» , » En gen ett enzym

En gen, ett enzym

         92
Publiceringsdatum: 24 juli 2018

    

En-gen-ett-enzym-hypotesen är idén som lades fram i början av 1940-talet att varje gen kontrollerar syntesen eller aktiviteten av ett enzym. Konceptet, som kombinerar områdena genetik och biokemi, föreslogs av den amerikanske genetikern George Wells Beadle och den amerikanske biokemisten Edward L. Tatum, som forskat om Neurospora crassa. Deras experiment involverade att först avbilda formen till mutationsinducerande röntgenstrålar och sedan odla den i ett minimalt tillväxtmedium som endast innehöll de nödvändiga näringsämnena som behövs för att vildtypsstammen ska överleva. De fann att mutanta mögelstammar kräver tillsats av vissa aminosyror för att växa. Med hjälp av denna information kunde forskarna koppla mutationer i specifika gener till störningen av enskilda enzymer i de metaboliska vägarna som normalt skulle producera de saknade aminosyrorna. Det är nu känt att inte alla gener kodar för ett enzym och att vissa enzymer är sammansatta av flera korta polypeptider som kodas av två eller flera gener.

Genexpressionär den process genom vilken ärftlig information från en gen omvandlas till en funktionell produkt - RNA eller protein. Genuttryck kan regleras i alla stadier av processen: under transkription, under translation och vid post-translationella modifieringar av proteiner.

Genuttryck är substratet för evolutionär förändring.

Reglering av genuttryck på transkriptionsnivån i prokaryoter:

Reglering av transkription i celler utförs på nivån av individuella gener, deras block och till och med hela kromosomer. Förmågan att kontrollera många gener säkerställs som regel genom närvaron av gemensamma regulatoriska nukleotidsekvenser i dem, med vilka transkriptionsfaktorer av samma typ interagerar. Som svar på verkan av specifika effektorer förvärvar sådana faktorer förmågan att binda med hög precision till regulatoriska gensekvenser. Konsekvensen av detta är försvagningen eller förstärkningen av transkriptionen av motsvarande gener. De tre huvudsakliga transkriptionsstegen som används av bakterieceller för att reglera RNA-syntes är initiering, förlängning och avslutning.

Eukaryot genuttryck skiljer sig från det för prokaryoter:

1) Eukaryoter har tre typer av RNA-polymeraser: RNA-polymeras1 katalyserar transkriptionen av ribosomala gener. RNA-polymeras2 katalyserar transkriptionen av alla strukturella gener. RNA-polymeras3 katalyserar transkriptionen av tRNA och 5S-ribosomalt RNA (katalyserar bildningen av mRNA som endast finns i eukaryoter).

2) Promotorregionen i eukaryoter är längre.

3) I eukaryoter representeras vilken gen som helst av alternerande kodande och icke-kodande sekvenser. Kodning - exoner, icke-kodande - introner.

4) Eukaryoter har förstärkare som känns igen av proteiner. De kan placeras ganska långt från början av transkriptionen. Förstärkaren och dess associerade protein närmar sig RNA-polymeras-DNA-bindningsstället.

5) Det finns "ljuddämpare" som undertrycker transkription.

En gen, ett enzym hypotes, antyder att varje gen kan koda endast för en polypeptidkedja, som i sin tur kan inkluderas som en subenhet i ett mer komplext proteinkomplex. Teorin lades fram av G. Beadle och E. Tatum 1941 på grundval av en genetisk och biokemisk analys av neurosporen, fann de att under experimentella förhållanden, under påverkan av olika mutationer, endast en av någon kedja av biokemiska reaktioner stängdes av varje gång. Tvivel om den absoluta giltigheten av denna teori dök upp i samband med upptäckten av systemet "två gener - en polypeptid", såväl som med förekomsten av överlappande gener. Ur funktionell synvinkel är denna teori villkorad i samband med upptäckten av multifunktionella proteiner.

Mönster av cellexistens i tiden. Cellulär (livs)cykel. apoptos och nekros. Mitotisk (proliferativ) cykel. Viktiga händelser i den mitotiska cykeln. Reproduktiva (interfas) och separations (mitos) faser av den mitotiska cykeln. Problem med cellproliferation inom medicin.

cellcykeln- detta är den period då en cell existerar från det att den bildas genom att dela modercellen till dess egen delning eller död.

En viktig komponent i cellcykeln är mitotisk cykel- ett komplex av inbördes relaterade och samordnade i tiden händelser som inträffar i processen att förbereda en cell för delning och under själva divisionen. Dessutom inkluderar livscykeln den period då cellen presterar de specifika funktionerna hos en flercellig organism, såväl som viloperioder. Under viloperioder bestäms inte cellens omedelbara öde: den kan antingen börja förbereda sig för mitos eller börja specialisera sig i en viss funktionell riktning.

