międzynarodowej.

B.1 System HPLC-MS/MS nr 1

Platforma sprzętowa: Varian 320-MS LC/MS/MS.

joński