» , » Jedan gen jedan enzim

Jedan gen, jedan enzim

         92
Datum objave: 24. jula 2018

    

Hipoteza jedan gen-jedan enzim ideja je iznesena ranih 1940-ih da svaki gen kontrolira sintezu ili aktivnost jednog enzima. Koncept, koji kombinuje polja genetike i biohemije, predložili su američki genetičar George Wells Beadle i američki biohemičar Edward L. Tatum, koji su sproveli istraživanje o Neurospora crassa. Njihovi eksperimenti uključivali su prvo snimanje forme do rendgenskih zraka koji induciraju mutacije, a zatim ga kultivirali u minimalnom mediju za rast koji je sadržavao samo esencijalne hranjive tvari potrebne za preživljavanje divljeg tipa soja. Otkrili su da mutantni sojevi plijesni zahtijevaju dodatak određenih aminokiselina kako bi rasli. Koristeći ove informacije, istraživači su uspjeli povezati mutacije u specifičnim genima s poremećajem pojedinačnih enzima u metaboličkim putevima koji bi normalno proizveli aminokiseline koje nedostaju. Sada je poznato da nisu svi geni kodirani za enzim i da se neki enzimi sastoje od nekoliko kratkih polipeptida kodiranih sa dva ili više gena.

Ekspresija gena je proces kojim se nasljedna informacija iz gena pretvara u funkcionalni proizvod - RNK ili protein. Ekspresija gena se može regulisati u svim fazama procesa: tokom transkripcije, tokom translacije i u fazi posttranslacionih modifikacija proteina.

Ekspresija gena je supstrat za evolucijsku promjenu.

Regulacija ekspresije gena na nivou transkripcije kod prokariota:

Regulacija transkripcije u ćelijama se vrši na nivou pojedinačnih gena, njihovih blokova, pa čak i celih hromozoma. Sposobnost kontrole mnogih gena, u pravilu, osigurava prisustvo zajedničkih regulatornih nukleotidnih sekvenci u njima, s kojima su transkripcijski faktori istog tipa u interakciji. Kao odgovor na djelovanje specifičnih efektora, takvi faktori stiču sposobnost da se vežu sa velikom preciznošću za regulatorne sekvence gena. Posljedica toga je slabljenje ili jačanje transkripcije odgovarajućih gena. Tri glavna transkripcijska koraka koje bakterijske stanice koriste za regulaciju sinteze RNK su inicijacija, elongacija i terminacija.

Ekspresija eukariotskih gena razlikuje se od ekspresije prokariota:

1) Eukarioti imaju tri tipa RNA polimeraza: RNA polimeraza1 katalizira transkripciju ribosomskih gena. RNA polimeraza2 katalizira transkripciju svih strukturnih gena. RNA polimeraza3 katalizuje transkripciju tRNA i 5S-ribosomalne RNK (katalizuje stvaranje mRNK prisutnih samo kod eukariota).

2) Region promotera kod eukariota je duži.

3) Kod eukariota, svaki gen je predstavljen naizmjeničnim kodirajućim i nekodirajućim sekvencama. Kodiranje - egzoni, nekodirajuće - introni.

4) Eukarioti imaju pojačivače koje prepoznaju proteini. Mogu se nalaziti dosta daleko od početka transkripcije. Pojačivač i njegov povezani protein približavaju se mjestu vezivanja RNA polimeraze-DNK.

5) Postoje "prigušivači" koji potiskuju transkripciju.

Jedan gen, jedan enzim hipoteza, sugerira da svaki gen može kodirati samo jedan polipeptidni lanac, koji, zauzvrat, može biti uključen kao podjedinica u složeniji proteinski kompleks. Teoriju su izneli G. Beadle i E. Tatum 1941. godine na osnovu genetske i biohemijske analize neurospora, otkrili su da je u eksperimentalnim uslovima, pod uticajem različitih mutacija, samo jedna od bilo kog lanca biohemijskih reakcija bila isključuje svaki put. Sumnje u apsolutnu validnost ove teorije pojavile su se u vezi sa otkrićem sistema "dva gena - jedan polipeptid", kao i postojanjem gena koji se preklapaju. Sa funkcionalnog stanovišta, ova teorija je uslovna u vezi sa otkrićem multifunkcionalnih proteina.

Obrasci postojanja ćelije u vremenu. Ćelijski (životni) ciklus. apoptoza i nekroza. Mitotički (proliferativni) ciklus. Glavni događaji mitotičkog ciklusa. Reproduktivna (interfaza) i separacija (mitoza) faze mitotičkog ciklusa. Problemi proliferacije ćelija u medicini.

ćelijski ciklus- ovo je period postojanja ćelije od trenutka njenog formiranja dijeljenjem matične ćelije do njene vlastite diobe ili smrti.

