Mikotoksinlarni aniqlash usullari. Mikotoksikozlarni aniqlashning laboratoriya usullari. Mikotoksinlar va ularni aniqlash usullari

Kuchukchalar tug'ilgandan so'ng, kaltak va uning egalari uchun mas'uliyatli davr boshlanadi, bunda nafaqat kaltakning ovqatlanishi va sog'lig'i, balki yangi tug'ilgan chaqaloqlar haqida ham g'amxo'rlik qilish kerak. Kuchukchalar tug'ilgandan so'ng, birinchi bir yoki ikki kun ichida kaltakning ishtahasi yomon, ovqat hazm qilish buzilishi bo'lishi mumkin, ayniqsa u tug'ilgandan keyin ko'p ovqatlansa.

Esingizda bo'lsin, bu davrda siz antibiotiklarga murojaat qilmasligingiz kerak - bu chaqaloqlarning sog'lig'iga salbiy ta'sir qiladi. Xavfsizroq dorilar (masalan, o'tlar, probiyotiklar, oshqozonni yuvish, faollashtirilgan ko'mir va yaxshisi lignitin) bilan yashashga harakat qiling. Bu holatda juda yaxshi natijalar Heeldan mutlaqo zararsiz gomeopatik preparatlardan foydalanish orqali olinadi va veterinariyani izlashning hojati yo'q, "odam" dan yomonroq ishlaydi. Echinacea compositum, Nux vomica, Berebe-ris-hommacordning bir yoki ikkita teri osti in'ektsiyasini sinab ko'ring. Yaxshi natijalar preparatni xuddi shu Diar-heel kompaniyasining planshetlarida qo'llash orqali erishiladi. Preparat kuniga 3 marta, 1 tabletkadan beriladi. Agar u 1,5 osh qoshiq qaynatilgan suvda oldindan eritilib, yaxshilab aralashtirilsa, natijalar yaxshi bo'ladi.

Tug'ilgandan keyingi dastlabki uch kun ichida mumkin bo'lgan buzilishlarni kuchaytirmaslik uchun ovqatlanishda ehtiyot bo'lish kerak. Xorijiy mualliflar bu davrda kaltakga qaynatilgan mayda tovuqlarni berishni taklif qilishadi, suyaklar bilan birga maydalangan va qaynatilgan guruch bilan aralashtiriladi.

Tug'ilgandan keyingi birinchi kunlardan so'ng, kaltak ishtahani sezilarli darajada yaxshilaydi va bu juda tabiiy - uning tanasining ehtiyojlari sezilarli darajada oshadi. Og'iz suti birinchi navbatda faol ishlab chiqarila boshlaydi, keyin esa sut. Ko'p jihatdan sutning miqdori va sifati nafaqat kaltakning individual xususiyatlariga, balki uni oziqlantirishga ham bog'liq.

Birinchi haftada ozuqa miqdori odatdagi dietadan 1,5 baravar oshadi. Ammo bu davrda eklampsiyaga olib kelmaslik uchun kaltakga juda ko'p go'sht berilmasligi kerak. Bu vaqtda protein komponenti sifatida siz baliq yoki tvorogni berishingiz mumkin. Kaltakni tez-tez (har 4-5 soatda), kichik qismlarda boqish kerak. Oshqozonning normal faoliyati tiklangandan so'ng, mineral qo'shimchalar va palto mustahkamlash vositalarini berishni davom ettirish kerak.

• go'sht, baliq va sut mahsulotlari - 45%,
• don - 30%,
• sut va sut mahsulotlari - 10%,
• sabzavotlar - 15%.

Emizuvchi kaltakning suti ko'proq bo'lishi uchun u o'z dietasiga laktatsiyani rag'batlantiradigan ovqatlarni kiritishi kerak: xom sabzi, go'sht, baliq, bulon, jo'xori uni va boshqalar. Iloji boricha tez-tez kaltakni ichishni taklif qiling: sut (agar u bo'lsa). buzilishlarga olib kelmaydi), sutli choy, sutli zaif qahva. Sut miqdorini oshirish vositasi sifatida siz quyidagilarni sinab ko'rishingiz mumkin:

• oregano qaynatmasi;
• limon balzamining qaynatmasi: bir choy qoshiq o'tni ikki stakan qaynoq suv bilan to'kib tashlang, qaynatib oling, shakar qo'shing;
• ikki choy qoshiq choyni termosga soling, ikki stakan qaynoq sut quying, uni 3-4 soat qaynatib oling, keyin shakar qo'shing va salqin;
• anis qaynatmasi.

Ko'pgina egalar laktatsiyani ko'paytirish uchun kaltaklarga beradigan Apilak, mening amaliyotimda kerakli natijalarni bermadi, garchi men uni turli kaltaklarga berishga harakat qildim.

Agar it ichishdan qat'iyan bosh tortsa, siz, albatta, uni ichishga majbur qilishingiz mumkin, lekin avval uni juda iliq ichimlikka ozgina sariyog 'qo'yib, "aldashga" harakat qilish yaxshiroqdir. Sariyog'ning hidi uni yo'ldan ozdirishi mumkin.

Kaltakning charchashiga yo'l qo'ymaslik uchun bu davrda uning ovqatlanishi to'liq bo'lishi kerak va oziq-ovqat tarkibida etarli miqdorda kaloriya, oqsillar, vitaminlar va minerallar bo'lishi kerak.

Biroq, butun laktatsiya davrida oziq-ovqat miqdori doimiy emas. Yuqorida aytib o'tilganidek, birinchi haftada dietani 1,5 baravar oshirish kerak. Kaltakdagi sut miqdori ortishi bilan ratsion ham ko'payishi kerak: ikkinchi haftada ratsion ikki baravar ko'paytirilishi kerak, uchinchi haftadan boshlab laktatsiya tugaguniga qadar esa uch baravar ko'paytirilishi kerak: Taqqoslash ratsion bilan amalga oshiriladi. normal holatidagi it. Kaltak uchun zarur bo'lgan oziq-ovqat miqdori uning axlatining hajmiga bog'liq. Axlatdagi to'rt kuchukcha dietani 2 barobar, sakkizta kuchukcha esa kamida uch barobar ko'paytirishni talab qiladi.

Odatda kaltak kuchukchalarni 4-6 hafta davomida oziqlantiradi. Kaltak tomonidan ishlab chiqarilgan sut miqdori laktatsiya davrida doimiy emas. 20-25 kungacha sut miqdori ortadi, keyin esa kamayadi. G'arb mutaxassislari ushbu davrda ozuqaning kaloriya miqdorini hisoblashning juda oson usulini taklif qilishadi. Bu usul 3-4 kunligida butun axlatni tortish, har bir kilogramm kuchukcha uchun kaltakning ratsioniga 250 kaloriya qo'shimcha energiya qo'shish va shunga muvofiq oziq-ovqat miqdori va kaloriya miqdorini oshirishdan iborat.

Laktatsiyaning davomiyligi itning individual xususiyatlariga va ovqatlanishiga bog'liq. Har bir holatda, albatta, itning individual xususiyatlarini hisobga olish kerak. Shunday kaltaklar borki, kuchukchalar tom ma'noda "so'rib oladilar", ular uzoq vaqt, ko'p miqdorda sut ishlab chiqaradilar va kuchukchalarni ikki oygacha boqadilar. Tabiiyki, ularning dietasi laktatsiya davrining 14-17-kuniga to'g'ri keladigan "sut ishlab chiqarish cho'qqisida" ham suti kam bo'lgan kaltaklarnikidan ko'ra kattaroq va to'liqroq bo'lishi kerak va egasi shunchaki ovqatlantirishni orzu qiladi. uch haftagacha bo'lgan bolalar. Katta darajada kaltak suti ishlab chiqarishga muhim aminokislotalarga boy to'liq proteinli diet ta'sir qiladi. Aminokislotalarning etishmasligi, birinchi navbatda, sut sifatiga, shuningdek uning miqdoriga ta'sir qiladi va bu kuchukchalarning o'sish sur'atining pasayishiga olib keladi va ularning rivojlanishini sekinlashtiradi.

Vitaminlar emizuvchi kaltaklarning ovqatlanishida ham muhim rol o'ynaydi. Ular nafaqat kaltaklarning o'zlari, balki kuchukchalarning rivojlanishi uchun ham kerak. Butun laktatsiya davrida kaltakning kerakli miqdordagi vitaminlarni olishini ta'minlash kerak. Masalan, kuchukchalarning o'sishi uchun juda zarur bo'lgan sutdagi A vitaminining miqdori faqat onaning ozuqasida mavjudligiga bog'liq*. Shuning uchun egasi emizikli kaltakning ratsionida ushbu vitaminning doimiy mavjudligini kuzatishi kerak. Bu, shuningdek, it suti orqali ko'p miqdorda chiqariladigan D va B vitaminlari uchun ham amal qiladi.

Kaltak sut ishlab chiqarish uchun chiqarilgan sut tarkibidagi kabi qo'shimcha energiya talab qiladi. Shuning uchun dietaning energiya qiymati birinchi navbatda kaltakning suti bilan ta'minlanishiga bog'liq bo'ladi. Oziq-ovqatning kaloriya tarkibi ham laktatsiya davriga bog'liq. Ma'lumki, laktatsiyaning birinchi va ikkinchi haftalarida kaltak uchinchi va to'rtinchi haftalarga qaraganda kamroq sut ishlab chiqaradi. Shuning uchun dietani shunday tuzish kerakki, laktatsiya davrining birinchi yarmida ozuqaning energiya intensivligi 2 barobar, ikkinchisida - kaltakning normal holatdagi ehtiyojiga nisbatan 3 baravar ko'payadi. Amalda, bu shunday ko'rinadi: laktatsiya davrining birinchi yarmida sut hosil bo'lishi uchun tana vazni 10 kg bo'lgan emizikli kaltak asosiyga qo'shimcha ravishda 750 kkal kaloriya miqdori bo'lgan qo'shimcha dietaga muhtoj. keyingi ikki hafta - kuniga 1500 kkal.

Tug'ilgandan so'ng darhol ayol sut bezlari og'iz sutini chiqaradi. Har bir yangi tug'ilgan kuchukcha o'ziga xos antikorlarni o'z ichiga olgan og'iz sutini olishini ta'minlash kerak.

Sut hosil bo'lishi uchun minerallar katta ahamiyatga ega, ularning etishmasligi nafaqat emizikli kaltaklarda, balki nasllarda ham turli xil osteodistrofik kasalliklarni keltirib chiqaradi. Shu bilan birga, emizikli urg'ochilarning umurtqa pog'onasi minerallar bilan tugaydi va g'ovakli, mo'rt bo'lib qoladi, yangi tug'ilgan kuchuklarda osteoporoz va raxit paydo bo'ladi. Homiladorlik davrida, yosh kaltaklarda esa - o'sish va birinchi laktatsiyaga tayyorgarlik davrida mineral zaxiralarning to'planishiga yo'l qo'ymaslik muhimdir. Emizuvchi kaltaklar emizmaydigan kaltaklarga qaraganda ko'proq tuzga muhtoj.

Laktatsiya davrining birinchi-ikkinchi va uchinchi-to'rtinchi haftalarida vazni 5 kg bo'lgan emizikli kaltaklar dietasining sifatli tarkibi va kunlik energiya intensivligi.

Laktatsiya davrining birinchi-ikkinchi va uchinchi-to'rtinchi haftalarida vazni 15 kg bo'lgan emizikli kaltaklar dietasining sifatli tarkibi va kunlik energiya intensivligi.