Varaktigheten av den mitotiska cykeln för de flesta celler är från 10 till 50 h. Den biologiska betydelsen av den mitotiska cykeln är att den säkerställer kontinuiteten av kromosomerna i ett antal cellgenerationer, bildandet av celler som är ekvivalenta i volym och innehåll av ärftlig information. Således är cykeln en allmän mekanism för reproduktion av den cellulära organisationen av den eukaryota typen i individuell utveckling.

bestå i reduplicering (självfördubbling) av modercellens ärftliga material och i en enhetlig fördelning av detta material mellan dottercellerna. Enligt de två viktigaste händelserna i den mitotiska cykeln i den allokera reproduktions- och separationsfaserna som motsvarar interfasen och mitosen i klassisk cytologi.

apoptos- programmerad celldöd, en reglerad självdestruktionsprocess på cellnivå, som ett resultat av vilken cellen fragmenteras till separata apoptotiska kroppar, begränsade av plasmamembranet. Fragment av en död cell fagocyteras vanligtvis mycket snabbt av makrofager eller närliggande celler, vilket går förbi utvecklingen av en inflammatorisk reaktion. Processen med apoptos varar 1-3 timmar. En av huvudfunktionerna för apoptos är förstörelsen av defekta (skadade, muterade, infekterade) celler.

Nekros- en patologisk process, uttryckt i lokal vävnadsdöd i en levande organism till följd av exogen eller endogen skada. Nekros visar sig i svullnad, denaturering och koagulering av cytoplasmatiska proteiner, förstörelse av cellorganeller och slutligen av hela cellen. De vanligaste orsakerna till nekrotisk vävnadsskada är: upphörande av blodtillförseln och exponering för patogena produkter av bakterier eller virus.

30. Mitotisk cykel. De viktigaste händelserna i interfasperioderna. Innehållet och betydelsen av mitosfaserna. Den biologiska betydelsen av mitos.

Mitotisk(proliferativ)cykel - ett komplex av sammanhängande och koordinerade händelser som inträffar i processen att förbereda en cell för delning och under själva delning. Dessutom inkluderar livscykeln cellutförandeperiod flercellig organism specifika funktioner samt vilande perioder. Under viloperioder bestäms inte cellens omedelbara öde: den kan antingen börja förbereda sig för mitos eller börja specialisera sig i en viss funktionell riktning. Varaktigheten av den mitotiska cykeln för de flesta celler är från 10 till 50 timmar.

Den biologiska betydelsen av den mitotiska cykelnär att det säkerställer kontinuiteten hos kromosomerna i ett antal cellgenerationer, bildandet av celler som är likvärdiga i volym och innehåll av ärftlig information. Således är cykeln en allmän mekanism för reproduktion av den cellulära organisationen av den eukaryota typen i individuell utveckling.

Viktiga händelser i den mitotiska cykelnär i reduplicering(självfördubbling) av modercellens ärftliga material och i jämn fördelning av detta material mellan dotterceller. Dessa händelser åtföljs av regelbundna förändringar i den kemiska och morfologiska organisationen kromosomer - kärnstrukturer, i vilka mer än 90% av det genetiska materialet i en eukaryot cell är koncentrerat (huvuddelen av en djurcells extranukleära DNA är belägen i mitokondrier).

Kromosomer, i samverkan med extrakromosomala mekanismer, tillhandahåller: a) lagring av genetisk information, b) användning av denna information för att skapa och upprätthålla cellulär organisation, c) reglering av läsning av ärftlig information, d) fördubbling (självkopiering) av genetisk material, e) dess överföring från modercellen till dottern.

Cellförändringar i den mitotiska cykeln.

Enligt de två huvudhändelserna i den mitotiska cykeln särskiljs den reproduktiv och delning faser motsvarande interfas och mitos klassisk cytologi (Fig. 2.11).

I det inledande segmentet av interfasen ( postmitotisk, presyntetisk, eller Gi-period) funktionerna i organisationen av interfascellen återställs, bildandet av nukleolen, som började i telofasen, är avslutad. En betydande (upp till 90%) mängd protein kommer in i kärnan från cytoplasman. I cytoplasman, parallellt med omorganisationen av ultrastrukturen, intensifieras proteinsyntesen. Detta bidrar till tillväxten av cellmassa. Om dottercellen måste gå in i nästa mitotiska cykel blir synteserna riktade: kemiska prekursorer till DNA bildas, enzymer som katalyserar DNA-redupliceringsreaktionen och ett protein syntetiseras som startar denna reaktion. Således utförs processerna för att förbereda nästa period av interfasen - den syntetiska -.