Važna komponenta ćelijskog ciklusa je mitotički ciklus- kompleks međusobno povezanih i vremenski usklađenih događaja koji se dešavaju u procesu pripreme ćelije za diobu i tokom same diobe. Osim toga, životni ciklus uključuje period obavljanja ćelija specifičnih funkcija višećelijskog organizma, kao i periode mirovanja. Tokom perioda mirovanja, neposredna sudbina ćelije nije određena: ona može ili započeti pripremu za mitozu, ili započeti specijalizaciju u određenom funkcionalnom pravcu.

Trajanje mitotičkog ciklusa za većinu ćelija je od 10 do 50 sati.Biološki značaj mitotičkog ciklusa je da obezbeđuje kontinuitet hromozoma u nizu ćelijskih generacija, formiranje ćelija koje su ekvivalentne zapreminom i sadržajem. nasljedne informacije. Dakle, ciklus je opći mehanizam za reprodukciju ćelijske organizacije eukariotskog tipa u individualnom razvoju.

sastoje se u reduplikaciji (samo-udvostručavanju) naslednog materijala matične ćelije i u ravnomernoj raspodeli ovog materijala između ćelija kćeri. Prema dva glavna događaja mitotičkog ciklusa u njemu alocirati reproduktivnu i fazu razdvajanja koja odgovara interfazi i mitozi klasične citologije.

apoptoza- programirana ćelijska smrt, regulisani proces samouništenja na ćelijskom nivou, usled čega se ćelija fragmentira u zasebna apoptotska tela, ograničena plazma membranom. Fragmenti mrtve ćelije obično se vrlo brzo fagocitiraju od strane makrofaga ili susjednih stanica, zaobilazeći razvoj upalne reakcije. Proces apoptoze traje 1-3 sata. Jedna od glavnih funkcija apoptoze je uništavanje defektnih (oštećenih, mutantnih, inficiranih) stanica.

Nekroza- patološki proces, izražen u lokalnoj smrti tkiva u živom organizmu kao rezultat bilo kakvog egzogenog ili endogenog oštećenja. Nekroza se manifestuje bubrenjem, denaturacijom i koagulacijom citoplazmatskih proteina, destrukcijom ćelijskih organela i, konačno, cele ćelije. Najčešći uzroci nekrotičnog oštećenja tkiva su: prestanak opskrbe krvlju i izlaganje patogenim produktima bakterija ili virusa.

30. Mitotički ciklus. Glavni događaji međufaznih perioda. Sadržaj i značaj faza mitoze. Biološki značaj mitoze.

Mitotic(proliferativno)ciklus -kompleks međusobno povezanih i koordinisanih događaja koji se dešavaju u procesu pripreme ćelije za deobu i tokom same deobe. Osim toga, životni ciklus uključuje period izvršenja ćelije višećelijski organizam specifične funkcije kao i periodi mirovanja. Tokom perioda mirovanja, neposredna sudbina ćelije nije određena: ona može ili započeti pripremu za mitozu, ili započeti specijalizaciju u određenom funkcionalnom pravcu. Trajanje mitotskog ciklusa za većinu ćelija je od 10 do 50 sati.

Biološki značaj mitotičkog ciklusa je da osigurava kontinuitet hromozoma u nizu ćelijskih generacija, formiranje ćelija koje su ekvivalentne po obimu i sadržaju nasljednih informacija. Dakle, ciklus je opći mehanizam za reprodukciju ćelijske organizacije eukariotskog tipa u individualnom razvoju.

Glavni događaji mitotičkog ciklusa su u reduplikacija(samoudvostručavanje) nasljednog materijala matične ćelije i u ujednačena distribucija ovog materijala između ćelija kćeri. Ovi događaji su praćeni redovnim promjenama u hemijskoj i morfološkoj organizaciji hromozomi - nuklearne strukture, u kojima je koncentrisano više od 90% genetskog materijala eukariotske stanice (glavni dio ekstranuklearne DNK životinjske stanice nalazi se u mitohondrijima).

Hromozomi, u interakciji sa ekstrahromozomskim mehanizmima, obezbeđuju: a) skladištenje genetskih informacija, b) korišćenje ovih informacija za stvaranje i održavanje ćelijske organizacije, c) regulaciju čitanja naslednih informacija, d) udvostručavanje (samokopiranje) genetskih materijal, e) njegov prenos sa ćelije majke na ćerku.

Promjene ćelija u mitotičkom ciklusu.

Prema dva glavna događaja mitotičkog ciklusa razlikuje se reproduktivni i podjela odgovarajuće faze međufaza i mitoza klasična citologija (slika 2.11).