Laktatsiya davrining birinchi-ikkinchi va uchinchi-to'rtinchi haftalarida vazni 25 kg bo'lgan emizikli kaltaklar ratsionining sifatli tarkibi va kunlik energiya intensivligi.

Mikotoksinlarni aniqlash usullari

Oziq-ovqat va ozuqa tarkibidagi mikotoksinlarni aniqlash va aniqlashning zamonaviy usullariga skrining usullari, miqdoriy, analitik va biologik usullar kiradi. Mikotoksin metodologiyasi juda tez rivojlanmoqda. Ishlab chiqilgan usullar va turli xil modifikatsiyalar soni allaqachon bir necha yuzga yetdi va o'sishda davom etmoqda.

Tahlilning soddaligi va tezligi bilan ajralib turadigan skrining usullari ifloslanmagan namunalarni tez va ishonchli tarzda "ekrandan o'tkazish" imkonini beradi. Bularga aflatoksinlar, okratoksin A va zearalenon uchun mini-ustun tahlili kabi tez-tez ishlatiladigan usullar kiradi; 30 tagacha turli mikotoksinlarni bir vaqtda aniqlash uchun TLC usullari; aflatoksinlar bilan ifloslanishni aniqlashning floresan usuli va boshqalar.

Mikotoksinlarni aniqlashning miqdoriy analitik usullarini kimyoviy, radioimmunokimyoviy va ferment immunoassayga bo'lish mumkin. Kimyoviy usullar hozirda eng keng tarqalgan bo'lib, mikotoksinlarni ajratish va to'g'ri miqdorini aniqlashning ketma-ket bosqichlarini o'z ichiga oladi. Izolyatsiya bosqichi ikki bosqichdan iborat: ekstraktsiya - mikotoksinni substratdan ajratish va tozalash - mikotoksinni o'xshash fizik va kimyoviy xususiyatlarga ega birikmalardan ajratish. Mikotoksinlarni yakuniy ajratish bir yoki ikki o'lchovli yupqa qatlamli xromatografiya (TLC) yordamida turli xil erituvchi tizimlarda silikagel plitalari, gaz va gaz-suyuqlik xromatografiyasi, yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi yordamida amalga oshiriladi. Mikotoksinlarni miqdoriy aniqlash odatda ultrabinafsha nurda TLCda flüoresans intensivligini vizual va densimetrik ravishda ma'lum konsentratsiya standartlari bilan to'g'ridan-to'g'ri taqqoslash yo'li bilan amalga oshiriladi. Usullarning ishonchliligini oshirish uchun boshqa xromatografik, kolorimetrik yoki florimetrik xususiyatlarga ega mikotoksin hosilalarini tayyorlashga asoslangan turli tasdiqlovchi testlar qo'llaniladi.

So'nggi yillarda mikotoksinlarni aniqlash, identifikatsiya qilish va miqdorini aniqlash uchun o'ta sezgir va yuqori o'ziga xos radioimmunokimyoviy va ferment immunoassay usullarini ishlab chiqishga e'tibor kuchayganligi bilan ajralib turadi. Bu usullar sigir zardobi albumini bilan mikotoksin konjugantlariga antiserum olishga asoslangan. Ularning afzalligi - mikotoksinlarning pikogrammalarini aniqlash va aniqlash jarayonini avtomatlashtirish yo'nalishi bo'yicha ishlanmalarni amalga oshirish imkonini beradigan juda sezgir. Odatda unchalik o'ziga xos va sezgir bo'lmagan biologik usullar, asosan, kimyoviy tahlil usullari mavjud bo'lmagan mikotoksinlarni aniqlash uchun yoki tasdiqlovchi testlar sifatida qo'llaniladi. Har xil mikroorganizmlar, tovuq embrionlari, ko'plab laboratoriya hayvonlari, hujayra va to'qimalar kulturalari sinov ob'ekti bo'lib xizmat qiladi.

Oziq-ovqat mahsulotlari tarkibidagi mikotoksinlar miqdorini aniqlash uchun namuna tayyorlash "Diapak" kontsentratsion patronlarida qattiq fazali ekstraktsiya usuli bilan amalga oshiriladi (3.2.3-bet). Tayyorlangan namunalardagi mikotoksinlarni ajratish, identifikatsiya qilish va miqdoriy aniqlash modulli konstruksiyadagi Milixrom-5 seriyali mikrokolonkali xromatografda yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi yordamida amalga oshiriladi (12-rasm).

Guruch. 12. Mikrokolonkali xromatograf

Maqolada patulinni aniqlash uchun HPLC ning teskari fazali versiyasi ko'rib chiqiladi. Aniqlash 276 nm to'lqin uzunligida amalga oshiriladi. Patulinni aniq identifikatsiyalash uchun ko'p to'lqin uzunligini aniqlash ham qo'llaniladi, bu esa qo'shimcha identifikatsiya parametri sifatida spektral nisbatlardan foydalanishga imkon beradi. Ajratish gradient elyusiya rejimida amalga oshiriladi, bu tahlilning aniqligi va sezgirligini oshiradi.

Guruch. 13. Suyuq xromatograf:

1 - nasos; 2 – namuna quyish moslamasi; 3 – xromatografik ustun; 4 - detektor;
5 - elyuat uchun drenaj yoki fraktsiyalar uchun kollektor; 6 - ro'yxatga oluvchi (magnitafon,
integrator yoki shaxsiy kompyuter)

6
4

Suyuq xromatograf yordamida namunalarni tahlil qilish (13-rasm) quyidagicha amalga oshiriladi. Tahlil qilinayotgan namuna eritmasining ma'lum hajmi xromatografik ustunning (3) yuqori qismiga namuna in'ektsiya moslamasi (2) yordamida kiritiladi. Nasos (1) yordamida tahlil qilinayotgan aralashma xromatografik kolonka (3) orqali elyuent bilan pompalanadi, unda tahlil qilinayotgan aralashma alohida fraksiyalarga (komponentlarga) ajratiladi. Ajratilgan komponentlarni o'z ichiga olgan ustundan oqadigan elyuat detektor (4) tomonidan tahlil qilinadi, uning ko'rsatkichlari magnitafon (6) tomonidan qayd etiladi.

1. 
   HPLC ning metodologik asoslari

Patulinni aniqlashda qo'llaniladigan HPLC usulining mohiyatini tushunish uchun uning asosidagi ba'zi uslubiy jihatlarni o'rganish kerak.

Eluotropik qator. Eluentning elutivlik kuchi - bu eluentning (erituvchi yoki erituvchilar aralashmasi) adsorbatni adsorbent yuzasidan siqib chiqarish qobiliyati. Bunda sorbentning faol joylarida eluent molekulalari qanchalik kuchli adsorbsiyalangan bo'lsa, uning elutsiya kuchi shunchalik yuqori bo'ladi. Elutatsiya kuchini oshirishda bir qatorda joylashgan erituvchilar eluotropik qator hosil qiladi.

Teskari fazali xromatografiya uchun elimentlar sifatida tarkibida suv va elutsiya kuchini o'zgartiruvchi organik birikmalar bo'lgan erituvchi aralashmalar - n-spirtlar, asetonitril, tetrahidrofuran va suv bilan haqiqiy eritmalar hosil qiluvchi boshqalar ishlatiladi. Oddiy fazali xromatografiyada eluent sifatida qutbli modifikatorlar - chiziqli va siklik uglevodorodlar (geksan, siklogeksan, geptan va boshqalar) ishlatiladi.

Suyuq xromatograflar uchun detektorlar. Hozirgi vaqtda 20 dan ortiq HPLC detektorlari ishlab chiqilgan. Beshtasi eng ko'p qo'llaniladi, ulardan uchtasi optik va ikkitasi elektrokimyoviydir. Ushbu beshta detektor organik va noorganik moddalarning barcha sinflarini tahlil qilish imkonini beradi.

Optik detektorlarga to'lqin uzunligi diapazonida ishlaydigan spektrofotometrik detektor (ultrabinafsha (UV)) kiradi.
200-360 nm va 360-780 nm to'lqin uzunligi diapazoni bilan ko'rinadigan), florimetrik va sinishi indekslari detektorlari; elektrokimyoviy - voltametrik va konduktometrik detektorlarga. Noyob axborot tarkibiga ega bo'lgan massa spektrometrik detektori alohida ahamiyatga ega, chunki u moddalarning massa spektrlari ma'lumotlar bazalaridan foydalangan holda xromatografik jihatdan ajratilgan komponentlarni aniqlash imkonini beradi.

Spektrofotometrik detektor eng keng tarqalgan HPLC detektori. Uning ishlash printsipi taniqli Bouger-Lambert-Beer yorug'lik yutilish qonuniga asoslanadi. Spektrofotometrik detektor nurlanishning moddaning selektiv yutilish spektrlarini qayd qiladi. Yutish spektrlari o'rganilayotgan moddaning tuzilishiga bog'liq. Bu sizga spektrlar yoki standartlar kutubxonasiga ega bo'lgan moddani spektri bo'yicha aniqlash imkonini beradi. Buger-Lambert-Beer qonuniga ko'ra, spektral chiziqlar intensivligi miqdoriy tahlil uchun asos bo'lgan moddaning konsentratsiyasiga, ya'ni moddaning konsentratsiyasini aniqlashga bog'liq.

Intensivlik manbasidan monoxromatik yorug'lik bo'lsin I 0 uzunlikdagi ariqga tushadi l (optik yo'l). Kyuvetka konsentratsiyali moddaning eritmasi bilan to'ldiriladi Bilan. Modda monoxromatik nurlanishni yutishga qodir. Berilgan monoxromatik nurlanishni yutish qobiliyatining o'lchovi qiymatdir ε molyar yutilish koeffitsienti yoki so'nish koeffitsienti. Kuvetdan kuchsizlangan yorug'lik nuri intensivlik bilan chiqadi I. To'lqin uzunligida yorug'likning yutilish qonuniga ko'ra λ= const

I= I 0 ∙10 -ε Cl , (7)

qayerda I kyuvetadan o'tgandan keyin yorug'lik oqimining intensivligi;
I 0 - tushayotgan yorug'lik oqimining intensivligi; ε - so'nish koeffitsienti; Bilan kyuvetada moddaning molyar konsentratsiyasi; l kyuvetaning uzunligi.

Munosabat I uchun I 0 , foiz sifatida ifodalangan, uzatish deyiladi T, va qiymati A=lg(I 0 / I) - optik zichlik.

A=lg(I 0 /I)= e S∙l. (8)

Moddaning optik zichligi analitning konsentratsiyasiga to'g'ridan-to'g'ri proportsionaldir. Spektrofotometrik detektorlarda analitik miqdor optik zichlik hisoblanadi LEKIN. Formula (8) spektrofotometrik detektordan foydalanganda miqdoriy tahlil uchun asos bo'lib xizmat qiladi, chunki optik zichlik LEKIN modda xromatografik cho'qqining balandligi yoki maydoniga to'g'ridan-to'g'ri proportsionaldir.

Optik zichlikka bog'liqlik LEKIN to'lqin uzunligi diapazoni 190 dan 360 nm gacha bo'lgan modda bilan kyuvetaga tushayotgan yorug'lik to'lqin uzunligidan ultrabinafsha yutilish spektri deyiladi (14-rasm).

200 230 260 290 320 350 λ , nm

LEKIN, f.r.p.
Guruch. 14. Suvli eritmaning ultrabinafsha yutilish spektri
moddalar X

3.2.3. Namuna tayyorlash

Har qanday modda maksimal yutilish to'lqin uzunligiga ega
(λ , nm). Ushbu to'lqin uzunligidan foydalanganda detektor moddani aniqlash uchun eng past chegaraga ega.