PÅ syntetisk eller S-period mängden ärftligt material i cellen fördubblas. Den består i divergensen av DNA-spiralen i två kedjor, följt av syntesen av en komplementär kedja nära var och en av dem. Resultatet är två identiska spolar. DNA-molekyler som är komplementära till moderns molekyler bildas i separata fragment längs kromosomens längd, dessutom icke-samtidigt (asynkront) i olika delar av samma kromosom, såväl som i olika kromosomer. Sedan paket (replikeringsenheter - repliker) av det nybildade DNA:t "tvärbinds" till en makromolekyl.

Tidsintervallet från slutet av syntesperioden till början av mitosen tar postsyntetisk(premitotisk), eller G 2 - punkt mellanfaser. Det kännetecknas av intensiv syntes av RNA och speciellt protein. Fördubblingen av cytoplasmans massa är fullbordad i jämförelse med början av interfasen. Detta är nödvändigt för att cellen ska gå in i mitos.

Upptäcktena av exon-intronorganisationen av eukaryota gener och möjligheten till alternativ splitsning har visat att samma nukleotidsekvens i det primära transkriptet kan tillhandahålla syntesen av flera polypeptidkedjor med olika funktioner eller deras modifierade analoger. Till exempel innehåller jästmitokondrier box- (eller cob)-genen som kodar för cytokrom b respiratoriskt enzym. Den kan existera i två former: Den "långa" genen, som består av 6400 bp, har 6 exoner med en total längd på 1155 bp. och 5 introner. Den korta formen av genen består av 3300 bp. och har 2 introner. Det är faktiskt en "lång" gen som saknar de tre första intronerna. Båda formerna av genen är lika väl uttryckta.

Efter avlägsnandet av det första intronet av den "långa" boxgenen, baserat på den kombinerade nukleotidsekvensen för de två första exonerna och en del av nukleotiderna i den andra intronen, bildas en mall för ett oberoende protein, RNA-maturas (Fig. 3,43). Funktionen av RNA-maturas är att tillhandahålla nästa steg av splitsning - avlägsnandet av det andra intronet från det primära transkriptet och, slutligen, bildandet av en mall för cytokrom b.

Ett annat exempel är en förändring i splitsningsmönstret för det primära transkriptet som kodar för strukturen av antikroppsmolekyler i lymfocyter. Membranformen av antikroppar har en lång "svans" av aminosyror vid C-terminalen, vilket säkerställer fixeringen av proteinet på membranet. Den utsöndrade formen av antikroppar har inte en sådan svans, vilket förklaras av avlägsnandet av nukleotider som kodar för denna region från det primära transkriptet under splitsning.

I virus och bakterier har en situation beskrivits där en gen samtidigt kan vara en del av en annan gen, eller någon DNA-nukleotidsekvens kan vara en del av två olika överlappande gener. Till exempel, på den fysiska kartan över fagen FX174-genomet (Fig. 3.44), kan det ses att B-gensekvensen är belägen inuti A-genen och E-genen är en del av D-gensekvensen. organiseringen av faggenomet lyckades förklara den befintliga diskrepansen mellan dess relativt lilla storlek (den består av 5386 nukleotider) och antalet aminosyrarester i alla syntetiserade proteiner, vilket överstiger det teoretiskt tillåtna för en given genomkapacitet. Möjligheten att sätta ihop olika peptidkedjor på mRNA syntetiserat från överlappande gener (A och B eller E och D) säkerställs genom närvaron av ribosomala bindningsställen i detta mRNA. Detta tillåter translation av en annan peptid att utgå från en ny referenspunkt.

Nukleotidsekvensen för B-genen är också en del av A-genen, och E-genen är en del av D-genen.

I λ-faggenomet hittades också överlappande gener, translaterade både med en ramförskjutning och i samma läsram. Det antas också att två olika mRNA kan transkriberas från båda komplementära strängarna i samma DNA-region. Detta kräver närvaron av promotorregioner som bestämmer rörelsen av RNA-polymeras i olika riktningar längs DNA-molekylen.

De beskrivna situationerna, som vittnar om tillåtligheten av att läsa olika information från samma DNA-sekvens, tyder på att överlappande gener är ett ganska vanligt inslag i organisationen av genomet hos virus och möjligen prokaryoter. I eukaryoter tillåter gendiskontinuitet också syntes av olika peptider baserade på samma DNA-sekvens.