U početnom segmentu interfaze ( postmitotsko, presintetičko, ili Gi-period) obnavljaju se karakteristike organizacije interfazne ćelije, dovršava se formiranje nukleola, koje je počelo u telofazi. Značajna (do 90%) količina proteina ulazi u jezgro iz citoplazme. U citoplazmi, paralelno sa reorganizacijom ultrastrukture, intenzivira se sinteza proteina. To doprinosi rastu ćelijske mase. Ako ćelija kćerka mora ući u sljedeći mitotički ciklus, sinteze se usmjeravaju: formiraju se kemijski prekursori DNK, enzimi koji kataliziraju reakciju reduplikacije DNK i sintetizira se protein koji pokreće ovu reakciju. Tako se sprovode procesi pripreme sledećeg perioda interfaze – sintetičkog.

AT sintetički ili S-period količina nasljednog materijala ćelije se udvostručuje. Sastoji se od divergencije spirale DNK u dva lanca, nakon čega slijedi sinteza komplementarnog lanca u blizini svakog od njih. Rezultat su dvije identične zavojnice. Molekuli DNK koji su komplementarni majčinim formiraju se u odvojenim fragmentima duž dužine hromozoma, štaviše, nesimultano (asinhrono) u različitim delovima istog hromozoma, kao i u različitim hromozomima. Zatim parcele (replikacijske jedinice - replikoni) novoformirane DNK su „povezane” u jednu makromolekulu.

Vremenski interval od kraja sintetičkog perioda do početka mitoze traje postsintetički(premitotic), ili G 2 - tačka interfaze. Karakterizira ga intenzivna sinteza RNK, a posebno proteina. Udvostručenje mase citoplazme je završeno u odnosu na početak interfaze. Ovo je neophodno da bi ćelija ušla u mitozu.

Otkrića egzon-intronske organizacije eukariotskih gena i mogućnost alternativnog spajanja pokazala su da ista nukleotidna sekvenca primarnog transkripta može obezbijediti sintezu nekoliko polipeptidnih lanaca različitih funkcija ili njihovih modificiranih analoga. Na primjer, mitohondrije kvasca sadrže gen box (ili cob) koji kodira respiratorni enzim citokroma b. Može postojati u dva oblika: "dugi" gen, koji se sastoji od 6400 bp, ima 6 egzona ukupne dužine 1155 bp. i 5 introna. Kratki oblik gena sastoji se od 3300 bp. i ima 2 introna. To je zapravo "dugački" gen bez prva tri introna. Oba oblika gena su podjednako dobro izražena.

Nakon uklanjanja prvog introna gena “duge” kutije, na osnovu kombinovane sekvence nukleotida prva dva eksona i dijela nukleotida drugog introna, formira se šablon za nezavisni protein, RNA maturazu (Sl. 3.43). Funkcija RNA maturaze je da obezbedi sledeću fazu spajanja - uklanjanje drugog introna iz primarnog transkripta i, konačno, formiranje šablona za citokrom b.

Drugi primjer je promjena u obrascu spajanja primarnog transkripta koji kodira strukturu molekula antitijela u limfocitima. Membranski oblik antitijela ima dugačak "rep" aminokiselina na C-terminusu, koji osigurava fiksaciju proteina na membrani. Izlučeni oblik antitijela nema takav rep, što se objašnjava uklanjanjem nukleotida koji kodiraju ovu regiju iz primarnog transkripta tokom spajanja.

Kod virusa i bakterija je opisana situacija u kojoj jedan gen može istovremeno biti dio drugog gena, ili neka sekvenca nukleotida DNK može biti dio dva različita gena koji se preklapaju. Na primjer, na fizičkoj mapi genoma faga FX174 (slika 3.44) može se vidjeti da se sekvenca B gena nalazi unutar A gena, a gen E dio sekvence D gena. Organizacija genoma faga uspjela je objasniti postojeću neusklađenost između njegove relativno male veličine (sastoji se od 5386 nukleotida) i broja aminokiselinskih ostataka u svim sintetiziranim proteinima, što premašuje teoretski dozvoljeni kapacitet za dati genomski kapacitet. Mogućnost sklapanja različitih peptidnih lanaca na mRNA sintetiziranoj iz gena koji se preklapaju (A i B ili E i D) je osigurana prisustvom ribosomskih vezivnih mjesta unutar ove mRNA. Ovo omogućava prevođenje drugog peptida da počne od nove referentne tačke.

Nukleotidna sekvenca B gena je takođe deo A gena, a E gen je deo D gena.

U genomu λ faga pronađeni su i geni koji se preklapaju, prevedeni i sa pomakom okvira i u istom okviru čitanja. Takođe se pretpostavlja da se dve različite mRNA mogu transkribovati iz oba komplementarna lanca istog DNK regiona. Ovo zahtijeva prisustvo promotorskih regija koje određuju kretanje RNK polimeraze u različitim smjerovima duž molekule DNK.

Opisane situacije, koje svjedoče o prihvatljivosti čitanja različitih informacija iz iste sekvence DNK, sugeriraju da su preklapajući geni prilično čest element u organizaciji genoma virusa i, moguće, prokariota. Kod eukariota diskontinuitet gena takođe omogućava sintezu različitih peptida zasnovanih na istoj sekvenci DNK.