Spektrofotometrik detektor (SPD) yordamida ultrabinafsha nurni o'zlashtiradigan turli sinflardagi ko'p miqdordagi moddalar aniqlanadi.

Xromatografiyada spektrofotometrik detektordan foydalanish identifikatsiyani sezilarli darajada osonlashtiradi. Ko'p to'lqin uzunlikdagi detektor dasturiy ta'minot bilan birgalikda bir vaqtning o'zida bir nechta to'lqin uzunliklarida xromatogramma olish va komponentlarni aniqlash uchun qo'shimcha parametrni hisoblash imkonini beradi - spektralmunosabat (Q) - turli to'lqin uzunliklarida xromatografik cho'qqi balandliklarining nisbati

qayerda LEKIN 1 va LEKIN 2 - 1 va 2 to'lqin uzunliklarida optik zichlik koeffitsientlari. Qiymati Q har bir modda uchun doimiy xarakterlidir va uning konsentratsiyasiga bog'liq emas. Spektral nisbatlarning aniqligi moddaning optik zichligi qiymatlariga va detektorning dizayniga bog'liq.

Konsentratsiyali patronlarda qattiq fazali ekstraksiya usuli yordamida namuna tayyorlash vaqt va mehnat xarajatlarini tejaydi. Qattiq fazali ekstraktsiya namunani konsentratsiyalash va uni qo'shimcha aralashmalardan tozalash imkonini beradi. Qattiq fazali ekstraktsiyaning murakkab sxemasi ikkita patrondan ketma-ket foydalanishni ta'minlaydi:

– “DIAPAK P-Z” universal kontsentratsion kartrij – yuqori va pastki filtrlar to‘plamiga ega (10 dona) qayta ishlatiladigan patron (50 ta namunagacha);

– nozik tozalash uchun universal kartrij “DIAPAK S” – bir martalik ishlatiladigan kartrij.

Uchun kontsentratsion patronlarni tayyorlash quyidagi amallarni bajarishingiz kerak.

Uchun "DIAPAK P-Z" kontsentratsion patronini tayyorlash:

- 10 ml suv-asetonitril aralashmasini (58:42) kartrijdan o'tkazing;

– namunani tayyorlashdan oldin darhol kartrij orqali 10 ml distillangan suvni pompalang.

Uchun kontsentratsion patronni tayyorlash "DIAPAK S":

- kartrij orqali 5 ml benzolni soling va kartrijni ikkala uchiga tiqing.

Oziq-ovqat mahsulotini konsentratsiyaga tayyorlash

Og'irligi 10,0 g bo'lgan namunani shisha stakanga soling, oz miqdorda distillangan suv bilan aralashtiriladi va miqdori 50 ml o'lchov kolbasiga o'tkaziladi. Kolbaga 6,0 ml Karrez I eritmasidan va Karrez II eritmasidan soling. Kolba tarkibini distillangan suv bilan belgigacha olib keling, yaxshilab aralashtiramiz va qog'oz plyonkali filtr orqali gradusli silindrga filtrlang. Shaffof filtrat P hajmini o'lchang.

Aniqlangan sharbatlar va ichimliklar tayyorlashda namunani zich qog'oz filtri orqali 20 ml tiniq filtrat P olinmaguncha filtrlang.

"DIAPAK P-Z" kartridjida namunaning konsentratsiyasi

Filtrlangan P ning butun hajmini sekundiga 1-2 tomchi tezlikda oldindan tayyorlangan kartrijga qo'llang.

Kartrijni 5 ml bidistillangan suv bilan yuvib tashlang, barcha yuvish vositalarini tashlang.

10 ml etil asetat kartridjidan patulinni 5 ml solingan kolba yoki tiqinli o'lchovli trubkaga soling.
1,5% suvli natriy karbonat eritmasi, tiqin, kuchli aralashtiriladi va eksfoliatsiyaga ruxsat beriladi.

Filtr korpusini taxminan 2 g suvsiz natriy sulfat bilan to'ldirish orqali quritish ustunini yig'ing, kolonna devoriga tegib quritish vositasini siqib oling va paxta sumkasi bilan mahkamlang.

Pipetka bilan yuqori etil asetat qatlamini dekanatsiya qiling, quritish kolonkasi orqali filtrlang, filtratni 50 ml yurak shaklidagi kolbaga to'plang; qo'shimcha ravishda natriy karbonatning suvli eritmasini avval 10 ml, so'ngra 5 ml etil asetat bilan ajratib oling va ajratilgandan so'ng, quritilgan kolonka orqali etil asetatning tushirilgan hajmlarini bir xil kolbaga ketma-ket filtrlang.

Etil asetatni vakuumda 40°C dan yuqori boʻlmagan haroratda taxminan 0,5 ml hajmgacha bugʻlang (quriguncha bugʻlantirmang!), 2,5 ml benzol qoʻshing (hajm nisbati 1:5 ga rioya qiling).

"DIAPAK S" kartrijidagi namunani tozalash

Tayyorlangan kartridjdan qopqoqlarni olib tashlang va benzol-etil asetat namunasi eritmasini soniyasiga 1-2 tomchi tezlikda o'tkazing. Kolbani yana 0,5-1,0 ml benzol-etil asetat (85:15) bilan yuving va yuvilgan narsalarni tashlab, kartrijga surting.

6 ml hajmdagi patulinni benzol: etil asetat (7:3) bilan tozalang, elyuatni yadroli kolbaga to'plang.

Eluatni quruq havo hammomida 40 ° C dan yuqori bo'lmagan haroratda quriting.

Darhol! Bug'langandan so'ng, namunani 0,2-0,25 ml elyuent A (3.2.4.2-bo'lim), 5-8 ° C gacha sovutilgan holda qayta eritib yuboring.

3.2.4. Ish tartibi

Ishning maqsadi– oziq-ovqat mahsulotlari tarkibidagi mikotoksin patulin miqdorini Milichrome-5 seriyali mikrokolonkali xromatografda yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi yordamida aniqlash.

3.2.4.1. O'lchash texnikasi

O'lchovlar quyidagi asosiy bosqichlarni o'z ichiga oladi:

- patulinning massa kontsentratsiyasi ma'lum bo'lgan eritmalar bo'yicha xromatografni kalibrlash;

- paragraflarga muvofiq qattiq fazali ekstraksiya usuli bilan oziq-ovqat namunasini tayyorlash. 3.2.3;

– ultrabinafsha nurlanish detektori orqali signalni ro'yxatga olish bilan HPLC tomonidan ekstrakt tahlili;

- tutilish parametrlari va spektral nisbatlar bo'yicha patulinni aniqlash;

– ro‘yxatga olingan analitik signal (cho‘qqi balandligi) va kalibrlash grafigi asosida namunadagi patulinning massa kontsentratsiyasini hisoblash;

- oziq-ovqat mahsuloti tarkibidagi patulinning massa ulushini hisoblash.

Asboblar, reagentlar va materiallar, ishni bajarish uchun kerak:

– Milichrome-5 seriyali xromatograf yoki WinXrom yoki Multichrome dasturlari bilan boshqa har qanday HPLC xromatografi;

– HPLC xromatografik ustuni: Diasfer–110–S10SN (5 mkm, 2×80 mm, TU 4215–001–05451931–94);

– 1-100 µl uchun o‘zgaruvchan hajmli dispenser;

– 100–1000 µl uchun o‘zgaruvchan hajmli dispenser;

- sig‘imi 10 ml gacha bo‘lgan, mahkam maydalangan yupqa bo‘lakli konussimon kolba;

- membranali filtrlar;

- 1, 2, 5 va 10 mg/l konsentratsiyali patulinning standart eritmalari to'plami;

- fosfor kislotasi 85%;

– suyuqlik xromatografiyasi uchun asetonitril (maxsus soflik spetsifikatsiyasi TU 6–09–3513–86, UV nurlanishi 200 nm gacha);

– geksan, kimyoviy toza (rektifikatsiya qilingan);

- trifloroasetik kislota;

– Karrez I eritmasi – 15,0 g kaliy geksasiyanoferat II ni 100 ml suvda eritib yuboring.

- Karrez II eritmasi - 30,0 g rux asetat 100 ml suvda eritiladi;

- A, B va C eluentlari.

Eluentlarni tayyorlash

Eluent A. 20 ml atsetonitril va 0,5 ml 10% li triftorsirka kislota eritmasidan sig‘imi 100 ml bo‘lgan mahkam maydalangan shisha bo‘lakli o‘lchov kolbasiga solinadi. Eritma yaxshilab aralashtiriladi va oldindan neylon membranali filtr (0,2 mkm) orqali filtrlangan distillangan suv bilan belgiga keltiriladi. Keyin elyuent 1 kg∙s/sm 2 kam bo'lganida 1 minut davomida evakuatsiya qilish yo'li bilan gazsizlanadi.

Eluentlar B va C Eluent A bilan bir xil tarzda tayyorlangan, 100 ml eritma uchun atigi 10 va 0 ml asetonitril olinadi.

3.2.4.2. Xromatografik ajratish rejimlarini o'rnatish
va natijalarni ro'yxatga olish

O'lchovlarni amalga oshirish uchun xromatografning ish rejimlarini o'rnatish kerak.

Dispenser rejimlari:

- regeneratsiya - 300 µl;

- namuna hajmi - 5 µl;

– eluent sarfi – 150 mkl/min;

– gradient elutsiya rejimlari: 800 µl – eluent A,
500 µl - elyuent B, 300 µl - elyuent C;

- termostat harorati - 35 0 S.

Aniqlash rejimlari:

– to‘lqin uzunliklari soni – 3;

– to‘lqin uzunliklari – 250, 276, 290 nm;

– o‘lchash vaqti – 0,04 s.

Xromatografik tizimni konditsionerlash o'lchovlardan 30 minut oldin "bo'sh" tahlil o'tkazish yo'li bilan amalga oshiriladi, unda patulinni o'z ichiga olgan standart aralashma 5-10 µl eluent bilan almashtiriladi, so'ngra mikotoksinlarning standart aralashmasi ajratiladi.

1-mashq. Patulin tarkibini aniqlash uchun oziq-ovqat mahsulotlarini namuna tayyorlash usulini o'rganish. 3.2.3-bandga muvofiq namunalarni tayyorlang.

Vazifa 2. Xromatografni kalibrlash. Xromatograf patulinning 1, 2, 5 va 10 mg/l konsentratsiyali standart eritmalarini ketma-ket kiritish orqali kalibrlanadi.

O'qituvchi rahbarligida Xromatografik ajratish parametrlarini (3.2.4.3-band) kompyuter klaviaturasidan dasturga (WinXrom) kiritish va avtomatik rejimda 2-4 ta xromatografik tahlillarni boshlash taklif etiladi. Natijalar jadval shaklida taqdim etiladi. 6.

T a b l e 6

Olingan xromatografik profillar asosida kalibrlash grafigini tuzing (konsentratsiya ordinata o'qi bo'ylab - mg / l, abscissa o'qi bo'ylab mikotoksinning optik zichligi hisoblanadi). LEKIN– s.o.p.).

Vazifa 3. Oziq-ovqat mahsulotining sinov namunasida patulinni aniqlang va uning konsentratsiyasini aniqlang.

O'qituvchining rahbarligi ostida avtomatik rejimda tayyorlangan oziq-ovqat mahsuloti namunasini o'lchashni boshlang
(2-topshiriqda tanlangan xromatografik ajratish parametrlari bilan). O'lchovni tugatgandan so'ng, 2-topshiriqda olingan standart faylga ("StandardDD–MM–YY.001") ko'ra patulin mikotoksinini aniqlang. 2-topshiriqda o'rnatilgan kalibrlash grafigidan foydalanib, oziq-ovqat namunasidagi patulin konsentratsiyasini aniqlang.