Med allt detta i åtanke är det nödvändigt att ändra definitionen av en gen. Uppenbarligen kan man inte längre tala om en gen som en kontinuerlig sekvens av DNA som unikt kodar för ett specifikt protein. Tydligen bör formeln "En gen - en polypeptid" fortfarande anses vara den mest acceptabla för närvarande, även om vissa författare föreslår att man ändrar den: "En polypeptid - en gen." I vilket fall som helst bör termen gen förstås som en funktionell enhet av ärftligt material, som till sin kemiska natur är en polynukleotid och bestämmer möjligheten att syntetisera en polypeptidkedja, tRNA eller rRNA.

En gen ett enzym.

År 1940 använde J. Beadle och Edward Tatum ett nytt tillvägagångssätt för att studera hur gener ger metabolism i ett mer bekvämt forskningsobjekt - den mikroskopiska svampen Neurospora crassa .. De fick mutationer där; det fanns ingen aktivitet av ett eller annat metaboliskt enzym. Och detta ledde till att den muterade svampen inte kunde syntetisera en viss metabolit själv (till exempel aminosyran leucin) och bara kunde leva när leucin tillsattes i näringsmediet. Teorin "en gen - ett enzym" formulerad av J. Beadle och E. Tatum fick snabbt ett stort erkännande bland genetiker, och de tilldelades själva Nobelpriset.

Metoder. urval av de så kallade "biokemiska mutationerna" som leder till störningar av verkan av enzymer som tillhandahåller olika metaboliska vägar, visade sig vara mycket fruktbart inte bara för vetenskapen utan också för praktiken. Först ledde de till uppkomsten av genetik och selektion av industriella mikroorganismer, och sedan till den mikrobiologiska industrin, som använder stammar av mikroorganismer som överproducerar så strategiskt viktiga ämnen som antibiotika, vitaminer, aminosyror, etc. Principerna för selektion och genteknik. av stammar av överproducenter är baserade på föreställningen att "en gen kodar för ett enzym". Och även om denna idé är utmärkt praxis ger flera miljoner dollar vinster och räddar miljontals liv (antibiotika) - det är inte slutgiltigt. En gen är inte bara ett enzym.

"

1. En gen är en del av en DNA-molekyl, som är en funktionell enhet av ärftlig information.

1. Genen upptar ett visst område i kromosomen - lokuset.

2. Rekombination kan ske inom en gen.

3. DNA, som är en del av genen, kan repareras.

4. Det finns gener: strukturella, reglerande osv.

5. Arrangemanget av tripletter är komplementärt till aminosyror (mutationer med en läsramsförskjutning).

6. Genotypen, som är diskret (bestående av individuella gener), fungerar som en helhet.

7. Den genetiska koden är universell.

8. Den genetiska koden är degenererad (för många aminosyror finns det mer än ett kodon - plats)

9. Generna är ordnade i linjär ordning på kromosomen och bildar en kopplingsgrupp. Antalet kopplingsgrupper motsvarar den haploida uppsättningen kromosomer (23 hos människor eller 24 med en reservation för kön - x- och y-kromosomer).

Strukturen av proteiner bestäms av mängden och ordningen av aminosyror i deras peptidkedjor. Det är denna sekvens av aminosyror i peptider som krypteras i DNA-molekyler med hjälp av den genetiska koden.

Egenskaper för den genetiska koden:

1. Trippelitet- varje aminosyra kodas av tre intilliggande nukleotider.
2. Degeneration- många aminosyror är krypterade med flera tripletter.
3. Specificitet- varje triplett kan koda endast för en viss aminosyra.
4. Mångsidighet- Full överensstämmelse med koden för olika arter av levande organismer.
5. Kontinuitet- nukleotidsekvenser läses trippel för trippel utan luckor.
6. Icke-överlappande kodoner- närliggande trillingar överlappar inte varandra.

20. Ribosomal cykel av proteinsyntes (initiering, förlängning, avslutning). Posttranslationella transformationer av proteiner.