Imajući sve ovo na umu, potrebno je izmijeniti definiciju gena. Očigledno, više se ne može govoriti o genu kao o kontinuiranoj sekvenci DNK koja jedinstveno kodira određeni protein. Očigledno, u ovom trenutku formulu "Jedan gen - jedan polipeptid" još uvijek treba smatrati najprihvatljivijom, iako neki autori predlažu da se to promijeni: "Jedan polipeptid - jedan gen". U svakom slučaju, pod pojmom gen treba podrazumijevati funkcionalnu jedinicu nasljednog materijala, koji je po svojoj hemijskoj prirodi polinukleotid i određuje mogućnost sinteze polipeptidnog lanca, tRNA ili rRNA.

Jedan gen jedan enzim.

Godine 1940. J. Beadle i Edward Tatum su koristili novi pristup da proučavaju kako geni obezbjeđuju metabolizam u pogodnijem objektu istraživanja - mikroskopskoj gljivi Neurospora crassa. Dobili su mutacije u kojima; nije bilo aktivnosti jednog ili drugog metaboličkog enzima. A to je dovelo do činjenice da mutantna gljiva nije bila u stanju sama sintetizirati određeni metabolit (na primjer, aminokiselinu leucin) i mogla je živjeti samo kada se leucin doda u hranjivi medij. Teorija "jedan gen - jedan enzim" koju su formulirali J. Beadle i E. Tatum brzo je stekla široko priznanje među genetičarima, a i sami su dobili Nobelovu nagradu.

Metode. Odabir takozvanih "biohemijskih mutacija" koje dovode do poremećaja u djelovanju enzima koji obezbjeđuju različite metaboličke puteve, pokazao se vrlo plodonosnim ne samo za nauku, već i za praksu. Prvo su doveli do pojave genetike i selekcije industrijskih mikroorganizama, a potom i do mikrobiološke industrije, koja koristi sojeve mikroorganizama koji prekomjerno proizvode takve strateški važne supstance kao što su antibiotici, vitamini, aminokiseline itd. Principi selekcije i genetskog inženjeringa sojeva prekomjernih proizvođača zasnovani su na ideji da "jedan gen kodira jedan enzim". I iako ova ideja odlična praksa donosi višemilionski profit i spašava milione života (antibiotici) – nije konačna. Jedan gen nije samo jedan enzim.

"

1. Gen je dio molekule DNK, koja je funkcionalna jedinica nasljedne informacije.

1. Gen zauzima određeno područje u hromozomu – lokus.

2. Rekombinacija se može dogoditi unutar gena.

3. DNK, koja je dio gena, sposobna je za popravku.

4. Postoje geni: strukturni, regulatorni itd.

5. Raspored trojki je komplementaran aminokiselinama (mutacije sa pomakom okvira čitanja).

6. Genotip, budući da je diskretan (sastoji se od pojedinačnih gena), funkcionira kao cjelina.

7. Genetski kod je univerzalan.

8. Genetski kod je degenerisan (za mnoge aminokiseline postoji više od jednog kodona - mjesta)

9. Geni su raspoređeni u linearnom redoslijedu na hromozomu i formiraju vezu. Broj vezanih grupa odgovara haploidnom skupu hromozoma (23 kod ljudi ili 24 sa rezervom za pol - x i y hromozome).

Struktura proteina određena je skupom i redoslijedom aminokiselina u njihovim peptidnim lancima. Upravo je ova sekvenca aminokiselina u peptidima šifrirana u molekulima DNK pomoću genetskog koda.

Svojstva genetskog koda:

1. trostrukost- svaka aminokiselina je kodirana sa tri susjedna nukleotida.
2. degeneracija- mnoge aminokiseline su šifrirane s nekoliko tripleta.
3. Specifičnost- svaki triplet može kodirati samo jednu određenu aminokiselinu.
4. Svestranost- potpuna usklađenost kodeksa u različitim vrstama živih organizama.
5. Kontinuitet- nukleotidne sekvence se čitaju trostruko po trostruko bez praznina.
6. Kodoni koji se ne preklapaju- susjedne trojke se ne preklapaju jedna s drugom.

20. Ribosomalni ciklus sinteze proteina (inicijacija, elongacija, terminacija). Posttranslacijske transformacije proteina.