Natijalarni jadvalga yozing. 7.

7-jadval

Oziq-ovqat namunasidagi patulinning massa kontsentratsiyasi formula bo'yicha hisoblanadi

qayerda Bilan– namunadagi patulinning massa kontsentratsiyasi, mg/l (analitik cho‘qqining balandligidan kelib chiqqan holda kalibrlash bog‘liqligi bo‘yicha hisoblanadi); V p namuna hajmi, ml; R - namunani tayyorlash bosqichida mikotoksinning ekstraktsiya darajasi (60% ga teng); M pr - tozalash va keyingi xromatografik aniqlash uchun ishlatiladigan oziq-ovqat mahsuloti namunasining massasi, g.

Aniqlanayotgan ob'ektdagi mikotoksinning massa ulushini o'lchash natijasi quyidagi shaklda keltirilgan: X±  mg/kg; da R\u003d 0,95 va protokolda qayd etilgan (1-ilova), bu erda X i , namunadagi patulinning massa kontsentratsiyasi, mg/kg; R- ehtimollik;  formula bo'yicha hisoblangan mutlaq xato chegarasi

Natijani olgandan so'ng, nazorat (tahlil) usullari uchun tegishli GOSTlarda berilgan yaqinlashuvni operativ nazorat qilish standartlari qiymatlarini baholash kerak.

O'rganilayotgan oziq-ovqat mahsulotidagi patulin tarkibining SanPiN 2.3.2.1078-01 tomonidan belgilangan ruxsat etilgan darajalarga muvofiqligi (yoki nomuvofiqligi) to'g'risida xulosa chiqaring.

O'z-o'zini nazorat qilish uchun savollar

1. Xromatografik tahlil usullarini tasniflashda qanday tamoyillar yotadi?

2. Xromatografik ajratishning mohiyati nimada? Sifatli identifikatsiya va miqdoriy tahlil qanday amalga oshiriladi?

3. Qanday oziq-ovqat mahsulotlarida mikotoksinlar mavjud? SanPiN talablariga muvofiq oziq-ovqat mahsulotlari tarkibida qanday mikotoksinlar aniqlanadi?

4. Oziq-ovqat mahsulotlarida mikotoksinlar miqdori qanday xromatografik usul bilan aniqlanadi?

5. Spektrofotometrik aniqlash nimaga asoslanadi? Spektral nisbatlar nima va ular nima uchun ishlatiladi?

6. HPLC yordamida patulin tarkibini aniqlash uchun oziq-ovqat namunalarini tayyorlash qanday amalga oshiriladi?

7. Patulinni aniqlash uchun HPLC usuliga qanday operatsiyalar kiradi?

8. Elyuent va gradientli elyusiya nima? HPLC yordamida patulinni aniqlashda qanday elyuentlardan foydalaniladi?

9. Patulin qanday aniqlanadi va miqdori aniqlanadi?

10. Patulinni HPLC aniqlashning aniqligi qanday ta'minlanadi?

Mikotoksinlarni aniqlash usullari

Oziq-ovqat va ozuqa tarkibidagi mikotoksinlarni aniqlash va aniqlashning zamonaviy usullariga skrining usullari, miqdoriy analitik va biologik usullar kiradi.

Skrining usullari ketma-ket tahlil qilish uchun tez va qulay, ifloslangan va ifloslanmagan namunalarni tez va ishonchli ajratish imkonini beradi. Skrining usullariga yupqa qatlamli xromatografiya (TLC usullari), aflatoksinlar bilan ifloslangan donni aniqlash uchun floresan usuli kiradi.

Mikotoksinlarni aniqlashning miqdoriy analitik usullari kimyoviy, radioimmunologik va ferment immunoassay usullari bilan ifodalanadi. Bugungi kunda eng keng tarqalgan kimyoviy usullar bo'lib, ular ikki bosqichni o'z ichiga oladi: izolyatsiya bosqichi va mikotoksinlarni miqdoriy aniqlash bosqichi. Izolyatsiya bosqichi ekstraktsiyani (mikotoksinni substratdan ajratish) va tozalashni (mikotoksinni bir xil fizik va kimyoviy xususiyatlarga ega birikmalardan ajratish) o'z ichiga oladi. Mikotoksinlarni yakuniy ajratish va miqdorini aniqlash turli xromatografik usullar yordamida amalga oshiriladi. Mikotoksinlarning barcha turlarini aniqlashning universal usuli bu yupqa qatlamli xromatografiya (TLC).

Mahsulot partiyasidan namuna olishda asosiy maqsad mikotoksin kontsentratsiyasi bo‘yicha butun partiyani ifodalovchi o‘rtacha yoki o‘rtacha namunani olishdan iborat (qabul qilingan namunalar butun partiyaning sifatini tavsiflashi kerak). Bu vazifaning bajarilishi mikotoksinlarning tabiati va tarqalishiga, mahsulotning xususiyatlariga (xom, qayta ishlangan, erkin oqadigan, suyuq, xamirsimon va boshqalar), namuna tayyorlash usuliga bog'liq. Masalan, yeryong'oqning aflatoksinlar bilan ifloslanishi aniq heterojen xususiyatga ega: alohida yeryong'oq donalarida ularning miqdori 1 kg uchun milligrammning mingdan bir qismidan o'nlab yoki undan ko'p milligrammgacha o'zgarishi mumkin, ya'ni 5-6 kattalik bilan farqlanadi. Shu sababli, yeryong'oqdagi aflatoksinlarni aniqlashda namuna olish xatosining umumiy tahlil xatosiga qo'shgan hissasi asosiy hisoblanadi va ba'zi hollarda 90% dan ortiq bo'lishi mumkin.

Mikotoksin bilan zaharlanishning bir xilligi nuqtai nazaridan barcha mahsulotlarni ikki guruhga bo‘lish mumkin: 1) turli xillik darajasi yuqori bo‘lgan mahsulotlar (qobiqli va qobig‘i yo‘q yeryong‘oq, moyli urug‘lar, butun yoki yirik donalar, yong‘oqlar); 2) ifloslanish tabiati bir xil bo'lgan mahsulotlar (suyuqliklar: sut, o'simlik moylari, sharbatlar, pyurelar; un, maydalangan ovqatlar).

L-guruh mahsulotlarining o'rtacha vakillik namunasini olish uchun dastlabki namunaning o'lchami imkon qadar katta bo'lishi kerak (kamida 2 kg), o'rtacha laboratoriya namunasi erdan (homogenlashtirilgan) o'rtacha namunadan ajratilishi kerak. .

2-guruhning bir hil mahsulotlari (murabbo, murabbo, mayda qalay idishlardagi meva sharbatlari, quyultirilgan sut, quruq sut mahsulotlari va boshqalar) uchun o'rtacha namunaning o'lchamiga (100 dona) mos keladigan qadoqlash birliklari sonida namunalar olinishi kerak. -200 g), agar mahsulot bir xil partiyadan kelgan bo'lsa.

Alohida aflatoksinlarni aniqlash va identifikatsiyalashning kimyoviy usullari ularning ultrabinafsha nurlaridagi o'ziga xos flüoresanligiga (taxminan 365 nm), yupqa qatlamli xromatografiyadagi harakatchanlikdagi farqlarga, ularning yutilish o'ziga xosligi va flüoresans spektrlariga asoslanadi.

Aflatoksinlardan farqli o'laroq, trixotesenlar spektrning ko'rinadigan qismida yutilish yoki floresansga ega emas, bu ularni yupqa qatlamli xromatografiya bilan aniqlashni qiyinlashtiradi. Shu bilan birga, trikoteksenlar rangli yoki lyuminestsent hosilalarni hosil qiluvchi TLC plitalarini maxsus reagentlar bilan davolashga asoslangan usullar yordamida TLC yordamida aniqlanishi mumkin. Masalan, plitalarni qayta ishlashda T -2 toksin; konsentrlangan sulfat kislota UV nurida ko'k floresansi bo'lgan dog'lar hosil qiladi;).

Mikotoksinlarni miqdoriy aniqlashning arbitraj usullari quyidagilardan iborat:

‣‣‣ gaz-suyuqlik xromatografiyasi (T-2 toksini uchun);

‣‣‣ UV fotometrik detektori yordamida yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC) (deoksinivalenol va patulin uchun);

‣‣‣ HPLC floresan detektor yordamida (aflatoksinlar va zearalenon uchun).

Shaklda. 2-rasmda eng oddiy dizayndagi zamonaviy suyuqlik xromatografining qurilmasi ko'rsatilgan.

Tank 1 dan kirish filtri 9 orqali harakatlanuvchi faza yuqori bosimli nasos 2 tomonidan namunani kiritish tizimiga 3 - qo'lda injektor yoki avtomatik namuna oluvchiga etkazib beriladi, bu erda namuna ham kiritiladi. Keyin filtr 8 orqali harakatlanuvchi faza oqimi bo'lgan namuna oldingi ustun orqali ajratish ustuniga 4 kiradi.Keyin kolonnadan chiqib ketadigan va ajratilishi kerak bo'lgan aralashmaning tarkibiy qismlarini o'z ichiga olgan mobil fazaning oqimi (eluatatsiya) detektorga 5 kiradi va to'lib-toshgan idishga chiqariladi 7. Eluat o'lchash detektor halqasidan oqib o'tganda, xromatogramma qayd qilinadi va ma'lumotlar magnitafon 6 yoki kompyuterga uzatiladi.

Suyuq xromatograf qurilmasi (izokratik tizim):

1 - sig'im; 2 - yuqori bosimli tizim; 3 - qo'lda injektor yoki avtomatik namuna; 4 - ajratuvchi ustun; 5 - detektor; b - registrator yoki kompyuter; 7 - drenaj tanki; 8 - filtr; 9 - kirish filtri

Shaklda ko'rsatilgan tizim. 2 izokratik: xromatografiya paytida harakatchan fazaning tarkibi o'zgarmaydi. Agar xromatografik tahlil paytida mobil fazaning bir yoki bir nechta tarkibiy qismlarining kontsentratsiyasini o'zgartirish juda muhim bo'lsa, unda odatda ikki yoki undan ortiq nasoslardan iborat bo'lgan gradient tizimlar qo'llaniladi. Gradientli elyusiya holatida har bir erituvchi alohida idishdan magnit aralashtirgichli maxsus aralashtirish kamerasiga yuboriladi, bu erda ma'lum bir dastur bo'yicha ular ma'lum hajm nisbati bilan aralashtiriladi.

Mikotoksinlarni tahlil qilish uchun gradient tizimlar ko'proq qo'llaniladi, bu erda vaqt o'tishi bilan chiziqli ravishda o'zgarib turadigan konsentratsiyali suvdagi asetonitril eritmalari mobil faza sifatida ishlatiladi.

Xromatografik ustun - 150 dan 250 mm gacha diametrli, ichki diametri 4,6 mm bo'lgan, payvandlangan uglevodorod radikallari bilan silikagel asosidagi maxsus sorbent bilan to'ldirilgan metall naycha. Himoya ustuni xromatografik ustunni ifloslanishdan himoya qilish uchun xizmat qiladi.