Ärftlig information som registreras med den genetiska koden lagras i DNA-molekyler, men den deltar inte direkt i cellens liv. Rollen som en mellanhand, vars funktion är att översätta den ärftliga information som finns lagrad i DNA till en fungerande form, spelas av RNA. Processen för interaktion mellan mRNA och tRNA, som säkerställer översättningen av information från nukleotidernas språk till aminosyrornas språk, utförs på ribosomer. Ribosomala RNA är inte bara en strukturell komponent i ribosomer, utan säkerställer också deras bindning till en specifik mRNA-nukleotidsekvens. Detta etablerar starten och läsramen under bildningen av peptidkedjan. Dessutom ger de interaktion mellan ribosomen och tRNA. Ribosomer har 2 spår. En av dem håller den växande polypeptidkedjan, den andra mRNA. Dessutom isoleras 2 tRNA-bindningsställen i ribosomer. Aminoacyl-tRNA är beläget i aminoacyl, A-stället, som bär en specifik aminosyra. I peptidyl, P-sektionen, är tRNA vanligtvis lokaliserat. Bildandet av A- och P-ställen tillhandahålls av båda underenheterna av ribosomen. Translation kan delas in i tre faser: initiering, förlängning och avslutning.

Initieringsfas består i att kombinera två underpartiklar av ribosomen som tidigare separerades i cytoplasman vid ett visst mRNA-ställe och fästa det första aminoacyl-tRNA:t till det. Detta anger också ramen för att läsa information som finns i mRNA.

förlängningsfas eller förlängning av peptiden, inkluderar alla reaktioner från ögonblicket för bildandet av den första peptidbindningen till vidhäftningen av den sista amk. Det är en cykliskt återkommande händelse där det finns en specifik igenkänning av nästa kodon aminoacyl-tRNA som finns i A-stället, komplementärt till länken mellan antikodonet och kodonet. Uppsägningsfas eller fullbordandet av polypeptidsyntes, är associerat med igenkännandet av ett av termineringskodonen (UAA, UAG, UGA) av ett specifikt ribosomalt protein när det kommer in i zonen för ribosomens A-ställe. I detta fall fästs vatten till den sista amc i peptidkedjan och dess karboxylände separeras från tRNA:t. Som ett resultat förlorar den färdiga peptidkedjan sin förbindelse med ribosomen, som bryts upp i två subpartiklar.

Posttranslationell transformation av proteiner. Peptidkedjorna som syntetiseras under translation, på basis av sin primära struktur, förvärvar en sekundär och tertiär, och många en kvartär organisation som bildas av flera peptidkedjor. Beroende på funktionerna som utförs av proteiner kan deras aminosyrasekvenser genomgå olika transformationer och bilda funktionellt aktiva proteinmolekyler. Många membranproteiner syntetiseras som pre-proteiner med en ledarsekvens vid N-terminalen som ger dem membranigenkänning. Sekretoriska proteiner har också en ledarsekvens vid N-terminalen som säkerställer deras transport över membranet. Vissa proteiner omedelbart efter translation bär ytterligare aminosyrapro-sekvenser som bestämmer stabiliteten hos aktiva proteinprekursorer. Under proteinmognaden tas de bort, vilket möjliggör övergången av det inaktiva proproteinet till det aktiva proteinet. Genom att bilda en tertiär och kvartär organisation under posttranslationella transformationer, förvärvar proteiner förmågan att aktivt fungera, inkluderas i vissa cellulära strukturer och utför enzymatiska och andra funktioner.

Relationen mellan en gen och en egenskap. Hypotesen "en gen - ett enzym", dess moderna tolkning: "en gen - en polypeptidkedja"

Gen - en del av en DNA-molekyl som bär information om strukturen hos en polypeptidkedja eller makromolekyl. En kromosoms gener är linjärt arrangerade och bildar en länkgrupp. DNA i kromosomen har olika funktioner. Generna är små till storleken, även om de består av tusentals baspar. Närvaron av en gen fastställs genom manifestationen av genens egenskap (slutprodukt).

För Mendel är genen bara en symbol som är lämplig för att definiera arvslagen. Förhållandet mellan en gen och en egenskap (produkt) upptäcktes när man studerade fermentering i en luftlös miljö - 1902 Garrod. Han studerade stamtavlor för patienter med alkaptonuri, kom till slutsatsen att sjukdomen är resultatet av en kränkning av kvävemetabolism, medan. Istället för urea bildas ett mörkt ämne. Med hjälp av Bats 1908 föreslogs att sjukdomen uppstår hos recessiva homozygoter som saknar någon form av enzymatisk reaktion, vilket leder till ackumulering och utsöndring av substratet, som normalt borde ha delats. Människoblod innehåller homogentisinsyra, men normalt bryts den ned av homogentisinsyraoxidas till maleinacetat, sedan till vatten och koldioxid. Patienter har inte oxidas, så syra ackumuleras och utsöndras i urinen.

Albinism är också ärftligt, även om det är mycket vanligare. I denna sjukdom finns det inget enzym som omvandlar tyrosin till melanin.