Nasljedne informacije zabilježene pomoću genetskog koda pohranjene su u molekulima DNK, ali ne učestvuju direktno u održavanju života ćelije. Ulogu posrednika, čija je funkcija da prevede nasljedne informacije pohranjene u DNK u radni oblik, igra RNK. Na ribosomima se odvija proces interakcije između mRNA i tRNA, koji osigurava prevođenje informacija sa jezika nukleotida u jezik aminokiselina. Ribosomalne RNK nisu samo strukturna komponenta ribozoma, već osiguravaju i njihovo vezivanje za specifičnu sekvencu mRNA nukleotida. Ovo uspostavlja početak i okvir čitanja tokom formiranja peptidnog lanca. Osim toga, oni pružaju interakciju između ribozoma i tRNA. Ribosomi imaju 2 utora. Jedan od njih drži rastući polipeptidni lanac, drugi mRNA. Osim toga, 2 mjesta vezanja tRNA su izolirana u ribosomima. Aminoacil-tRNA se nalazi u aminoacil, A-mjestu, noseći specifičnu aminokiselinu. U peptidilnom, P-odjeljku, obično se nalazi tRNA. Formiranje A- i P-mjesta osiguravaju obje podjedinice ribozoma. Prevođenje se može podijeliti u tri faze: početak, produljenje i završetak.

Faza inicijacije sastoji se u spajanju dvije subčestice ribosoma koje su prethodno bile odvojene u citoplazmi na određenom mjestu mRNA i vezivanju prve aminoacil-tRNA za nju. Ovo također postavlja okvir za čitanje informacija sadržanih u mRNA.

faza elongacije ili elongacija peptida, uključuje sve reakcije od trenutka formiranja prve peptidne veze do vezivanja posljednje amk. To je ciklički ponavljajući događaj u kojem postoji specifično prepoznavanje sljedećeg kodona aminoacil-tRNA smještenog na A-mjestu, komplementarno vezi između antikodona i kodona. Faza završetka ili završetak sinteze polipeptida, povezan je sa prepoznavanjem od strane specifičnog ribosomskog proteina jednog od terminacionih kodona (UAA, UAG, UGA), kada on uđe na A-mjesto ribozoma. U ovom slučaju, voda je vezana za posljednji amc u peptidnom lancu i njegov karboksilni kraj je odvojen od tRNA. Kao rezultat toga, završeni peptidni lanac gubi vezu sa ribozomom, koji se raspada na dvije podčestice.

Posttranslacijska transformacija proteina. Peptidni lanci sintetizovani tokom translacije, na osnovu svoje primarne strukture, dobijaju sekundarnu i tercijarnu, a mnoge i kvaternarnu organizaciju formiranu od nekoliko peptidnih lanaca. Ovisno o funkcijama koje obavljaju proteini, njihove aminokiselinske sekvence mogu biti podvrgnute različitim transformacijama, formirajući funkcionalno aktivne proteinske molekule. Mnogi membranski proteini se sintetiziraju kao predproteini s vodećim nizom na N-terminusu koji im omogućuje membransko prepoznavanje. Sekretorni proteini također imaju vodeću sekvencu na N-terminusu koja osigurava njihov transport kroz membranu. Neki proteini odmah nakon translacije nose dodatne prosekvencije aminokiselina koje određuju stabilnost aktivnih proteinskih prekursora. Tokom sazrevanja proteina, oni se uklanjaju, omogućavajući prelazak neaktivnog proproteina u aktivni protein. Formirajući tercijarnu i kvartarnu organizaciju u toku posttranslacionih transformacija, proteini stiču sposobnost aktivnog funkcionisanja, uključuju se u određene ćelijske strukture i obavljaju enzimske i druge funkcije.

Odnos između gena i osobine. Hipoteza "jedan gen - jedan enzim", njeno moderno tumačenje: "jedan gen - jedan polipeptidni lanac"

Gene - dio molekule DNK koji nosi informacije o strukturi polipeptidnog lanca ili makromolekula. Geni jednog hromozoma su raspoređeni linearno, formirajući grupu veza. DNK u hromozomu obavlja različite funkcije. Geni su male veličine, iako se sastoje od hiljada parova baza. Prisustvo gena se utvrđuje ispoljavanjem osobine gena (konačnog proizvoda).

Za Mendela, gen je samo simbol pogodan za definisanje zakona nasljeđivanja. Veza između gena i osobine (proizvoda) otkrivena je tokom proučavanja fermentacije u okruženju bez vazduha - 1902. Garrod. Proučavao je pedigre pacijenata sa alkaptonurijom, došao do zaključka da je bolest rezultat poremećaja metabolizma dušika, dok. Umjesto uree nastaje tamna tvar. Uz pomoć Šišmiša 1908. godine, sugerirano je da se bolest javlja kod recesivnih homozigota kojima nedostaje neka vrsta enzimske reakcije, što dovodi do nakupljanja i izlučivanja supstrata, koji bi inače trebao biti podijeljen. Ljudska krv sadrži homogentizinsku kiselinu, ali se normalno razlaže oksidazom homogentizinske kiseline do maleinskog acetata, zatim do vode i ugljičnog dioksida. Pacijenti nemaju oksidazu, pa se kiselina akumulira i izlučuje urinom.

Albinizam je također naslijeđen, iako je mnogo češći. Kod ove bolesti ne postoji enzim koji pretvara tirozin u melanin.