UV fotometrik detektori HPLC detektorining eng keng tarqalgan turi hisoblanadi. Detektorning ishlash printsipi an'anaviy spektrofotometrga o'xshaydi: u eritmaning optik zichligini qayd qiladi. Farqi shundaki, UV detektori oqim detektori bo'lib, eritmali kyuvetka o'rniga fotometrik hujayradan foydalanadi. Eluent oqimi ishchi hujayradan oqib o'tadi va sof mobil faza mos yozuvlar hujayradan o'tadi. Yorug'lik manbai simob chiroq bo'lib, u kuchli ultrabinafsha nurlanishini keltirib chiqaradi. Kerakli to'lqin uzunligiga ega yorug'lik mos optik filtrlar yordamida tanlanadi, hujayralar orqali o'tadi, harakatlanuvchi faza molekulalari va ajratiladigan komponentlar tomonidan qisman so'riladi va fotodetektor tomonidan ushlanadi. Eluatning yorug'lik yutilishi (optik zichligi) doimiy ravishda grafik yozuvchisi yoki kompyuter tomonidan qayd etiladi, xromatogramma qayd etiladi. Aralashmaning ajratilgan komponentlari (masalan, mikotoksinlar) xromatogrammada cho'qqilar sifatida taqdim etiladi. Xromatogrammadagi cho'qqi holati moddani aniqlash uchun, tepalik maydoni esa miqdoriy aniqlash uchun ishlatiladi.

Murakkabroq qurilma floresan (ftorimetrik) detektordir.
ref.rf saytida joylashgan
Bunday detektor organik birikmalarning, xususan, aflatoksinlar va zearalenonning ultrabinafsha nurlanishi yoki ko'rinadigan nurlanish ta'sirida floresan qilish qobiliyatidan foydalanadi. Floresan detektori ikkita o'zaro perpendikulyar optik kanalli oqim xujayrasiga ega. Ulardan biri hayajonli nurlanishni ta'minlash uchun xizmat qiladi, ikkinchisi floresan intensivligini o'lchash imkonini beradi. B 1 va M 1 aflatoksinlarini tahlil qilishda qo'zg'alish to'lqin uzunligi 360 nm va chiqarilgan to'lqin uzunligi 420 nm ni tashkil qiladi.

Shuni ta'kidlash kerakki, UV detektori aflatoksinlarni tahlil qilish uchun ham ishlatilishi mumkin, ammo uning sezgirligi florimetrik detektornikidan pastroqdir, shuning uchun aflatoksinlarning past konsentratsiyasini tahlil qilishda flüoresansni aniqlash afzalroqdir. MPC darajasi va undan past).

Mikotoksinlarni aniqlash usullari - tushunchasi va turlari. "Mikotoksinlarni aniqlash usullari" toifasining tasnifi va xususiyatlari 2017, 2018 yil.

GOST 32835-2014

DAVLATlararo STANDART

SHARBA MAHSULOTLARI

Tandem yuqori samarali suyuq xromatografiya-mass-spektrometriya (HPLC-MS/MS) yordamida mikotoksinlarni aniqlash

Sharbat mahsulotlari. Tandem yuqori samarali suyuqlik massa spektrometriyasi (HPLC-MS/MS) yordamida mikotoksinlarni aniqlash

MKS 67.080.01

Kirish sanasi 2016-01-01

Muqaddima

Davlatlararo standartlashtirish bo'yicha ishlarni amalga oshirishning maqsadlari, asosiy tamoyillari va asosiy tartibi GOST 1.0-92 "Davlatlararo standartlashtirish tizimi. Asosiy qoidalar" va GOST 1.2-2009 "Davlatlararo standartlashtirish tizimi. Davlatlararo standartlar, qoidalar va davlatlararo standartlashtirish bo'yicha tavsiyalar". Ishlab chiqish, qabul qilish, qo'llash, yangilash va bekor qilish qoidalari

Standart haqida

1 "Moskva davlat oziq-ovqat ishlab chiqarish universiteti" Oliy kasbiy ta'lim federal davlat ta'lim muassasasi (FGBOU VPO "MGUPP") tomonidan ishlab chiqilgan.

2 Texnik jihatdan tartibga solish va metrologiya bo'yicha Federal agentlik tomonidan joriy etilgan

3 Standartlashtirish, metrologiya va sertifikatlashtirish bo‘yicha Davlatlararo kengash tomonidan qabul qilingan (2014-yil 25-iyundagi 45-2014-son bayonnomasi)

Qabul qilish uchun ovoz berildi:

MK (ISO 3166) 004-97 ga muvofiq mamlakatning qisqa nomi		Milliy standartlar organining qisqartirilgan nomi
Armaniston		Armaniston Respublikasi Iqtisodiyot vazirligi
Belarusiya		Belarus Respublikasi Davlat standarti
Qirg'iziston		Qirg'izistondart
Rossiya		Rosstandart

4 Texnik jihatdan tartibga solish va metrologiya federal agentligining 2014 yil 19 avgustdagi N 896-st buyrug'i bilan 2016 yil 1 yanvardan boshlab Rossiya Federatsiyasining milliy standarti sifatida GOST 32835-2014 kuchga kirdi.

5 Ushbu standart quyidagi xalqaro hujjatlar qoidalarini hisobga olgan holda ishlab chiqilgan:

- CODEX STAN 247-2005* Codex Alimentarius komissiyasining meva sharbatlari va nektarlari uchun umumiy kodeks standarti;
________________
* Matnda keyin keltirilgan xalqaro va xorijiy hujjatlarga kirishni http://shop.cntd.ru sayti havolasini bosish orqali olish mumkin. - Ma'lumotlar bazasi ishlab chiqaruvchisining eslatmasi.


- Evropa Ittifoqi Komissiyasining 23.02.2006 yildagi Nizomi r. yo'q. 406/2006/EC Oziq-ovqat mahsulotlaridagi mikotoksinlar darajasini rasmiy nazorat qilish uchun namuna olish usullari va tahlil usullarini belgilash");

- Evropa meva sharbatlari assotsiatsiyasining meva va sabzavot sharbatlarining sifati va haqiqiyligini baholash bo'yicha AIJN amaliyot kodeksi.

6 BIRINCHI MARTA TAQDIM ETILGAN


Ushbu standartga kiritilgan o'zgartirishlar to'g'risidagi ma'lumotlar "Milliy standartlar" yillik axborot indeksida, o'zgartirish va qo'shimchalar matni esa oylik "Milliy standartlar" axborot indeksida e'lon qilinadi. Ushbu standart qayta ko'rib chiqilgan (almashtirilgan) yoki bekor qilingan taqdirda, tegishli xabarnoma "Milliy standartlar" oylik ma'lumot indeksida e'lon qilinadi. Tegishli ma'lumotlar, bildirishnomalar va matnlar ommaviy axborot tizimida - Internetdagi Texnik tartibga solish va metrologiya federal agentligining rasmiy veb-saytida ham joylashtirilgan.

1 foydalanish sohasi

1 foydalanish sohasi

Ushbu standart meva va sabzavotlardan olingan sharbatlar va boshqa sharbat mahsulotlariga, tsitrus mevalari hujayralari bundan mustasno, qo'llaniladi va o'lchov oralig'ida tandem yuqori samarali suyuq xromatomassa spektrometriyasidan foydalangan holda mikotoksinlarni - patulin va oxratoksin A ni aniqlash usulini belgilaydi. patulinning massa kontsentratsiyasi 0,1 dan 100,0 mkg/dm gacha va oxratoksin A ning 0,1 dan 20,0 mkg/dm gacha.

Izoh Ushbu xalqaro standart sinovdan o'tkazish va uni qo'llash nuqtai nazaridan qo'shimcha ma'lumotlarni to'plash maqsadida qo'llanilishi tavsiya etiladi.

2 Normativ havolalar

Ushbu standart quyidagi davlatlararo standartlarga normativ havolalardan foydalanadi:

GOST 12.1.004-91 Mehnatni muhofaza qilish standartlari tizimi. Yong'in xavfsizligi. Umumiy talablar

GOST 12.1.007-76 Mehnatni muhofaza qilish standartlari tizimi. Tasnifi va umumiy xavfsizlik talablari

GOST 12.1.010-76 Mehnatni muhofaza qilish standartlari tizimi. Portlash xavfsizligi. Umumiy talablar

GOST 12.1.019-79 Mehnatni muhofaza qilish standartlari tizimi. Elektr xavfsizligi. Himoya turlarining umumiy talablari va nomenklaturasi

GOST 61-75 Reaktivlar. Sirka kislotasi. Texnik shartlar

GOST OIML R 76-1-2011 O'lchovlarning bir xilligini ta'minlashning davlat tizimi. Avtomatik bo'lmagan tarozilar. 1-qism. Metrologik va texnik talablar. Testlar

GOST 1770-74 (ISO 1042-83, ISO 4788-80) Laboratoriya shisha idishlarini o'lchash. Shilinglar, stakanlar, kolbalar, probirkalar. Umumiy spetsifikatsiyalar

GOST ISO 3696-2013 Laboratoriya tahlillari uchun suv. Texnik talablar va nazorat qilish usullari

GOST ISO 5725-1-2003 O'lchov usullari va natijalarining aniqligi (to'g'riligi va aniqligi). 1-qism. Asosiy qoidalar va ta'riflar

GOST ISO 5725-2-2003 O'lchov usullari va natijalarining aniqligi (to'g'riligi va aniqligi). 2-qism: Standart o'lchov usulining takrorlanishi va takrorlanishini aniqlashning asosiy usuli

GOST 5789-78 Reaktivlar. Toluol. Texnik shartlar

GOST 16317-87 Maishiy elektr sovutgich asboblari. Umumiy spetsifikatsiyalar

GOST 20015-88 Xloroform. Texnik shartlar

GOST 25336-82 Shisha idishlar va laboratoriya uskunalari. Turlari. Asosiy parametrlar va o'lchamlar

GOST 26313-84 Meva va sabzavotlarning qayta ishlangan mahsulotlari. Qabul qilish qoidalari, namuna olish usullari

GOST 26671-85 Qayta ishlangan meva va sabzavotlar, go'sht va go'sht va sabzavotlar konservalari. Laboratoriya tahliliga namuna tayyorlash

GOST 29030-91 Meva va sabzavotlarning qayta ishlangan mahsulotlari. Eriydigan qattiq moddalarning nisbiy zichligi va tarkibini aniqlashning piknometrik usuli

GOST 29227-91 (ISO 835/1-81) Laboratoriya idishlari. Pipetkalar tugadi. 1-qism. Umumiy talablar

GOST ISO/IEC 17025-2009 Sinov va kalibrlash laboratoriyalarining malakasiga qo'yiladigan umumiy talablar

GOST 32689.1-2014 O'simliklardan olingan oziq-ovqat mahsulotlari. Pestitsidlar qoldiqlarini gaz xromatografik aniqlashning ko'p usullari. 1-qism. Umumiy qoidalar

GOST 32689.2-2014 O'simliklardan olingan oziq-ovqat mahsulotlari. Pestitsidlar qoldiqlarini gaz xromatografik aniqlashning ko'p usullari. 2-qism: Ekstraksiya va tozalash usullari

GOST 32689.3-2014 O'simliklardan olingan oziq-ovqat mahsulotlari. Pestitsidlar qoldiqlarini gaz xromatografik aniqlashning ko'p usullari. 3-qism. Natijalarni aniqlash va tasdiqlash

Eslatma - Ushbu standartdan foydalanganda, ommaviy axborot tizimida - Internetdagi Texnik tartibga solish va metrologiya bo'yicha Federal agentlikning rasmiy veb-saytida yoki yillik "Milliy standartlar" axborot indeksiga muvofiq ma'lumotnoma standartlarining haqiqiyligini tekshirish tavsiya etiladi. , joriy yilning 1 yanvar holatiga e'lon qilingan va joriy yil uchun "Milliy standartlar" oylik axborot indeksi masalalari bo'yicha. Agar mos yozuvlar standarti almashtirilsa (o'zgartirilsa), unda ushbu standartdan foydalanganda siz almashtiriladigan (o'zgartirilgan) standartga amal qilishingiz kerak. Agar havola qilingan standart almashtirilmasdan bekor qilinsa, unga havola berilgan qoida ushbu havolaga ta'sir qilmaydigan darajada qo'llaniladi.