Fram till 1940 var forskarnas åsikt delad, men det fanns ingen teori. 1940 - Beadle och Tatum hypotes: 1 gen - 1 enzym. E den hypotesen spelade en viktig roll - forskare började överväga slutprodukterna. Det visade sig att hypotesen har begränsningar, eftersom Alla enzymer är proteiner, men inte alla proteiner är enzymer. Som regel är proteiner oligomerer - d.v.s. existerar i en kvartär struktur. Till exempel har en tobaksmosaikkapsel över 1200 polypeptider. För närvarande är den mest acceptabla hypotesen "En gen - en polypeptid". Termen gen ska förstås som en funktionell enhet av ärftlighet, som till sin kemiska natur är en polynukleotid och bestämmer möjligheten att syntetisera en polypeptidkedja.

Gen som en enhet av variabilitet. Genmutationer och deras klassificering. Orsaker och mekanismer för genmutationer. Konsekvenser av genmutationer.

En gen är en elementär enhet av ärftligt material. Genmutationer associerad med en förändring i den inre strukturen hos gener, som förvandlar en allel till en annan.

Förändringar i strukturen hos det DNA som bildar genen kan delas in i 3 grupper.

4.2.1. En gen, ett enzym hypotes

Första forskningen. Efter att Garrod 1902 påpekat sambandet mellan en genetisk defekt i alkaptonuri med kroppens oförmåga att bryta ner homogentisinsyra, var det viktigt att klargöra den specifika mekanismen bakom denna störning. Sedan dess var det redan känt att metabola reaktioner katalyseras av enzymer, man kan anta att det var kränkningen av något enzym som leder till alkaptonuri. En sådan hypotes diskuterades av Driesch (1896). Det uttrycktes också av Haldane (1920, se) och Garrod (1923). Viktiga stadier i utvecklingen av biokemisk genetik var Kuhns och Butenandts arbete med studiet av ögonfärgen hos kvarnmalen. Ephesia kuhniella och liknande studier av Beadle och Ephrussi on Drosophila(1936). I dessa banbrytande arbeten valdes insektsmutanter som tidigare studerats med genetiska metoder ut för att belysa geners verkningsmekanismer. Detta tillvägagångssätt ledde dock inte till framgång. Problemet visade sig vara för komplicerat, och för att lösa det var det nödvändigt:

1) välj en enkel modellorganism lämplig för experimentell studie;

2) att leta efter den genetiska grunden för biokemiska egenskaper, och inte den biokemiska grunden för genetiskt bestämda egenskaper. Båda villkoren uppfylldes av Beadle och Tatum 1941 (se även Beadle 1945).

Beadle och Tatum modell. Deras artikel började så här:

”Från fysiologisk genetiks synvinkel kan en organisms utveckling och funktion reduceras till ett komplext system av kemiska reaktioner som på något sätt styrs av gener. Det är ganska logiskt att anta att dessa gener ... antingen själva fungerar som enzymer eller bestämmer deras specificitet. Det är känt att genetiska fysiologer vanligtvis försöker undersöka de fysiologiska och biokemiska grunderna för redan kända ärftliga egenskaper. Detta tillvägagångssätt gjorde det möjligt att fastställa att många biokemiska reaktioner styrs av specifika gener. Sådana studier har visat att enzymer och gener har samma specificitetsordning. Omfattningen av detta tillvägagångssätt är dock begränsad. Den allvarligaste begränsningen är att i detta fall ärftliga egenskaper som inte har en dödlig effekt och därför är förknippade med reaktioner som inte är särskilt viktiga för organismens liv, faller inom forskarnas synfält. Den andra svårigheten ... är att det traditionella förhållningssättet till problemet involverar användningen av yttre manifesta tecken. Många av dem är morfologiska variationer baserade på system av biokemiska reaktioner så komplexa att deras analys är extremt svår.

Dessa överväganden ledde oss till följande slutsats. Studiet av det allmänna problemet med genetisk kontroll av biokemiska reaktioner som bestämmer utveckling och metabolism bör utföras med hjälp av förfarande motsatt det allmänt accepterade: istället för att försöka ta reda på den kemiska grunden för kända ärftliga egenskaper är det nödvändigt att fastställa om gener styr kända biokemiska reaktioner och hur de gör det. Ascomycete-neurosporen har de egenskaper som gör det möjligt att implementera detta tillvägagångssätt och fungerar samtidigt som ett bekvämt objekt för genetiska studier. Det är därför vårt program byggdes på användningen av just denna organism. Vi utgick från det faktum att röntgenexponering orsakar mutationer i de gener som styr vissa kemiska reaktioner. Antag att för att överleva i en given miljö måste organismen utföra någon form av kemisk reaktion, då kommer en mutant som berövats en sådan förmåga att visa sig vara olämplig under dessa förhållanden. Men den kan bibehållas och studeras om den odlas i ett medium till vilket den livsviktiga produkten av en genetiskt blockerad reaktion har lagts till."