Do 1940. mišljenja naučnika su bila podijeljena, ali nije bilo teorije. 1940 - Beadle i Tatum pretpostavljeno: 1 gen - 1 enzim. E ta hipoteza je igrala važnu ulogu - naučnici su počeli da razmatraju konačne proizvode. Pokazalo se da hipoteza ima ograničenja, jer Svi enzimi su proteini, ali nisu svi proteini enzimi. Proteini su po pravilu oligomeri – tj. postoje u kvartarnoj strukturi. Na primjer, kapsula mozaika duhana ima preko 1200 polipeptida. Trenutno je najprihvatljivija hipoteza "Jedan gen - jedan polipeptid". Pod pojmom gen treba shvatiti funkcionalnu jedinicu nasljeđa, koja je po svojoj hemijskoj prirodi polinukleotid i određuje mogućnost sinteze polipeptidnog lanca.

Gen kao jedinica varijabilnosti. Genske mutacije i njihova klasifikacija. Uzroci i mehanizmi genskih mutacija. Posljedice genskih mutacija.

Gen je elementarna jedinica nasljednog materijala. Genske mutacije povezana s promjenom unutrašnje strukture gena, koja pretvara jedan alel u drugi.

Promjene u strukturi DNK koja formira gen mogu se podijeliti u 3 grupe.

4.2.1. Jedan gen, jedan enzim hipoteza

Prvo istraživanje. Nakon što je 1902. Garrod ukazao na vezu genetskog defekta u alkaptonuriji sa nesposobnošću organizma da razgradi homogentizinsku kiselinu, bilo je važno razjasniti specifičan mehanizam koji leži u osnovi ovog poremećaja. S obzirom da se već tada znalo da metaboličke reakcije kataliziraju enzimi, moglo se pretpostaviti da je kršenje nekog enzima dovelo do alkaptonurije. O takvoj hipotezi raspravljao je Driesch (1896.). To su također izrazili Haldane (1920, vidi) i Garrod (1923). Važne faze u razvoju biohemijske genetike bile su rad Kuhna i Butenandta na proučavanju boje očiju mlinskog moljca. Ephesia kuhniella i slične studije Beadlea i Ephrussija Drosophila(1936). U ovim pionirskim radovima, mutanti insekata koji su prethodno proučavani genetskim metodama odabrani su kako bi se razjasnili mehanizmi djelovanja gena. Međutim, ovakav pristup nije doveo do uspjeha. Ispostavilo se da je problem previše kompliciran, a za njegovo rješavanje bilo je potrebno:

1) izabrati jednostavan model organizma pogodan za eksperimentalno proučavanje;

2) tražiti genetsku osnovu biohemijskih osobina, a ne biohemijsku osnovu genetski određenih osobina. Oba uslova su ispunili Beadle i Tatum 1941. (vidi i Beadle 1945).

Beadle i Tatum model. Njihov je članak počeo ovako:

„Sa stanovišta fiziološke genetike, razvoj i funkcionisanje organizma može se svesti na složen sistem hemijskih reakcija koje su nekako kontrolisane genima. Sasvim je logično pretpostaviti da ovi geni ... ili djeluju kao enzimi sami, ili određuju njihovu specifičnost. Poznato je da genetski fiziolozi obično pokušavaju da istraže fiziološke i biohemijske osnove već poznatih naslednih osobina. Ovaj pristup je omogućio da se utvrdi da mnoge biohemijske reakcije kontrolišu specifični geni. Takve studije su pokazale da enzimi i geni imaju isti red specifičnosti. Međutim, opseg ovog pristupa je ograničen. Najozbiljnije ograničenje je da, u ovom slučaju, u vidno polje istraživača spadaju nasljedne osobine koje nemaju smrtonosni učinak i stoga su povezane s reakcijama koje nisu bitne za život organizma. Druga poteškoća... je da tradicionalni pristup problemu uključuje upotrebu spolja manifestnih znakova. Mnoge od njih su morfološke varijacije zasnovane na sistemima biohemijskih reakcija toliko složenih da je njihova analiza izuzetno teška.

Ova razmatranja su nas dovela do sljedećeg zaključka. Proučavanje opšteg problema genetičke kontrole biohemijskih reakcija koje određuju razvoj i metabolizam trebalo bi da se sprovede korišćenjem postupak suprotan općeprihvaćenom: umjesto pokušaja da se otkrije hemijska osnova poznatih nasljednih osobina, potrebno je utvrditi da li geni kontrolišu poznate biohemijske reakcije i kako to rade. Neurospora askomiceta ima svojstva koja omogućavaju implementaciju ovog pristupa i istovremeno služi kao pogodan objekt za genetička istraživanja. Zato je naš program izgrađen na korišćenju ovog organizma. Polazili smo od činjenice da izlaganje rendgenskim zracima uzrokuje mutacije u genima koji kontroliraju određene kemijske reakcije. Pretpostavimo da organizam, da bi preživio u datom okruženju, mora izvršiti neku vrstu kemijske reakcije, tada će se mutant lišen takve sposobnosti pokazati neodrživim u ovim uvjetima. Međutim, može se održavati i proučavati ako se uzgaja u mediju u koji je dodan vitalni proizvod genetski blokirane reakcije.”