3 Qisqartmalar

HPLC-MS/MS - tandem yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi-mass-spektrometriya;

OTA, oxratoksin A;

PAT - patulin;

ESI- elektr maydonida purkagichning ionlanishi ( Elektrospray ionizatsiyasi);

IARC- Saraton tadqiqotlari bo'yicha xalqaro agentlik;

LOD- aniqlash chegarasi;

LOQ- miqdoriy aniqlash chegarasi;

SRM- selektiv reaktsiyalarni boshqarish rejimida komponentlarni aniqlash ( Tanlangan reaktsiya monitoringi).

4 Usulning mohiyati

Usulning mohiyati suvsiz magniy sulfat ishtirokida asetonitril bilan PAT va OTA mikotoksinlarini oldindan ekstraksiya qilish, konsentratsiya, asetonitrilda qayta eritish va spray ionizatsiyasi bilan HPLC-MS/MS yordamida mikotoksinlarning massa kontsentratsiyasini miqdoriy aniqlashdan iborat. elektr maydonida va selektiv reaktsiyalarni boshqarish rejimida komponentlarni aniqlash.

5 O'lchov asboblari, yordamchi uskunalar, mos yozuvlar materiallari, reagentlar va shisha idishlar

10 dan 3000 atom massa birligi (a.m.u) gacha bo'lgan massa diapazonida o'lchash uchun uch to'rt kutupli massa detektoriga ega bo'lgan HPLC-MS/MS* analitik tizimi, massa o'lchash aniqligi kamida 0,1 a.m.u, elektr maydonida ionlanishning sochilishi, tanlangan reaktsiyalarni nazorat qilish va bola va ota-ona ionlarini skanerlash rejimida ishlash qobiliyati, minimal signal-shovqin nisbati 1000: 1. Analitik tizim mikserli ikkilik nasosdan, 50°C gacha isitish haroratini taʼminlovchi xromatografik ustunli termostatdan va don oʻlchami 5 mkm S boʻlgan teskari fazali sorbentli xromatografik ustundan iborat HPLC modulini oʻz ichiga olishi kerak. , uzunligi 150 mm va ichki diametri 3 mm. Amaldagi tizim 0,1 dan 100,0 mkg/dm oralig'ida mikotoksinlarni aniqlashni ta'minlashi kerak.
________________
* Tavsiya etilgan LC/MS/MS tizimlari haqida qo'shimcha ma'lumot olish uchun A ilovasiga qarang.


0,1% dan ko'p bo'lmagan optik zichlik o'lchovlarida mutlaq xatolik bilan ruxsat etilgan 250 dan 400 nm gacha bo'lgan to'lqin uzunligida sinov o'tkazish imkonini beruvchi o'lchov diapazoniga ega spektrofotometr.

GOST OIML R 76-1 bo'yicha tarozilar, ±0,01 mg dan ortiq bo'lmagan bir marta tortishning ruxsat etilgan mutlaq xatosi chegarasi bilan tortish aniqligini ta'minlaydi.

Ultrasonik vanna.

50 ml sig'imli probirkalar uchun rotor tezligi 4000-5000 rpm bo'lgan santrifüj.

1,5-2,0 ml sig'imli Eppendorf tipidagi probirkalar uchun rotor tezligi 10000-12000 rpm bo'lgan sentrifuga.

200°S gacha bo'lgan haroratni saqlashni ta'minlaydigan quritish shkafi.

GOST 16317 bo'yicha uy muzlatgichi.

Aralash uchun shaker.

Doimiy yoki o'zgaruvchan quvvati 20-1000 mm bo'lgan suyuqlik namunalarini dozalash uchun asboblar, haqiqiy hajmni dozalashda nisbiy xatolik 2,5% dan oshmaydi.

Mikrofiltr - shpritsdagi nozul (regeneratsiya qilingan tsellyuloza, diametri 13 mm, teshik hajmi 0,2-0,4 mikron).

Ish uzunligi 1 sm bo'lgan kvarts kyuvetlari.

PAT va OTA mikotoksinlari asosiy moddaning tarkibi kamida 98% bo'lgan mos yozuvlar namunalari sifatida foydalanish uchun.

GOST 61 bo'yicha muzlik sirka kislotasi, analitik daraja.

Gradient HPLC uchun asetonitril.

Gradient HPLC uchun metanol.

Magniy sulfat suvsiz, kimyoviy jihatdan toza

Kaltsiy xlorid suvsiz, donador, kimyoviy jihatdan toza

GOST 20015 bo'yicha xloroform, kimyoviy jihatdan toza

GOST 5789 bo'yicha toluol, kimyoviy jihatdan toza

Etil spirti, mutlaq.

Laboratoriya tahlillari uchun suv, GOST ISO 3696 bo'yicha tozaligi 1.

GOST 29227 bo'yicha 2-sinfning 1, 2, 5, 10 sm 2 sig'imiga ega 2-chi aniqlik toifasidagi gradusli pipetkalar.

GOST 1770 bo'yicha sig'imi 5, 10, 25, 50, 100 va 1000 sm 2 yoki 2a bo'lgan 2-sinf aniqlikdagi o'lchov kolbalari.

10,25 sm3 sig'imli o'tkir tubi kolbalar.

1,5-2,0 ml sig'imli Eppendorf tipidagi santrifüj trubkasi.

100-400 mm sig'imli mikrotest trubkasi.

GOST 1770 bo'yicha har qanday dizayndagi 25, 50, 250 sm3 hajmdagi 2-sinf aniqlikdagi o'lchash tsilindrlari.

Vintli qopqoqli santrifüj trubkasi, 50 sm

Diametri 125-150 mm bo'lgan chinni chashka.

3 dm sig'imli laboratoriya eksikatori.

GOST 25336 bo'yicha huni laboratoriyasi.

GOST 25336 bo'yicha sig'imi 50, 100, 250 sm3 bo'lgan tekis tubli kolbalar.

GOST 25336 bo'yicha 10, 20, 50, 100 va 200 sm3 hajmli kimyoviy ko'zoynaklar.

Metrologik va texnik tavsiflari bo'yicha yuqoridagilardan kam bo'lmagan va zarur o'lchov aniqligini ta'minlaydigan boshqa o'lchov vositalaridan, yordamchi uskunalardan, idishlardan, shuningdek yuqoridagidan yomonroq bo'lmagan sifatdagi standart namunalar, reagentlar va materiallardan foydalanishga ruxsat beriladi. .

6 Namuna olish

Namuna olish - GOST 26313 bo'yicha. Namunalarni tayyorlash va saqlash - GOST 26671, GOST 32689.1, GOST 32689.2 va GOST 32689.3 bo'yicha.

7 Sinovga tayyorgarlik

7.1 Umumiy talablar

Sinovdan oldin laboratoriya shisha idishlarini oldindan tayyorlash, shuningdek, GOST 32689.1, GOST 32689.2 va GOST 32689.3 talablariga muvofiq reagentlar va yordamchi materiallar sifatini nazorat qilish amalga oshiriladi.

7.2 Yordamchi eritmalar tayyorlash

7.2.1 A mobil fazasini tayyorlash

1000 ml sig'imli o'lchov kolbasiga mahkam yopilgan maydalangan shisha yoki ftoroplastik tiqin bilan 1 ml muzli sirka kislotasi, 100 ml metanol pipetka bilan solinadi va bidistillangan suv bilan belgiga keltiriladi. Aralash yaxshilab aralashtiriladi.

A mobil fazasining saqlash muddati xona haroratida - bir oydan ortiq emas.

7.2.2 B mobil fazasini tayyorlash

1000 ml hajmli, mahkam yopilgan maydalangan shisha yoki floroplastik tiqinli o'lchov kolbasiga 1 ml muzli sirka kislotasi pipetka bilan solinadi va metanol bilan belgiga keltiriladi. Aralash yaxshilab aralashtiriladi.

B mobil fazasining saqlash muddati xona haroratida - bir oydan ortiq emas.

Izoh Mobil faza kauchuk va polimer materiallar bilan aloqa qilmasligi kerak [politetrafloroetilen (PTFE) bundan mustasno].

7.2.3 Erituvchini tayyorlash 1

Tegishli idishda toluolning 99 qismini va muzli sirka kislotasining bir qismini aralashtiring. Aralash yaxshilab aralashtiriladi.

Xona haroratida hal qiluvchi 1 ning saqlash muddati 6 oydan oshmaydi.

7.3 Magniy sulfatni tayyorlash

Ekstraktsiyada sorbent sifatida ishlatiladigan suvsiz magniy sulfat havodan so'rilgan namlikni yo'qotish uchun yaroqlilik muddati davomida quritilishi kerak. Sorbent 180°S - 200°S haroratda 6-10 soat davomida kalsinlanadi va suvsiz kaltsiy xlorid ustidagi eksikatorda saqlanadi. Reagentning yaroqliligi mezoni eritma qizdirilganda qo'shimcha suvli qatlamning yo'qligi hisoblanadi, ekstraktsiya bosqichi 30 ° C - 40 ° S haroratgacha amalga oshiriladi va 2-3 daqiqadan so'ng reaksiya massasi. aralashtiriladi.

7.4 Mikotoksin zaxira eritmalarini tayyorlash

7.4.1 PAT eritmalarini tayyorlash

7.4.1.1 PAT eritmasini tayyorlash, massa konsentratsiyasi 200 mkg/sm

0,01 mg aniqlik bilan tortilgan 2,0 mg sof kristalli PAT dan olinib, hajmi 10 ml bo’lgan o’lchov kolbasida oz miqdorda xloroformda eritiladi va keyin eritma hajmi xloroform bilan belgilangan belgigacha keltiriladi.

Alyuminiy folga bilan mahkam o‘ralgan, maydalangan tiqinli shisha o‘lchov kolbasida 0°C haroratda dastlabki PAT eritmasining yaroqlilik muddati 1 oydan oshmaydi.

7.4.1.2 PAT eritmasini tayyorlash, massa konsentratsiyasi 20 µg/sm

Olingan PAT eritmasidan 1 ml (7.4.1.1 ga qarang) 10 ml o'lchov kolbasiga o'tkazing va belgigacha xloroform bilan suyultiriladi. Eritmadagi PAT ning aniq massa kontsentratsiyasini aniqlash uchun hosil bo'lgan PAT standart eritmasidan 5,0 ml olinadi va taxminan 15 sm sig'imli idishga o'tkaziladi, so'ngra quruq modda olinmaguncha xloroform azotli tozalash orqali chiqariladi. Quruq moddani olgandan so'ng darhol idishga 5,0 ml mutlaq etanol qo'shiladi. PATni to'liq eritib yuboring. Olingan PAT eritmasi optik yo'l uzunligi 1 sm bo'lgan kvarts kyuvetaga kiritiladi, so'ngra eritmaning spektri spektrofotometrda 250 dan 350 nm gacha to'lqin uzunligi diapazonida qayd etiladi, nazorat qilish vositasi sifatida etalon kyuvetada mutlaq etanol ishlatiladi. .

Eritmadagi PAT ning massa konsentratsiyasi, µg/sm, formula bo‘yicha hisoblanadi

bu erda spektrning optik zichligining maksimal qiymati (to'lqin uzunligi taxminan 275 nm), birliklar. OP;

- PAT ning molekulyar og'irligi, 153,1 g/molga teng;

- konvertatsiya koeffitsienti;


- optik yutish (so'nish) ning molyar koeffitsienti, 14600 ga teng, m/mol.