4 Generernas verkan 9

Ris. 4.1. Schema för experimentet för detektering av biokemiska mutanter av neurosporer På ett komplett medium stör mutationer inducerade av röntgenstrålar eller ultraviolett inte svampens tillväxt. Mutanten växer dock inte på minimalt medium. När vitaminer tillsätts i det minimala mediet återställs tillväxten När aminosyror tillsätts sker ingen tillväxt Baserat på dessa data kan man anta att mutationen har skett i genen som styr metabolismen av vitaminet. Nästa steg är att identifiera vitaminet som kan återställa normal funktion Det genetiska blocket hittades bland reaktionerna av vitaminbiosyntesen.

Därefter beskriver Beadle och Tatum experimentets design (Figur 4.1). Sammansättningen av det kompletta mediet inkluderade agar, oorganiska salter, maltextrakt, jästextrakt och glukos. Det minimala mediet innehöll endast agar, salter, biotin och en kolkälla. De mutanter som växte på det kompletta mediet och inte växte på det minimala mediet studerades i största detalj. För att etablera föreningen, vars syntes var försämrad i var och en av mutanterna, sattes individuella komponenter av det fullständiga mediet till den minimala agaren.

På detta sätt isolerades stammar som inte kunde syntetisera vissa tillväxtfaktorer: pyridoxin, tiamin och para-aminobensoesyra. Dessa defekter har visat sig bero på mutationer vid specifika loci. Arbetet markerade början på många studier på neurosporer, bakterier och jästsvampar, där en överensstämmelse etablerades mellan de "genetiska blocken" som ansvarar för individuella metaboliska steg och specifika enzymrubbningar. Detta tillvägagångssätt har snabbt utvecklats till ett verktyg för forskare att avslöja metabola vägar.

Hypotesen "en gen - ett enzym" har fått stark experimentell bekräftelse. Som arbetet under de efterföljande decennierna visade visade det sig vara förvånansvärt fruktbart. Analysen av defekta enzymer och deras normala varianter gjorde det snart möjligt att identifiera en klass av genetiska störningar som ledde till en förändring i enzymets funktion, även om själva proteinet fortfarande var detekterbart och bibehöll immunologiska egenskaper. I andra fall ändrades enzymaktivitetens temperaturoptimum. Vissa varianter kan förklaras av en mutation som påverkar den allmänna regleringsmekanismen och som ett resultat ändrar aktiviteten hos en hel grupp enzymer. Sådana studier ledde till skapandet av begreppet reglering av genaktivitet i bakterier, vilket inkluderade begreppet operon.

10 4. Genernas verkan

De första exemplen på enzymatiska störningar hos människor. Den första ärftliga mänskliga sjukdomen för vilken en enzymatisk störning kunde påvisas var methemoglobinemi med ett recessivt nedärvningssätt (Gibson och Harrison, 1947; Gibson, 1948) (25080). I detta fall är det skadade enzymet NADH - beroende methemoglobinreduktas. Det första försöket att systematiskt studera en grupp mänskliga sjukdomar associerade med metabola defekter gjordes 1951. I en studie av glykogenlagringssjukdomen visade Corys att i åtta av tio fall av det patologiska tillståndet som diagnostiserades som Gierkes sjukdom (23220) var strukturen av leverglykogen en normal variant, och i två fall var den tydligt störd . Det var också uppenbart att leverglykogen, som ackumuleras i överskott, inte direkt kunde omvandlas till socker, eftersom patienter tenderar till hypoglykemi. Många enzymer behövs för att bryta ner glykogen till glukos i levern. Två av dem, amyl-1,6-glukosidas och glukos-6-fosfatas, valdes ut för studier som möjliga defekta element i enzymsystemet. Fosfatfrisättning från glukos-6-fosfat mättes i leverhomogenat vid olika pH-värden. Resultaten presenteras i fig. 4.2. I en normal lever fann man hög aktivitet med ett optimum vid pH 6-7. Allvarlig leverdysfunktion vid cirros korrelerade med en lätt minskning av aktiviteten. Å andra sidan, vid Gierkes sjukdom med dödlig utgång, kunde enzymets aktivitet inte alls detekteras; samma resultat erhölls vid undersökningen av den andra liknande patienten. Hos två patienter med mindre allvarliga symtom var det en signifikant minskning av aktiviteten.