4 Djelovanje gena 9

Rice. 4.1. Šema eksperimenta za detekciju biohemijskih mutanata neurospora Na kompletnoj podlozi, mutacije izazvane rendgenskim ili ultraljubičastim zracima ne ometaju rast gljivice. Međutim, mutant ne raste na minimalnom mediju. Kada se vitamini dodaju u minimalnu podlogu, sposobnost rasta se obnavlja. Kada se dodaju aminokiseline, nema rasta Na osnovu ovih podataka može se pretpostaviti da je do mutacije došlo u genu koji kontroliše metabolizam vitamina. korak je identificirati vitamin koji može obnoviti normalnu funkciju. Genetski blok je pronađen među reakcijama biosinteze vitamina.

Zatim Beadle i Tatum opisuju dizajn eksperimenta (slika 4.1). Sastav kompletne podloge uključivao je agar, anorganske soli, ekstrakt slada, ekstrakt kvasca i glukozu. Minimalni medij je sadržavao samo agar, soli, biotin i izvor ugljika. Najdetaljnije su proučavani mutanti koji su rasli na kompletnoj podlozi, a ne na minimalnoj. Da bi se ustanovilo jedinjenje čija je sinteza poremećena u svakom od mutanata, minimalnom agaru su dodane pojedinačne komponente kompletnog medijuma.

Na ovaj način izolovani su sojevi koji nisu bili u stanju da sintetiziraju određene faktore rasta: piridoksin, tiamin i para-aminobenzojevu kiselinu. Pokazalo se da su ovi defekti posljedica mutacija na određenim lokusima. Rad je označio početak brojnih studija o neurosporama, bakterijama i kvascima, u kojima je uspostavljena korespondencija između "genetskih blokova" odgovornih za pojedinačne metaboličke korake i specifičnih enzimskih poremećaja. Ovaj pristup je brzo evoluirao u alat za istraživače da otkriju metaboličke puteve.

Hipoteza "jedan gen - jedan enzim" dobila je snažnu eksperimentalnu potvrdu. Kao što je pokazao rad narednih decenija, pokazao se iznenađujuće plodonosnim. Analiza defektnih enzima i njihovih normalnih varijanti ubrzo je omogućila identifikaciju klase genetskih poremećaja koji su doveli do promjene u funkciji enzima, iako je sam protein još uvijek bio detektabilan i zadržao imunološka svojstva. U drugim slučajevima, temperaturni optimum aktivnosti enzima se mijenja. Neke varijante mogu se objasniti mutacijom koja utječe na cjelokupni regulatorni mehanizam i, kao rezultat, mijenja aktivnost čitave grupe enzima. Takve studije dovele su do stvaranja koncepta regulacije genske aktivnosti u bakterijama, koji je uključivao koncept operona.

10 4. Djelovanje gena

Prvi primjeri enzimskih poremećaja kod ljudi. Prva ljudska nasljedna bolest za koju se mogao pokazati enzimski poremećaj bila je methemoglobinemija sa recesivnim načinom nasljeđivanja (Gibson i Harrison, 1947; Gibson, 1948) (25080). U ovom slučaju, oštećeni enzim je NADH - zavisna methemoglobin reduktaza. Prvi pokušaj sistematskog proučavanja grupe ljudskih bolesti povezanih sa metaboličkim defektima učinjen je 1951. godine. U studiji o bolesti skladištenja glikogena, Corys je pokazao da je u osam od deset slučajeva patološkog stanja koje je dijagnosticirano kao Gierkeova bolest (23220), struktura glikogena u jetri bila normalna varijanta, au dva slučaja jasno je poremećena. . Također je bilo evidentno da se glikogen u jetri, akumulirajući u višku, ne može direktno pretvoriti u šećer, budući da su pacijenti skloni hipoglikemiji. Mnogi enzimi su potrebni za razgradnju glikogena u glukozu u jetri. Dvije od njih, amil-1,6-glukozidaza i glukoza-6-fosfataza, odabrane su za proučavanje kao mogući defektni elementi enzimskog sistema. Oslobađanje fosfata iz glukoza-6fosfata je mjereno u homogenatima jetre pri različitim pH vrijednostima. Rezultati su prikazani na sl. 4.2. U normalnoj jetri je utvrđena visoka aktivnost sa optimumom na pH 6-7. Teška disfunkcija jetre kod ciroze povezana je s blagim smanjenjem aktivnosti. S druge strane, u slučaju Gierkeove bolesti sa smrtnim ishodom, aktivnost enzima uopće nije mogla biti otkrivena; isti rezultat je dobijen i pri pregledu drugog sličnog pacijenta. Kod dva bolesnika s manje izraženim simptomima došlo je do značajnog smanjenja aktivnosti.