7.4.1.3 100 mkg/sm PAT eritmasini tayyorlash

200 mkg/ml massa kontsentratsiyasi bo'lgan xloroformdagi 5 ml PAT boshlang'ich eritmasi (7.4.1.1-bandga qarang) sig'imi 10 ml bo'lgan o'lchov kolbasiga quyiladi va xona haroratida quruq qoldiq holiga keltiriladi. azot va darhol asetonitrilda eritilib, uni kolbadagi hajmgacha etiketkalarga olib keladi.

7.4.1.4 7.4.1.2 va 7.4.1.3 ga muvofiq PAT eritmalarining yaroqlilik muddati alyuminiy folga bilan mahkam o'ralgan, maydalangan tiqinli shisha o'lchov kolbasida 0 ° C da 24 soatdan oshmaydi.

Ishlatishdan oldin eritmalarning harorati xona haroratiga keltiriladi (tarkibi xona haroratiga yetguncha alyumin folga o'lchov kolbasidan olib tashlanishi mumkin emas). PATning yo'q bo'lib ketishi tufayli mos yozuvlar namunalarini erituvchi olib tashlanganidan keyin olingan quruq moddalarning yupqa plyonkasi shaklida saqlashga yo'l qo'yilmaydi.

7.4.2 OTA stok eritmasini tayyorlash

7.4.2.1 20 mkg/ml OTA eritmasini tayyorlash

0,01 mg aniqlikda tortilgan 2,0 mg sof kristall OTA 1-erituvchi solingan 25 ml li stakanda eritiladi (7.2.3-bandga qarang) va miqdoriy o‘lchami 100 ml hajmli o‘lchov kolbasiga o‘tkaziladi va 1-erituvchi bilan belgigacha suyultiriladi.

Eritmadagi OTA ning aniq massa kontsentratsiyasini aniqlash uchun olingan dastlabki OTA eritmasi optik yo‘l uzunligi 1 sm bo‘lgan kvarts kyuvetaga kiritiladi, so‘ngra eritma spektri spektrofotometrda 300 dan 300 gacha to‘lqin uzunligi oralig‘ida qayd etiladi. 370 nm, hal qiluvchi 1 dan mos yozuvlar kyuvetasi sifatida foydalanish.

Dastlabki eritmadagi OTA ning massa konsentratsiyasi, mkg/sm formula bo‘yicha hisoblanadi

bu erda spektrning optik zichligining maksimal qiymati (to'lqin uzunligi taxminan 333 nm), birliklar. OP;

- OTA ning molekulyar og'irligi, 402,7 g / molga teng;

- konvertatsiya koeffitsienti;

- A ilovasiga muvofiq aniqlangan tuzatish koeffitsienti;

- optik yutilish (so'nish) ning molyar koeffitsienti, 544 ga teng, m/mol.

Alyuminiy folga bilan mahkam o'ralgan tiqinli shisha o'lchov kolbasida minus 18 ° C haroratda dastlabki OTA eritmasining yaroqlilik muddati to'rt yildan oshmaydi.

7.4.2.2 5 µg/ml OTA eritmasini tayyorlash

2,5 ml OTA eritmasidan oling (7.4.2.1), 10 ml hajmli o'lchov kolbasiga o'tkazing va erituvchi 1 (7.2.3) bilan belgigacha suyultiriladi.

Alyuminiy folga bilan mahkam o‘ralgan, maydalangan tiqinli shisha o‘lchov kolbasida 4°C haroratda OTA eritmasining yaroqlilik muddati 24 soatdan oshmaydi.

Ishlatishdan oldin eritmaning harorati xona haroratiga keltiriladi (tarkibi xona haroratiga yetguncha o'lchov kolbasidan alyuminiy folga olib tashlashga yo'l qo'yilmaydi) -.

7.5 PAT va OTA kalibrlash eritmalarini tayyorlash

PAT va OTA kalibrlash eritmalari ularning biriktiruvchi eritmalarining ma'lum hajmlarini (7.4.1.1 va 7.4.2.1 ga qarang) aniqlanishi kerak bo'lgan tahlil qiluvchi moddalarni o'z ichiga olmaydi, aniqlangan olma sharbati bilan aralashtirish orqali tayyorlanadi.

7.5.1 PAT kalibrlash eritmalarini tayyorlash

7.5.1.1 PAT massa konsentratsiyasi 1000 ng/sm (eritma) oraliq eritmasini tayyorlash n-1)

1 ml PAT eritmasi (7.4.1.3-bandga qarang) yoki 1 ml PAT tarkibidagi standart namunasi 100 mkg/sm PAT massa kontsentratsiyasi 100 ml hajmli o'lchov kolbasiga quyiladi. eritma asetonitril bilan belgiga moslashtiriladi.

7.5.1.2 PAT massasi konsentratsiyasi 10 ng/sm (eritma) oraliq eritmasini tayyorlash n-2)

1 ml -1 eritmasidan (7.5.1.1 ga qarang) 100 ml hajmli o'lchov kolbasiga soling va asetonitril bilan belgigacha suyultiriladi.

7.5.1.3 PAT kalibrlash eritmalarini tayyorlash

Oraliq eritmalarning ma'lum hajmlari 1-jadvalga muvofiq tanlangan n-1 va n-2 (7.5.1.1 va 7.5.1.2 ga qarang) va 10 ml hajmli o'lchov kolbalariga soling.


1-jadval - Eritmalarning hajmlari n-1 va n PAT kalibrlash eritmalarini tayyorlash uchun -2

Ko'rsatkich nomi	Kalibrlash yechimlari
Eritma hajmi n-2 sm
Eritma hajmi n-1 sm
AOK qilingan PAT miqdori, ng
Eritmadagi PAT ning massa konsentratsiyasi, ng/sm

7.5.2 OTA kalibrlash eritmalarini tayyorlash

7.5.2.1 200 ng/ml OTA oraliq eritmasini tayyorlash (eritma A-1)

1 ml 5 mkg/ml OTA eritmasidan (7.4.2.2-bandga qarang) xona haroratida azot oqimi ostida quriting va darhol asetonitril bilan 25 ml hajmli o'lchov kolbasiga o'tkazing.

7.5.2.2 10 ng/ml OTA oraliq eritmasini tayyorlash (eritma LEKIN-2)

0,5 ml OTA oraliq eritmasi LEKIN-1 (7.5.2.1 ga qarang) 10 ml hajmli o'lchov kolbasiga o'tkaziladi va asetonitril bilan belgigacha suyultiriladi.

7.5.2.3 OTA kalibrlash eritmalarini tayyorlash

Oraliq eritmalarning ma'lum hajmlari 2-jadvalga muvofiq tanlangan LEKIN-1 va LEKIN-2 (7.5.2.1 va 7.5.2.2 ga qarang) va 10 ml hajmli o'lchov kolbalariga soling.


2-jadval - Eritmalarning hajmlari LEKIN-1 va LEKIN OTA kalibrlash eritmalarini tayyorlash uchun -2

Ko'rsatkich nomi	Kalibrlash yechimlari
Eritma hajmi LEKIN-2 sm
Eritma hajmi LEKIN-1 sm
Boshqariladigan OTA miqdori, ng
Eritmadagi OTA ning massa konsentratsiyasi, ng/sm

Kolbalardagi eritma hajmini tiniqlangan olma (yoki boshqa filtrlangan) sharbati bilan belgiga keltiring.

HPLC-MS/MS da sinash uchun tizimga 7.5.1.3 va 7.5.2.3 ga muvofiq tayyorlangan 10 mm PAT va OTA kalibrlash eritmalari yuboriladi va 8.3.1 shartlarini hisobga olgan holda 7.7 ga muvofiq kalibrlanadi.

Kalibrlash eritmasining saqlash muddati 0 ° C - 4 ° S haroratda, maydalangan tiqin bilan qoplangan shisha o'lchov kolbasida 24 soatdan oshmaydi.

7.6 LC/MS/MS tizimini tayyorlash

HPLC-MS/MS tizimini o'lchovlarga tayyorlash foydalanish bo'yicha qo'llanma (yo'riqnoma) va B ilovasida keltirilgan ma'lumotlarga muvofiq amalga oshiriladi.

Mass-spektrometrning ish rejimlarini sozlashda B ilovada keltirilgan mikotoksinlarni aniqlash uchun MS/MS parametrlaridan foydalanish tavsiya etiladi.

Bunday holda, quyidagi shartlar bajarilishi kerak:

- atrof-muhit harorati 20 ° S dan 25 ° S gacha;

- atmosfera bosimi 84 dan 106 kPa gacha;

- tarmoqdagi kuchlanish (220±10) V;

- tarmoqdagi oqim chastotasi 49 dan 51 Gts gacha;

- havoning nisbiy namligi 40% dan 80% gacha.

7.7 HPLC-MS/MS tizimini kalibrlash

7.5 ga muvofiq sharbatlardagi mikotoksinlar eritmalari bilan tizimni kalibrlash HPLC-MS/MS tizimi uchun foydalanish qo'llanmasiga (yo'riqnomasiga) muvofiq va oyda bir marta 8.3.1 ga muvofiq shartlarni hisobga olgan holda amalga oshiriladi. PAT va OTA ning eng yuqori joylari xromatogrammalarda aniqlanadi va 7.5 ga muvofiq kontsentratsiya oralig'idagi eng yuqori hududdan kalibrlash bog'liqligi o'rnatiladi. Korrelyatsiya koeffitsientini va kalibrlash eritmalarini tayyorlash tartibiga muvofiq har bir kalibrlash nuqtasida mikotoksinlarning massa kontsentratsiyasining hisoblangan qiymatlarining haqiqiy qiymatdan og'ishini hisoblang (7.5 ga qarang). Agar korrelyatsiya koeffitsienti kamida 0,999 (PAT uchun) va 0,965 (OTA uchun) bo'lsa va massa konsentratsiyasining hisoblangan qiymatining haqiqiy qiymatdan nisbiy og'ishi ±10% dan ko'p bo'lmasa, kalibrlash maqbul hisoblanadi.

Nisbiy og'ish o'rniga, kalibrlash xarakteristikasining qabul qilinishi 5% dan oshmasligi kerak bo'lgan nisbiy standart og'ish bilan baholanishi mumkin.

8 Sinov

8.1 Ekstraksiya

10 ml () oldindan yaxshilab aralashtirilgan sharbat mahsuloti sig’imi 50 ml bo’lgan vintli qopqoqli sentrifuga naychasiga solinadi, probirkaga 20 ml atsetonitril va 15 g suvsiz magniy sulfat qo’shiladi. Aralash qo'lda yoki shaker bilan uch-besh daqiqa davomida intensiv ravishda aralashtiriladi. Aralashtirgandan so'ng olingan ekstrakt xona haroratida 4000-5000 aylanish tezligida 10 daqiqa yoki 5 ° C haroratda sovutilgan sentrifuga ishtirokida 5 minut sentrifugalanadi. Santrifüjdan keyin ekstraktning umumiy hajmini o'lchang (). Pipetka yoki dozalash moslamasi bilan olingan 18-19 sm () ekstrakt 25 sm sig'imli 1 sm () atsetonitrilli o'tkir tubli kolbaga o'tkaziladi.