Man drog slutsatsen att det i dessa fall av Gierkes sjukdom med dödlig utgång fanns en defekt i glukos-6-fosfatas. I de flesta av de mildare fallen var aktiviteten av detta enzym dock inte lägre än vid levercirros, och endast hos två patienter var den något lägre (fig. 4.2).

Enligt Corey-makarna kan den onormala ackumuleringen av glykogen i muskelvävnad inte associeras med brist på glukos-6-fosfatas, eftersom detta enzym saknas i musklerna och är normalt. Som en möjlig förklaring till muskelglykogenos föreslog de ett brott mot aktiviteten av amylo-1,6-glukosidas. Denna förutsägelse bekräftades snart: Forbes upptäckte en sådan defekt i ett av de kliniskt signifikanta fallen av glykogenlagringssjukdom som involverade hjärtat och skelettmusklerna. Nu vi

4. Generernas verkan 11

ett stort antal enzymatiska defekter är kända vid glykogenlagringssjukdom.

Även om de olika formerna av denna sjukdom varierar något i grad av manifestation, finns det mycket gemensamt mellan dem kliniskt. Med ett undantag ärvs de alla på ett autosomalt recessivt sätt. Om enzymatiska defekter inte hade avslöjats, skulle patologin för glykogenackumulering betraktas som en enda sjukdom med karakteristiska intrafamiliella korrelationer i svårighetsgrad, symtomdetaljer och tidpunkt för döden. Sålunda har vi ett exempel där genetisk heterogenitet, som endast kunde antas på basis av studien av fenotypen (avsnitt 3.3.5), bekräftades genom analys på biokemisk nivå: studiet av enzymatisk aktivitet gjorde det möjligt att identifiera specifika gener.

Under de följande åren ökade takten i forskningen om enzymatiska defekter, och för de 588 identifierade recessiva autosomala generna som McKusick beskriver i den sjätte upplagan av sin bok Mendelian Inheritance in Man (1983) hittades specifika enzymatiska störningar i mer än 170 fall. Våra framsteg på detta område är direkt relaterade till utvecklingen av begreppen och metoderna för molekylär genetik.

Några stadier av studiet av enzymatiska störningar hos människor. Vi presenterar bara de viktigaste milstolparna i denna pågående process: 1934 Völling upptäckte fenylketonuri

1941 Beadle och Tatum formulerade en-gen-ett-enzym-hypotesen 1948 beskrev Gibson det första fallet av en enzymatisk störning i en mänsklig sjukdom (recessiv methemoglobinemi)

1952 Corys upptäckte glukos-6-fosfatasbrist vid Gierkes sjukdom

1953 Jervis demonstrerade frånvaron av fenylalaninhydroxylas i fenylketonuri. Bickel rapporterade det första försöket att lindra en enzymatisk störning genom att anta en diet med låg fenylalaninhalt.

1955 Smithies utvecklade stärkelsegelelektroforestekniken

1956 Carson et al upptäckte en defekt i glukos-6-fosfatdehydrogenas (G6PD) i ett fall av inducerad hemolytisk anemi

1957 Kalkar et al beskrev enzymbrist i galaktosemi, vilket visade att människor och bakterier har en identisk enzymatisk störning

1961 demonstrerade Krut och Weinberg en enzymdefekt i galaktosemi in vitro i odlade fibroblaster

1967 upptäckte Sigmiller et al. en hypoxantin-guanin-fosforibosyltransferas (HPRT) defekt i Lesch-Nyhans syndrom

1968 Cleaver beskrev kränkning av excisional reparation i xeroderma pigmentosa

1970 identifierade Neufeld enzymatiska defekter i mukopolysackaridoser, vilket gjorde det möjligt att identifiera vägarna för nedbrytning av mukopolysackarider

Brown och Goldstein 1974 visade att den genetiskt bestämda överproduktionen av hydroximetylglutaryl-CoA-reduktas vid familjär hyperkolesterolemi beror på en defekt i den membranplacerade lipoproteinreceptorn med låg densitet, som modulerar aktiviteten av detta enzym (HMG)

1977 Sly et al visade att mannos-6-fosfat (som en komponent i lysosomala enzymer) känns igen av fibroblastreceptorer. En genetisk defekt i bearbetningen förhindrar bindningen av lysosomala enzymer, vilket resulterar i försämrad frisättning till cytoplasman och efterföljande utsöndring i plasma (I-cellssjukdom)

12 4. Genernas verkan

1980 Vid pseudohypoparatyreoidism upptäcktes en defekt i proteinet som tillhandahåller kopplingen av receptorn och cyklasen.