Zaključeno je da je u ovim slučajevima Gierkeove bolesti sa smrtnim ishodom došlo do defekta glukoza-6-fosfataze. Međutim, u većini blažih slučajeva aktivnost ovog enzima nije bila niža nego kod ciroze jetre, a samo kod dva bolesnika bila je nešto niža (slika 4.2).

Prema supružnicima Corey, abnormalna akumulacija glikogena u mišićnom tkivu ne može biti povezana s nedostatkom glukoza-6-fosfataze, jer ovaj enzim nema u mišićima i normalan je. Kao moguće objašnjenje mišićne glikogenoze sugerirali su kršenje aktivnosti amilo-1,6-glukozidaze. Ovo predviđanje je ubrzo potvrđeno: Forbes je otkrio takav defekt u jednom od klinički značajnih slučajeva bolesti skladištenja glikogena koja uključuje srce i skeletne mišiće. Sada mi

4. Djelovanje gena 11

veliki broj enzimskih defekata je poznat u bolesti skladištenja glikogena.

Iako se različiti oblici ove bolesti donekle razlikuju po stepenu manifestacije, postoji mnogo zajedničkog među njima klinički. Uz jedan izuzetak, svi se nasljeđuju na autosomno recesivni način. Da enzimski defekti nisu otkriveni, patologija akumulacije glikogena bi se smatrala jednom bolešću s karakterističnim intrafamilijarnim korelacijama u težini, detaljima simptoma i vremenu smrti. Dakle, imamo primjer gdje je genetska heterogenost, koja se mogla pretpostaviti samo na osnovu proučavanja fenotipa (odjeljak 3.3.5), potvrđena analizom na biohemijskom nivou: proučavanje enzimske aktivnosti omogućilo je identifikaciju specifični geni.

U narednim godinama, tempo istraživanja enzimskih defekata se povećao, a za 588 identificiranih recesivnih autosomnih gena koje McKusick opisuje u šestom izdanju svoje knjige Mendelijsko nasljeđivanje kod čovjeka (1983), otkriveno je više od 170 slučajeva sa specifičnim enzimskim poremećajima. . Naš napredak u ovoj oblasti direktno je vezan za razvoj koncepata i metoda molekularne genetike.

Neke faze proučavanja enzimskih poremećaja kod ljudi. Predstavljamo samo najvažnije prekretnice u ovom tekućem procesu: 1934. Völling je otkrio fenilketonuriju

1941. Beadle i Tatum formulirali hipotezu jedan gen-jedan enzim 1948. Gibson je opisao prvi slučaj enzimskog poremećaja u ljudskoj bolesti (recesivna methemoglobinemija)

1952. Cory je otkrio nedostatak glukoze-6-fosfataze u Gierkeovoj bolesti

1953. Jervis je pokazao odsustvo fenilalanin hidroksilaze u fenilketonuriji. Bickel je izvijestio o prvom pokušaju ublažavanja enzimskog poremećaja usvajanjem dijete sa malo fenilalanina.

1955. Smithies je razvio tehniku ​​elektroforeze u skrobnom gelu

1956. Carson i ostali otkrili su defekt glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (G6PD) u slučaju inducirane hemolitičke anemije

1957. Kalkar i saradnici opisali su enzimski nedostatak u galaktozemiji, pokazujući da ljudi i bakterije imaju identičan enzimski poremećaj

1961. Krut i Weinberg demonstrirali su defekt enzima u galaktozemiji in vitro u kultivisanim fibroblastima

1967. Sigmiller i ostali otkrili su defekt hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaze (HPRT) u Lesch-Nyhan sindromu

1968. Cleaver je opisao kršenje ekscizionog popravka kod pigmentne kseroderme

1970. Neufeld je identifikovao enzimske defekte u mukopolisaharidozama, što je omogućilo da se identifikuju putevi za razgradnju mukopolisaharida

1974. Brown i Goldstein su dokazali da je genetski određena prekomjerna proizvodnja hidroksimetilglutaril-CoA reduktaze u porodičnoj hiperholesterolemiji posljedica defekta u membrani lociranog lipoproteinskog receptora niske gustine, koji modulira aktivnost ovog enzima (HMG)

1977 Sly i saradnici su pokazali da fibroblast receptori prepoznaju manoza-6-fosfat (kao komponentu lizozomalnih enzima). Genetski defekt u procesuiranju sprečava vezivanje lizosomskih enzima, što dovodi do poremećenog oslobađanja u citoplazmu i naknadnog izlučivanja u plazmu (bolest I-ćelija)

12 4. Djelovanje gena

1980. Kod pseudohipoparatireoze otkriven je defekt proteina koji omogućava spajanje receptora i ciklaze.