Idishning devorlarida erimaydigan karamel plyonkasi bo'lsa, u ultratovushli hammomda uch-besh daqiqa davomida yo'q qilinadi. Eritma sig'imi 1,5-2,0 sm3 bo'lgan Eppendorf tipidagi probirkaga o'tkaziladi va 10000-12000 aylanish tezligida 3-5 minut sentrifuga qilinadi. Yuqori qatlam olinadi va gözenek hajmi 0,2-0,4 mkm bo'lgan mikrofiltr orqali to'g'ridan-to'g'ri 100-400 mm sig'imli mikronaychaga filtrlanadi. HPLC-MS/MS testi uchun tayyorlangan namunadan 10 mm tizimga AOK qilinadi.

8.2 Konsentrlangan mahsulotlardan namuna tayyorlash

Konsentrlangan sharbatlar (pyuresi) ma'lum bir turdagi sharbat mahsuloti uchun normativ hujjatlarda nazarda tutilgan eruvchan qattiq moddalarning minimal darajasigacha suv bilan qayta tiklanadi. Eriydigan qattiq moddalarning minimal darajalari ta'minlanmagan konsentrlangan sharbat mahsulotlari bidistillangan suv bilan eriydigan qattiq moddalar miqdori 11,2% gacha tiklanadi. Eriydigan qattiq moddalarning tarkibi GOST 29030 bo'yicha nazorat qilinadi.

Qayta tiklangan namunalarni olish 8.1 ga muvofiq amalga oshiriladi.

8.3 O'lchovlarni olish

8.3.1 Umumiy shartlar

8.1 ga muvofiq tayyorlangan namunalar va kalibrlash eritmalari tanlangan ketma-ketlikda AOK qilinadi. Eng keng tarqalgan usul kalibrlash eritmalarini in'ektsiya qilish bir qator namunali in'ektsiyalarni boshlash va tugatishdir.

HPLC-MS/MS tizimi sozlanishi kerak SRM tahlil qilingan mikotoksinlarni tanlab aniqlashni ta'minlovchi o'tishlar bilan. Saqlash vaqtlari va eng yuqori hududlar HPLC-MS/MS tizimiga biriktirilgan tahlil natijalarini yozib olish va hisoblash uchun tahlil dasturi yordamida aniqlanadi. HPLC/MS/MS tizimlari, ajratish shartlari va massa spektrometrik aniqlash misollari B ilovasida keltirilgan.

Namunalar GOST ISO 5725-1 (3.14-kichik bo'lim) va GOST ISO 5725-2 ga muvofiq ikkita parallel aniqlash uchun takroriylik sharoitida sinovdan o'tkaziladi.

8.3.2 Mikotoksinlarni aniqlash

Mikotoksinlarni aniqlash uchun namuna eritmalaridan olingan saqlash vaqtlari kalibrlash eritmalaridan mos keladigan mikotoksinlarni saqlash vaqtlari bilan solishtiriladi. Mikotoksinlar mavjudligini tasdiqlash uchun birinchi va ikkinchi signal intensivligi nisbati o'rtasida taqqoslash amalga oshiriladi. m/z-kalibrlash eritmalaridan mikotoksin signallarining intensivlik nisbati bilan o'tish.

Bitta mikotoksin uchun cho'qqilarning nisbati signal intensivligining kutilgan nisbatidan 20% dan ko'proq farq qilmasligi kerak.

9 Sinov natijalarini qayta ishlash va taqdim etish

9.1 Miqdorni aniqlash

Tayyorlangan ekstraktning AOK qilingan hajmida mikotoksinlar miqdorini aniqlash (8.1-bandga qarang) mikotoksin cho'qqisi maydonini (yoki balandligini) ushbu mikotoksin uchun mos keladigan kalibrlash xarakteristikasi bilan solishtirish orqali amalga oshiriladi.

Sinov qilingan mahsulotlardagi mikotoksinlarning massa kontsentratsiyasi, mkg/dm, formula bo'yicha hisoblanadi.

kub santimetrdan kub dekimetrga aylantirish koeffitsienti qayerda;

- HPLC-MS/MS tizimiga kiritilgan 10 mm ekstrakt hajmidagi mikotoksin kontsentratsiyasi, kalibrlash bog'liqligi bilan aniqlanadi, ng;

konsentratsiyadan keyin ekstrakt qayta erigan atsetonitrilning hajmi, sm;

- konsentratsiya uchun hajmi olinadigan ekstraktning umumiy hajmi, sm;

- xromatografga kiritilgan namuna hajmi (=10 mm), mm;

- sinash uchun olingan sharbat mahsulotlari namunasi hajmi, sm;

- konsentratsiya uchun tanlangan ekstrakt hajmi, qarang

Konsentrlangan sharbat mahsulotlarida mikotoksinlar miqdorini hisoblashda 8.2-bandga muvofiq suv bilan suyultirish darajasi hisobga olinadi.

O'lchov natijasi, agar qabul qilish sharti bajarilgan bo'lsa, uchta parallel aniqlash natijalarining o'rtacha arifmetik qiymati sifatida qabul qilinadi.

bu yerda , - parallel aniqlashning uchta natijasidan maksimal va minimal qiymatlar, mkg/dm;

, , - uchta parallel aniqlash natijalari, µg/dm;

- kritik diapazonning qiymati, %.

Xuddi shu laboratoriyada amalga oshirilgan uchta parallel aniqlashlar (o'rtacha qiymatning ulushi sifatida) o'rtasidagi tafovut, ehtimollik = 0,95 bo'lgan 3,6· ga teng takrorlanuvchanlik (konvergentsiya) chegarasidan oshmasligi kerak. Agar bu shart bajarilsa, yakuniy o'lchov natijasi uchta parallel aniqlashning o'rtacha arifmetik qiymati sifatida qabul qilinadi, uchinchi kasrgacha yaxlitlanadi.

O'lchov natijalari GOST ISO / IEC 17025 ga muvofiq protokolda qayd etiladi.

9.2 Agar olingan natija mikotoksin miqdori kalibrlash bog'liqligi diapazonining yuqori chegarasidan oshib ketganligini ko'rsatsa, uning suv bilan suyultirilishini oshirib, yangi namuna tayyorlang va qayta o'lchang.

10 Metrologik xarakteristikalar

PAT va OTA uchun metodning metrologik tavsiflari 3-jadvalda keltirilgan shartlarga mos keladi.


3-jadval - HPLC-MS/MS usuli aniqliklari

O'lchov diapazoni, µg/dm	Takrorlanishning nisbiy standart og'ishi, %	Qayta ishlab chiqarishning nisbiy standart og'ishi, %
PATni aniqlashda (ortiq emas)
OTA ni aniqlashda (ortiq emas)

Sharbat mahsulotlari namunalarida PAT va OTA ni aniqlash chegaralari: LOD- 0,03 mkg/dm, LOQ- 0,1 mkg / dm.

11 O'lchov natijalari sifatini nazorat qilish

Laboratoriyada o'lchov natijalarining sifatini nazorat qilish oraliq aniqlikning standart og'ishining barqarorligini tekshirish yordamida o'lchov natijalarining barqarorligini kuzatishni o'z ichiga oladi. Barqarorlik testi Shewhartning nazorat jadvallari yordamida amalga oshiriladi. Amalga oshirilgan o'lchovlar natijalarining barqarorligini nazorat qilish chastotasi sifat tizimining ichki hujjatlarida tartibga solinadi. Nazorat natijalari qoniqarsiz bo'lsa, masalan, harakat chegarasidan oshib ketganda yoki ogohlantirish chegarasi muntazam ravishda oshib ketganda, ushbu og'ishlarning sabablari, shu jumladan reaktivlarni almashtirish, operatorning ishini tekshirish aniqlanadi.
GOST 12.1.007.

DIQQAT! Mikotoksinlar bilan ishlashda PAT va OTA aniq nefrotoksik, immunotoksik, teratogen va genotoksik ta'sirga ega kuchli toksik xususiyatlarga ega ekanligini hisobga olish kerak. Tasniflash bo'yicha IARC OTA odamlar uchun potentsial xavfli kanserogenlarga ishora qiladi (2B guruhi). Mikotoksinlar bilan ishlashda ko'proq xavfsizlik choralariga rioya qilish kerak. Laboratoriya xodimlari himoya kiyimlarini, shu jumladan yuz qalqoni, qo'lqop va ko'zoynak taqishlari kerak. Mikotoksinlar bilan barcha operatsiyalar tutun qopqog'ida amalga oshiriladi. Ish tugagandan so'ng, ishlatilgan laboratoriya idishlari va chiqindilari zararsizlantiriladi.

A ilova (majburiy). Spektrofotometrni tekshirish va standart eritmalardagi mikotoksinlarning massa kontsentratsiyasini hisoblash uchun CF tuzatish koeffitsientini aniqlash

A ilova
(majburiy)

Spektrofotometrni tekshirish va standart eritmalardagi mikotoksinlarning massa kontsentratsiyasini hisoblash uchun tuzatish koeffitsientini aniqlash

A.1 Stok eritmalaridagi mikotoksinlarning massa kontsentratsiyasini aniqlash uchun (7.4.1.1 va 7.4.2.1 ga qarang) to'lqin uzunligi diapazonida 1 sm optik yo'l uzunligi bo'lgan kvarts kyuvetada eritmalarning optik zichligini o'lchash uchun mos spektrofotometrdan foydalaning. 200 nm dan 400 nm gacha.

Spektrofotometrni kalibrlash quyidagicha amalga oshiriladi.

Kaliy dixromatning (KCrO) sulfat kislotadagi (HSO) uchta eritmasining optik zichligini o'lchang - 0,25; 0,125 va 0,0625 mmol / dm maksimal assimilyatsiya nuqtasida (to'lqin uzunligi taxminan 350 nm), nazorat sifatida 0,009 mmol / dm konsentratsiyali sulfat kislota (HSO) eritmasidan foydalaniladi.

Keyin formula bo'yicha kaliy dixromatning har bir konsentratsiyasi uchun optik zichlikning molyar koeffitsientining qiymati m/mol hisoblanadi.

bu yerda sulfat kislotadagi kaliy dixromat eritmasining tegishli konsentratsiyadagi optik zichligining o‘lchangan qiymati, birlik. OP;

- kaliy dixromat eritmasining sulfat kislotadagi konsentratsiyasi, mmol/dm.

Agar uchta o'lchangan qiymat orasidagi farq optik zichlikni o'lchash aniqligining kafolatlangan diapazonidan tashqarida bo'lsa, kalibrlash tartibi yoki uskunani tekshirish kerak. O'rtacha arifmetik qiymatni hisoblang.

Formula bo'yicha aniq jihozlar (spektrofotometr va kyuvet) uchun tuzatish koeffitsientini (o'lchamsiz qiymat) aniqlang.

bu yerda kaliy dixromati (KCrO) eritmalari uchun molyar optik zichlik koeffitsientining xarakteristik qiymati, m/mol;

- (A.1) formula bo'yicha hisoblangan optik zichlikning molyar koeffitsienti, m/mol.

Olingan tuzatish omil qiymati 0,95 dan kam yoki 1,05 dan ortiq bo'lsa, u holda kalibrlash tartibi yoki uskunalar og'ishlarni bartaraf etish uchun tekshirilishi kerak (kyuvetlar bir xil to'plami kalibrlash va tozaligi uchun ishlatiladi) -.

Qo'shimcha B (ma'lumot). Sharbatlar va boshqa sharbat mahsulotlarida mikotoksinlarni aniqlash uchun HPLC-MS/MS tizimlariga misollar*

B ilova
(ma'lumotnoma)

________________
* Ushbu misollar tavsiya etilgan va ushbu xalqaro standart foydalanuvchilariga qulaylik yaratish uchun berilgan.

B.1 HPLC-MS/MS tizimi № 1

Uskuna platformasi: Varian 320-MS LC/MS/MS.

Ionik